Name: 급성 이식 - 대 - 호스트 질병의 생체의 유효성을 검사에 대한 높은 처리량 순차적 엘리사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 급성 이식대숙주병의 다중 혈장 바이오마커를 검증하는 고처리량 순차 ELISA 방법을. 소량 샘플로 동결/융해 주기를 최소화하여 효율적인 분석이 가능합니다.

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NIH 보조금 RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622,​​ Hartwell 재단, 그리고 도리스 듀크 자선 재단 지원. 박사 Paczesny은 에릭 Hartwell 기금과 에이미 Strelzer Manasevit 연구 프로그램의 수사관이다.

1. 실험 일 0 : IL-2Rα, REG3α과 HGF에 대한 캡처 항체와 샘플 준비 및 엘리사 테스트 플레이트 코팅 <ol><li> 분석 할 플라즈마 나누어지는 샘플은 해동과 플라즈마의 상단에있는 아래쪽과 지질의 혈전을 분리하는 10 분에 12,000 rpm으로 불렀고, 당겨 될 것입니다. undiluted 플라즈마의 150 μl는 미리 정의 된지도에 따라 수동으로 pipetting하여 (소스 판) 96 - 웰 V-바닥 판에 각 샘플에서 도금 될 것입니다. aliquots는 parafilm으로 포장 전체 과정에서 4 ° C에서 습한 챔버에 보관되며 더 이상보다 72 시간. </li><li> IL-2Rα 및 HGF 캡처 항체는 재구성 및 제조업체 사양 및 50 μl 당 희석 한 후 밀봉과 4에서 하룻밤 incubated 아르 각각 96도 높은 구속력을 반 잘 플레이트의 각 잘 ° C.에 도금 할 수 또한, 많은 플레이트는 37 ° C에서 건조 ° C 나중에 사용하기 위해, 의존 4에 저장할 수 있습니다단백질의 안정성에 들죠. </li><li> REG3α 캡처 항체 그런 다음 밀봉과 4에서 하룻밤 incubated하는 384 잘 Nunc 맥시 - Sorp 판의 각 잘 ° C.에 도금 될 것 제조업체 코팅 버퍼 25 μl를 사용하여 제조업체 프로토콜에 따라 희석 될 것입니다 </li></ol> 2. 실험 1 일 : IL-2Rα 엘리사 (그림 1) <ol><li> IL-2Rα 테스트 판은 세척 TBS에서 곤드레 만드레 취한로 차단하고, 표준 재구성되어 8 포인트 표준 곡선은 제조업체 프로토콜에 따라 준비가되어 있습니다. </li><li> 차단 단계에 따라 판을 세척 한 후, undiluted 플라즈마의 50 μl는 소스 판에서 엘리사 테스트 판에 중복으로 도금되어 있으며 각 표준의 50 μl가 중복으로 도금되어 있습니다. 판 300 rpm으로 설정 판 회선 근에 밀봉하고 상온에서 2 시간에 incubated 수 있습니다. </li><li> 플라즈마는 IL-2Rα 엘리사 시험 접시에서 복원 및 해제에 다시 배치됩니다플라즈마 소스 판을 희석. 엘리사는 제조업체 프로토콜 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨) 및 450-570 nm의에 판 리더 집합을 사용하여 읽을 수 각도의 광학 밀도에 따라 완료하고, 데이터를 저장하고 분석합니다. </li></ol> 3. 실험 1 일 : REG3α 엘리사 (그림 1) <ol><li> undiluted 플라즈마의 10 μl는 별도의 V-아래 소스 판로 전송됩니다. 제조업체에서 제공 희석 버퍼의 90 μl은 1시 10분 희석 소스 판을 만드는 각 잘에 추가됩니다. </li><li> REG3α 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 수행됩니다 (볼륨 384 잘 접시에 따라 조정)과 각도의 광학 밀도는 450-620 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수되며, 데이터 저장 및 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 실험 1 일 : Elafin 및 캡처 항체와 TNFR1 테스트 플레이트 코팅 <ol><li> Elafin 및 TNFR1 캡처 항체는 재구성 및 dil 될 것입니다제조업체 사양 및 50 μl 당 uted 후 봉인하고 Elafin 동안 실온에서 하룻밤 incubated 아르 각각 96도 높은 구속력을 반 잘 플레이트의 각 잘에 도금 및 ° C 4에 TNFR1에 대한 것입니다. </li></ol> 5. 