Name: 유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 학습하세요 중추신경계 미세회로 분석을 위한 유전적 바이러스 추적법을 사용하는 방법을. TVA 수용체를 이용한 고효율 신경 회로 매핑 기술로 시냅스 연결 뉴런을 정확히 추적할 수 있습니다.

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우리는 재조합 VSV 변종을 구출에 도움 션 Whelan을 인정하고, 기술 지원 Didem Goz와 라이언 Chrenek 것입니다. 이 작품은 HHMI (CLC)에서 지원하고, # NS068012-01 (KTB)되었습니다.

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

신경 회로를 공부하고 바이러스를 사용하면 연결된 뉴런을 분석의 상대적으로 높은 처리량 방법입니다. 그러나, VSV 및 RABV의 virions 모두를 생성하는 것은 사소한되지 않습니다. cDNA에서 바이러스를 구해준 것에 대해 위에 나열된 프로토콜이 제공되고 있지만, 아직 낮은 확률 이벤트입니다. N, P 및 L의 plasmids 각각의 수준은 잘게 조정해야하고, 많은 시련과 복제는 바이러스 구조를 보장하기 위해 수행해야합니다. 전체 VSV 게놈 RNA를 통합 ribonucleotide 입자의 형성은 낮은 확률 이벤트이므로 여러 번 시도 걸릴 수 있습니다. 이 기술은 최적화를위한 시간이 필요할 수 있습니다 그러나, 일단 그 바이러스를 구출하는 것이 훨씬 쉽게, 최적화되어 있습니다. RGC 수지상 울타리, 나무는 (즉, 그림 4A) 중복되지 않는 경우 개인 RGCs에서 바이러스 전송의 분석이 가장 이루어집니다. 바이...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;조직 배양&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Baby Hamster Kidney (BSRT7) 세포</td><td>요청 시 제공 가능</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3) 바이러스</td><td>요청 시 제공 가능</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pN, pP, pl 플라스미드</td><td>요청 시 제공 가능</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화 칼슘</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 세포</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC 처리 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 통기성 캡이 있는 직사각형 경사형 넥 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>배지: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: 소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2,000 형질전환 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>주사기: 5 ml Luer-Lock 주사기</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: 고효능 선형 PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;바이러스 원심분리&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Corning 150 ml 튜브 상단 진공 필터 시스템, 0.45 &amp;mu;m 공극</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>박벽, 초투명, 38.5 ml, 25 x 89 mm 초원심분리 튜브</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>SW28 초원심분리기 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;마우스 주입&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>모세관 마이크로피펫</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>정위 고정 장치</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Ump 주입기</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>4채널 마이크로컨트롤러</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>C.EMX-1 다이얼 제어 장치가 포함된 M.TXB 벤치 모터, 115 Volt</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>H.10 핸드피스, 퀵 체인지</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>스텝 드릴, 0.5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>마이크로&amp;#8211;전극 홀더</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>자일라진</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30게이지 주사 바늘</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>보호 안과용 연고</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>요오드</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;수술 및 해부 도구&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>표준 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>미세 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>메스 날</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>봉합사</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;해부 및 항체 염색&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;항체&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>항체</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;조직 마운팅&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Superfrost plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>커버 글라스 22 x 22, 두께 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>투명 매니큐어</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 항퇴색 시약</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

neuronal 회로를 공부 클래식 방법은 매우 낮은 처리량 있습니다. Transsynaptic 바이러스, 회로를 공부 특히 pseudorabies (PRV)와 광견병 바이러스 (RABV), 그리고 더 최근의 기공을 갖는 구염 바이러스 (VSV)는, 점점 더 인기를 끌고있다. 이러한 높은 처리량 방법 중 하나 anterograde 또는 역행 방향으로 뉴런 사이의 전송 바이러스를 사용합니다. 최근 monosynaptic 역행 추적에 대한 수정 RABV가 개발되었습니다. (그림 1A). 이 방법에서, 당 단백질 (G) 유전자는 바이러스 게놈에서 삭제되고, 대상 뉴런에서만 resupplied. 감염 특이성은 일반 RABV-G 1 ASLV-A 당 단백질과 RABV-G (A / RG)의 세포질 도메인의 세포 도메인으로 구성된 키메라 G를, 대체에 의해 달성된다. 이 키메라 G는 특히 TVA 수용체 1을 표현 세포를 감염. 유전자 인코딩 TVA는 D되어 있습니다다양한 방법 2-8으로 elivered. TVA - 표현 뉴런의 RABV-G 감염 후, RABV는 TVA 수용체와 공동 배달 된 자신의 G의 성격에 의해 역행 방향으로 다른 synaptically 연결 뉴런에 전송할 수 있습니다. 이 기술은 정의 된 스타터 세포 유형로 입력의 모든 샘플링을 제공 정의 된 셀 타입에 입력의 상대적으로 많은 수의 (5-10 %) 2 레이블. 우리는 최근 transsynaptic 추적 9로 VSV을 사용하려면이 기술을 수정했습니다. VSV는 유전자 표현의 급속 등 여러 장점을 갖추고 있습니다. 다음은 상세 증가 해상도 microcircuitry을 탐색하는 데 유용합니다 VSV를 사용하여 새 바이러스 추적 시스템을. 동안 Wickersham 외하여 원래의 출판 전략. 4 Beier 외. 처음에 감염된로 프로젝트가 TVA--세포를 표현, 여기를 VSV는 TV 만 전송하도록 설계되었습니다있는 뉴런의 9 허가 라벨A-표현 세포 (그림 1B). 바이러스가 처음 TVA - 표현 뉴런의 뉴런 하류의 감염을 허용하는 RABV-G와 pseudotyped 있습니다. 셀의 첫 번째 인구 감염 후 바이러스는 TVA-표현 세포를 감염시킬 수 있습니다 발