실험 일 1-2 : HGF 엘리사 (그림 1) <ol><li> IL-2Rα 엘리사를 완료하고 시험을 보장 한 후 반복 할 필요가 없습니다, undiluted 플라즈마의 60 μl는 새로운 소스 판에 전송하고 다음 1 개 PBS에 1 % BSA의 60 μl은을 각 잘에 추가됩니다 1시 2분 희석 플라즈마 소스 판. </li><li> HGF 테스트 판은 세척 TBS에서 곤드레 만드레 취한로 차단하고, 표준 재구성되어 8 포인트 표준 곡선은 제조업체 프로토콜에 따라 준비가되어 있습니다. </li><li> 차단 단계에 따라 판을 세척 한 후, 1시 2분 희석 플라즈마의 50 μl은 엘리사 테스트 판에 중복으로 도금되어 있으며 각 표준의 50 μl가 중복으로 도금되어 있습니다. 플레이트는 봉인되고300 RPM으로 설정 판 회선 근에 실온에서 하룻밤 incubated. </li><li> 1시 2분 희석 플라즈마는 HGF 엘리사 테스트 판에서 복원하고 1시 2분 희석 플라즈마 소스 판에 다시 배치됩니다. 엘리사는 제조업체 프로토콜 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨) 및 450-570 nm의에 판 리더 집합을 사용하여 읽을 수 각도의 광학 밀도에 따라 완료하고, 데이터를 저장하고 분석합니다. </li></ol> 6. 실험 2 일 : Elafin 엘리사 <ol><li> undiluted 플라즈마의 10 μl는 새로운 소스 판으로 전송됩니다 후 1 개 PBS에 1 % BSA의 190 μl는 플라즈마 dluted 1시 20분 200 μl를 각 잘에 추가됩니다. </li><li> Elafin 엘리사는 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수 제조업체 프로토콜 (볼륨이있는 반 잘 접시에 따라 조정), 그리고 각도의 광학 밀도에 따라 수행하고, 데이터를 저장하고 분석했다. </li></ol> 7. 실험 다Y 2 : TNFR1 엘리사 <ol><li> PBS에 1 % BSA의 25 μl가 1시 25분 희석 플라즈마의 125 μl를 얻을 수 1시 20분 소스 판 (현재 1시 20분 플라즈마의 100 μl를 포함)에 추가됩니다. </li><li> TNFR1 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 완료 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨 포함)과 각도의 광학 밀도는 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수 있으며, 데이터 저장 및 분석. </li></ol> 8. 실험 2 일 : IL-8 엘리사 <ol><li> 1시 2분 희석 플라즈마의 60 μl는 새로운 소스 판에 전송하고 다음 IL-8 희석제 180 μl은 1시 6분 희석 플라즈마 소스 판을 각 잘에 추가됩니다. </li><li> IL-8은 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 완료 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨 포함)과 각도의 광학 밀도가 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수되며, 데이터 저장 및 분석. </li></ol> 모든 ELISAs은 unuse에게 완료되면D 주식 플라즈마 해동 aliquots로 대체하고 나중에 사용하기 위해 냉동 될 것입니다.

<ol><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li>
<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12(2010).</li>
<li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li>
<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li>
<li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li>
<li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li>
<li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li>
<li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines%3A+the+sequential+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li>
<li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

<html> 여기에 제시된 순서 엘리사 방법은 마우스 9,10에서 얻은 희귀 한 질병 또는 플라즈마 샘플과 인간의 과목에서 샘플로 바꾸어 놓을 수없는 취득 및 / 또는하기 어려울 수도 플라즈마의 작은 볼륨에 여러 혈장 단백질의 측정 할 수 있습니다. 연속 ELISAs는 일반적으로 필요로하는 ELISAs으로 증가 플라즈마 희석 계수의 순서로 수행 플라즈마 희석 ≥ 일반적으로 원하는 경우이 작업을 수행 할 수 있지만, 복원 할 필요가 없습니다 1시 10분 않고 있습니다. 연속 엘리사을 수행 할 수있는 능력은 플라즈마 다른 시약과 혼합되어 있거나하는 다른 희석 버퍼가 플라즈마에 필요한되는 엘리사 키트 / 프로토콜에 의해 제한되며이 다시 사용할 수있는 샘플로 인해 해당 호환되지 않는 문제에 ablility을 precludes 버퍼 / 시약은 특정 테스트의 성능에 영향을 것입니다. 신중한 계획을 통해 10 명 이상 ELISAs은 같은 플라즈마 샘플에서 수행 할 수 있습니다. 다닐 &quot;&gt; 개인 실험실 시험 과목에서 샘플에 대한 관심의 단백질의 예상 플라즈마 농도에 따라 interpretable 결과를하기 위해 플라즈마 dilutions을 조정해야 할 수도 있습니다. 실험실 장비의 차이는 부화와 colorimetric 개발을 최적화 할 필요가 될 수 있습니다 시간, 세차의 수 및 / 또는 세탁은 특정 엘리사을 최적화하기 위해 시간을 즐겨보십시오. 높은 처리량 용량과 정확성을 향상하고 비용 효율적인 방식으로 분석을 수행하기 위해 384 잘 접시에 분석 및 스태킹 장치와 자동 플레이트 와셔 할 수있는 로봇 액체 처리 플랫폼의 사용을 권장합니다. 이 장비는 여러 사용자에 의해 수행 분석의 정확성과 정밀도를 향상, 간 및 간 분석 편차를 줄이기 위해 분석의 일관성을 제공하는 데 도움이됩니다. 1)의 대부분을 : 우리는 두 가지 이유에 사용할 멀티 플랫폼을 통해 순차적 엘리사를 사용소설 단백질에 대한 항체 쌍 쉽게 구슬 또는 기타 자료에 복합뿐만 아니라 시간이 많이 걸릴 비싼 수 없습니다, 2) 각 엘리사의 assays 간 반응성 11 부재에 보조 멀티 플렉스 microarray 또는 구슬,보다 더 정확한 있습니다. 신뢰할 수있는 방법은 멀티 플렉스, 구슬 기반 microarrays를 수행하기 위해 설립되어있는 경우,이 순서 엘리사 과정을 대체 할 수 수 있지만, 구슬 및 /에 항체를 결합한 할 수있는 능력이나 할 원하는 단백질의 수에 의해 제한 될 수 있습니다 분석했다.

급성 이식 - 대 - 호스트 질환 (GVHD), allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 후 비 재발 사망률 (NRM)의 주요 원인은 3 장기 시스템의 장애에 의해 측정된다 : 피부, 간, 위장 (GI) 기관 4. 급성 GVHD는 일반적으로 두 사람 사이와 팔주 이식 후 발생하지만 나중에 발생할 수 있으며, 종종 조절 처방 독성, 감염이나 약물의 부작용 등의 사후 HSCT 합병증의 임상 구분할 수 있습니다. 연속 엘리사를 사용하여 proteomic 전략과 높은 처리량 검증의 사용을 통해, 우리는 누구의 농도 GVHD의 임상 발현의 발병에 수치가 올라 6 단백질을 확인했습니다. 4 biomarker 패널로 결합 IL-2Rα, TNFR1, HGF와 IL-8은 임상 증상의 발병에 GVHD 진단 할 수 있으며 독립적으로 GVHD 심각도 1 포스트 HSCT 생존을 예측할 수 있습니다. Elafin, SK의 GVHD를위한 biomarker에서, 약물 폭발과 같은 다른 원인에서 GVHD 발진과 발진을 구별 할 수 있으며 이식 생존 2 예측할 수 있습니다. 우리는 최근에 낮은 위장관의 GVHD의 biomarker로 REG3α 확인했습니다, 표적 장기는 대부분의 NRM과 관련된. 플라즈마 REG3α 농도가 안정적 후 HSCT 설사의 원인으로 GVHD 파악하고 진단 장 biopsies에 GVHD의 histologic 정도 상관 관계를 할 수 있습니다. GI GVHD의 발병에 REG3α 농도는 GVHD 치료와 NRM 3 응답을 예측 할 수 있습니다. 임상 치료에 이러한 검증 GVHD 생체의 결합은 현재 임상 시험에서 조사되고있다. 이 실험은 바꾸어 놓을 수없는 제한된 수량의 아르 GVHD 발병시 2000 년과 2010 사이에 HSCT를받은 환자에서 수집 한 작은 플라즈마 aliquots에서 수행되었다. 이 샘플의 고귀한 특성으로 인해, 우리는 만난을 개발했습니다초과 동결 - 해동 사이클, 해동 시간과 플라즈마의 사용을 제거 할 수있는 효율적 재현 방식으로 여러 혈장 단백질의 농도를 측정 석탄 통. 이 기술은 (들)은 다른 시약과 혼합 할 필요가 없습니다 샘플을 제공 같은 샘플에서 여러 단백질 / 관심 크린 시토 킨에 대한 ELISAs을 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 엘리사 키트는 사전 코팅 플레이트, 96도 반 잘 플레이트 또는 384 잘 접시와 함께 제공되지 않을 경우 자세한 샘플 / 시약의 사용을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 GVHD 생체 측정의 기술적 측면에 초점을 맞추고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 인간 IL-2 R 알파 Duoset </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 HGF Duoset </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 IL-8 OptEIA KIT II </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> AB-검색 조립 인간 PAP1 (REG3α) 키트 </td><td> MBL 국제 </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> AB-경기 유니버설 키트 </td><td> MBL 국제 </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> R &amp; D 싸이유래 </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 폴리스티렌 원추형 바닥 판 </td><td> 열 과학 </td><td> 249570 </td><td> 플라즈마 소스 판에 사용 </td></tr><tr><td> Costar 절반도 높은 구속력을 96 - 웰 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3690 </td><td> IL-2Rα, HGF, TNFR1과 elafin ELISAs에 대한 </td></tr><tr><td> Nunc 384 잘 MaxiSorp 판 </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> REG3α 엘리사에 대한 </td></tr><tr><td> HyClone 인산은 1X 식염 버퍼 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민, 분수 V, 치료 열 충격 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> TBS의 차단기 곤드레 만드레 취한 </td><td> 열 과학 </td><td> 37,530 </td><td> IL-2Rα HGF와 TNFR1 ELISAs에 대한 차단 에이전트 </td></tr><tr><td> Dulbecco의식염 인산염 버퍼 </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> IL-2Rα, HGF, Elafin 및 TNFR1 ELISAs에 대한 버퍼를 씻어 </td></tr><tr><td> TMB 과산화수소의 Susbtrate </td><td> Kirkegaard 및 페리 연구소 </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> Acros의 유기물 </td><td> 233362500 </td><td> IL-2Rα, HGF, Elafin 및 TNFR1 ELISAs에 대한 버퍼를 씻어 </td></tr><tr><td> 황산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 84,720 </td><td> (2N에 희석) 정류장 솔루션 </td></tr></tbody></table>

급성 이식 - 대 - 호스트 질병의 생체의 유효성을 검사에 대한 높은 처리량 순차적 엘리사

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

편견 발견 단백질 체학 전략은 임상 환경에서 진단 및 전조 테스트를 개선 할 수 있으며, 가이드 치료 개입에 도움이 될 수 있습니다 새로운 생체​​ 많은 수의을 식별 할 수있는 가능성이 있습니다. 후보 단백질의 큰 번호가 식별되면, 이러한 급성 발병시와 같은 유한 볼륨, 이벤트 중심과 바꾸어 놓을 수없는 아르 환자 플라즈마 샘플에서 신속하고 효율적인 방식으로 후보 생체를 확인하기 어려울 수 있습니다 그래프트 - 대 - 호스트 질환 (GVHD), allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)의 잠재적 생명을 위협하는 합병증. 최소화하기 위해 순차적 방식으로 IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8 elafin 2, REG3α 3 (도 PAP1라고도 함) : 여기 여섯 확인 GVHD 단백질에 대한 상업적으로 이용 가능한 ELISAs을 수행하는 과정을 설명 동결 - 해동 사이클, 플라즈마 시간 및 플라즈마 사용을 해동. 최적의 연속 엘리사의 성능을 촉진하기 사소한 조정으로 제조업체 엘리사 키트 및 프로토콜을 사용하여 저희 연구실 년에 설립 된로 샘플 희석 요인에 의해 결정이 절차를 들면 우리는 순서대로 ELISAs을 수행합니다. 그 결과 플라즈마 biomarker 농도 그런 다음 컴파일하고 환자 일대에서 상당한 결과를 분석 할 수 있습니다. 이러한 생체는 연구 목적으로 현재 있지만, 임상 치료에의 설립은 현재 임상 시험에서 조사되고있다. 이 기술은 (들)은 다른 시약과 혼합 할 필요가 없습니다 샘플을 제공 같은 샘플에서 여러 단백질 / 관심 크린 시토 킨에 대한 ELISAs을 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 엘리사 키트는 사전 코팅 플레이트, 96도 반 잘 플레이트 또는 384 잘 접시와 함께 제공되지 않을 경우 자세한 샘플 / 시약의 사용을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다.

<html> biomarker의 워크 플로우 및 타임 라인은 각각 표 1과 표 2에 자세히 설명되어 있습니다. 일단, 완료 6 개의 단백질의 농도는 이제 플라즈마의 150 μL의 총을 사용하여 동일한 플라즈마 샘플을 계량되었습니다. 시험 당 중복에 샘플을 도금은 CV의 10 % 이하가 최적이되면, 내부 품질 보증 할 수 있습니다. 여러 접시, 높은 수준의 일관성 광학 밀도에 순차적 엘리사를 수행하는 것은 선호 및 측정의 개선 간 판의 신뢰성을 허용하는 경우, 표준 곡선 약물 과용이라면서은 엘리사 성능 불일치 (그림 2)에 대한 평가보고 판 사이에 비교할 수 있습니다. tetramethylbenzidine colorimetric 기판과 높은 농도 약물 과용이라면서을 사용하여 개발 시간이 저희 연구실의 각 biomarker에 대한 관찰은 표 3에 나열되어 있습니다. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;ALT =&quot;그림 1 &quot;/&gt; 그림 1. IL-2Rα, REG3α 및 HGF ELISAs를위한 워크 플로우. 플라즈마 샘플은 IL-2Rα 엘리사 테스트 판에 도금 한 후 다른 ELISAs에 희석 소스 접시를 만들기 위해 복원합니다. HGF 엘리사를 들어, 플라즈마 IL-8의 1시 6분 희석 판을 준비하는 복원합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 초기 REG3α GI GVHD의 biomarker 보고서 3 테스트 1084 환자에 해당하는 REG3α 농도를 측정하는 7 개의 엘리사 플레이트의 표준 곡선에 대한 광학 밀도. 플레이트들 사이 일관된 약물 과용이라면서은 플레이트들 사이 일관성있는 단백질 농도 측정을 보장합니다. 단백질의 농도플라즈마에서 샘플은 표준 곡선 광학 밀도에 샘플 광학 밀도를 비교하여 계산됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 실험의 날 0 </td><td> 1. 샘플을 준비 </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF와 REG3α 캡처 AB </td></tr><tr><td> 실험 1 일 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF 엘리사 (샘플 도금을 통해) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin와 TNFR 캡처 AB </td></tr><tr><td> 실험 2 일 </td><td> 1. HGF 엘리사 완료 </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin 엘리사 </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 엘리사 </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 엘리사 </td></tr><tr><td></td><td> 5. 사용하지 않은 얼혈장 </td></tr></tbody></table> 표 1. GVHD의 Biomarker 워크 플로우 개요 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 일 0 </td><td colspan="3"> 샘플 준비 및 야간 캡처 몸 보육 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 엘리사 </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> 시간 (시간) </td><td> 0.0 </td><td> 블로킹 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td> 도금 샘플 </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td> 감지 AB, 플라즈마 샘플을 복원 </td><td> 차단, 준비 &#39;샘플 (1시 10분 희석) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> 도금 샘플 (1시 10분) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> 감지 AB </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> 판 읽기 </td><td> TMB </td><td> 차단, 준비 &#39;샘플 (1시 2분 희석) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td></td><td> 판 읽기 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td> 도금 샘플 (1시 2분) </td><td> AB을 (하룻밤 배양) 캡쳐 </td><td> AB을 (하룻밤 배양) 캡쳐 </td><td></td></tr><tr><td> 2 일 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시간 (시간) </td><td> 0.0 </td><td></td><td></td><td> 플라즈마, 감지 AB를 복원 </td><td> 차단, 준비 &#39;샘플 (1시 20분) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> 샘플 도금 (1시 2분) </td><td> 차단, 1시 20분 샘플 더 희석을 1시 25분 희석에 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> 샘플 도금 (1시 25분) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td></td><td></td><td> 판 읽기 </td><td> 감지 AB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 샘플 (1시 6분 희석)를 준비 </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 감지 AB </td><td> 샘플 도금 (1시 6분) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> 판 읽기 </td&gt; <td> HRP </td><td> 감지 AB </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 판 읽기 </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 판 읽기 </td></tr><tr><td colspan="2"> 완료 후 </td><td colspan="6"> aliquots에 소스 플라즈마를 교체하고 나중에 사용하기 위해 냉동 </td></tr></tbody></table> 표 2. ELISAs을 수행하기위한 타임 라인. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 플라즈마 희석 계수 </td><td> 높은 표준 농도 </td><td> 기판 개발 시간 (분) </td><td> 높은 OD </td><td> 곡선 </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 1시 1분 </td><td> 2000 PG / ML </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 선의 </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 1시 2분 </td><td> 4000 PG / ML </td><td> 22 </td><td> 2.1 </td><td> 4 매개 변수 </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 1시 6분 </td><td> 200 PG / ML </td><td> 12 </td><td> 2.7 </td><td> 4 매개 변수 </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 1시 10분 </td><td> 100 NG / ML </td><td> 12 </td><td> 1.7 </td><td> 4 매개 변수 </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 1시 20분 </td><td> 2000 PG / ML </td><td> 20 </td><td> 1.9 </td><td> 4 매개 변수 </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 1시 25분 </td><td> 800 PG / ML </td><td> 8 </td><td> 2.7 </td><td> 선의 </td></tr></tbody></table> 6 GVHD 생체에 대한 표 3. 엘리사 세부 정보.

여러 후보 생체의 높은 처리량 검증은 동결 / 해동 사이클을 최소화하고 귀중한 플라즈마 샘플을 사용하기 위해 순차적 엘리사에 의해 수행 할 수 있습니다. 여기, 우리는 순차적으로 여섯 가지 검증 플라즈마 생체에 대한 ELISAs을 수행하는 방법을 보여줍니다<sup&gt; 1-3</sup&gt; 이식 - 대 - 호스트 질환 (GVHD)의<sup&gt; 4</sup&gt; 동일한 플라즈마 샘플 있습니다.

비편향적 탐색 단백질체학 전략은 진단 및 예후를 개선할 수 있는 수많은 새로운 바이오마커를 식별할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며...

다음 실험의 전반적인 목적은 고처리량 순차적 ELISA를 사용하여 프로테오믹스로 발견된 수많은 새로운 바이오마커를 효율적으로 분석하는 것입니다. 먼저 소스 플레이트에 샘플을 첨가하여 각 바이오마커의 희석액을 생성하고 테스트 간에 회수된 혈장을 보관함으로써 이를 달성합니다. 그다음, 각 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 환자 샘플 내의 농도를 결정합니다.궁극적으로, 급성 이식편대숙주병의 임상 증상이 나타나는 시점에 이러한 바이오마커들의 단백질 수준 상승을 평가할 수 있습니다. 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 연속 분석기를 통해 다중 분석 플랫폼으로는 항상 가능하지 않은 여러 가지의 새로운 단백질을 분석할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 응용 범위는 급성 이식편대숙주병의 진단까지 확장됩니다.이 방법을 통해 검증된 바이오마커들은 현재 임상 진료를 위해 연구되고 있습니다. 이 방법은 외상 후 조혈모세포 이식의 합병증에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 폐 이식 합병증, 폐암 또는 진단용 혈액 검사가 유용한 잠재적 모든 질환의 바이오마커 발굴 및 검증에도 적용될 수 있습니다.재현성을 확보하고 배치 간 변동성을 낮추기 위해서는 여러 단계를 일관되게 수행하는 것이 중요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 실험 전날, 해동된 혈장 분주 시료를 15,300 RCF, 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 하단의 응고물과 상단의 지질을 혈장에서 분리합니다. 그런 다음, 미리 정의된 맵에 따라 수동 피펫팅을 이용하여 각 시료의 희석되지 않은 혈장 150 µL를 96-well V-bottom 플레이트에 분주합니다. 플레이트를 파라필름(Parafilm)으로 감싸고 4°C의 습도 챔버에 최대 72시간 동안 보관합니다.다음으로, 제조사의 지침에 따라 IL-2 수용체 알파 및 인간 성장 인자(HGF) 포획 항체를 재구성 및 희석한 후, 각 항체를 50 µL씩 각각의 96-well high binding half well plate의 각 well에 분주합니다. 그런 다음 plate sealer로 plate를 밀봉하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 제조사의 프로토콜에 따라 reg three alpha를 제조사 제공 코팅 버퍼로 희석하고, 이 용액 25 µL를 384-well no maxor plate의 각 well에 분주합니다.그런 다음 실험 첫날에 이 플레이트를 밀봉하여 4 °C에 함께 보관하십시오. IL-2 receptor alpha 테스트 플레이트를 세척하고 TBS 내의 blotto로 블로킹하는 것으로 시작합니다. 표준품을 재구성한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 8점 표준 곡선을 설정하십시오.다음 플레이트에, 원본 플레이트로부터 희석하지 않은 혈장 50 µL와 각 표준 물질 50 µL를 ELISA 테스트 플레이트에 두 번씩 분주합니다. 그런 다음 밀봉된 플레이트를 300 RPM으로 설정된 플레이트 회전기에 넣고 상온에서 배양합니다. 2시간 후, IL-2 receptor alpha ELISA 테스트 플레이트에서 혈장을 회수하여 희석하지 않은 혈장 원본 플레이트로 다시 옮깁니다.제조사의 프로토콜에 따라 EIA를 완료한 후, 450에서 570 nanometers로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 광학 밀도를 측정하십시오. Reg III$\alpha$ ELISA의 경우, 먼저 10 $\mu$L의 희석하지 않은 혈장을 별도의 V-bottom 소스 플레이트로 옮긴 다음, 각 웰에 제조사에서 제공한 희석 버퍼 90 $\mu$L를 추가하여 1:10 희석 소스 플레이트를 만듭니다. 제조사의 프로토콜에 따라 Reg III$\alpha$ ELISA를 완료한 후, 384 웰 플레이트에 정지 용액을 추가하고 450에서 620 nanometers로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 광학 밀도를 측정하십시오. 제조사 사양에 따라 IL-10 및 TNF-R1 캡처 항체를 재구성하고 희석한 후, 각각의 96 웰 하이 바인딩 하프 웰 플레이트의 각 웰에 캡처 항체 50 $\mu$L를 코팅하십시오.그 후, 밀봉된 테스트 플레이트를 실온(elephant 플레이트용) 및 4 °C(TN FFR 플레이트용)에서 하룻밤 동안 배양하십시오. IL-2 수용체 alpha ELISA를 완료한 후, 희석하지 않은 플라스마 60 µL를 새로운 소스 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 각 웰에 PBS 내 1% BSA 60 µL를 첨가하여 1:2로 희석된 플라스마 소스 플레이트를 만듭니다.다음으로 HGF 테스트 플레이트를 TBS 내의 BLOTTO로 세척 및 블로킹한 후, 8점 표준 곡선 희석액을 준비합니다. 플레이트 세척 및 블로킹 단계를 거친 후, 1~2배로 희석된 혈장과 각 표준물질의 50 µL 분주액을 EISA 테스트 플레이트에 중복으로 분주합니다. 그 다음, 밀봉된 플레이트를 300 RPM으로 설정된 플레이트 회전 장치 위에서 실온의 상태로 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, HGF ELISA 테스트 플레이트에서 1:2 희석 혈장을 회수하여 1:2 희석 혈장 소스 플레이트에 다시 넣습니다. 제조사의 프로토콜에 따라 EIA를 완료한 후, 실험 2일 차에 플레이트 리더를 450~570 nm로 설정하여 각 웰의 광학 밀도를 측정합니다. 먼저 10 µL의 희석하지 않은 혈장을 새 소스 플레이트로 옮긴 다음, PBS 내 1% BSA 190 µL를 추가하여 200 µL의 1:20 희석 혈장을 만듭니다.그 후, 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA를 완료한 다음, 450에서 570 nanometers로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정하였습니다. TNF-α FFR의 경우, ELISA는 먼저 1% BSA 및 PBS 25 microliters를 1:20 희석 소스 플레이트에 추가하여 웰당 1:25로 희석된 혈장 125 microliters가 되도록 하였습니다. 그 후 제조사의 프로토콜에 따라 TNF-α FFR ELISA를 완료하고, 450에서 570 nanometers로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 흡광도를 측정하였습니다. IL-8 EIA의 경우, 먼저 1:2로 희석된 혈장 60 microliters를 새로운 소스 플레이트로 옮긴 다음, 각 웰에 IL-8 희석액 180 microliters를 추가하여 1:6으로 희석된 혈장 소스 플레이트를 제조하였습니다.제조사의 프로토콜에 따라 ILH Eliza를 완료한 후, 450에서 570 나노미터로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 마지막으로, 모든 Eliza가 완료되면 사용하지 않은 talk plasma를 thought Eloqua에 다시 넣고 향후 사용을 위해 냉동 보관합니다. 이 그래프에서는 초기 reg three alpha 위장관 이식편대숙주병 바이오마커 보고서를 위해 테스트된 1084명의 환자에 해당하는 reg three alpha 농도를 측정한 7개의 서로 다른 ELIZA 플레이트 표준 곡선의 흡광도가 표시되어 있습니다. 플레이트 간의 일관된 흡광도는 실험 간의 일관된 단백질 농도 측정을 보장합니다.혈장 샘플 내 단백질 농도는 샘플의 광학 밀도를 표준 곡선 광학 밀도와 비교하여 계산하였습니다. 로봇 자동화 세척 핸들링 플랫폼을 사용하면 ELISA 및 크리에이티브 폼 웰 플레이트를 통해 사용하는 혈장의 부피를 줄이는 동시에 재현성을 더욱 높일 수 있습니다. 이 절차를 계획할 때, 희석하지 않은 혈장으로 EIS를 먼저 수행하여 이후 개발 단계의 실험에서 회수하여 사용할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.이 기술은 단백질체학 분야의 연구자들이 순차적 ELISA의 보편적 활용을 통해 관심 있는 모든 질병의 후보 바이오마커를 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 적은 양의 혈장을 사용하고 비특이적 결합을 최소화하면서 순차적 ELISA를 통해 여러 바이오마커를 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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Medicine

의학

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이 비디오는 인간의 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 관련된 단백질 바이오마커를 검출하기 위한 모세관 전기영동 면역분석 프로토콜을 보여줍니다. ALS 바이오마커 단백질의 존재 확인은 혈소판 단백질의 크기 기반 분리와 화학발광 검출을 통해 이루어집니다.

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이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

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여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.

디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

7개의 자가항체 분석을 함께 결합하는 간단한 멀티플렉스 ECL 분석을 모델링합니다. 이 분석은 체강 질병,자가 면역 갑상선 질환 및자가 면역 다선 증후군 1을 포함하여 T1D 및 여러 다른자가 면역 질환을 동시에 스크리닝 할 수 있습니다.

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제1형 당뇨병, 체강 질병 및 코로나바이러스 질병 2019에 대한 스크리닝의 시급한 필요성에 따라 당사는 4개의 췌도 자가항체, 조직 트랜스글루타미나제 자가항체 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2의 수용체 결합 도메인에 대한 항체를 동시에 검출하기 위해 고처리량 6-Plex 전기화학 발광 분석을 개발했습니다.

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진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

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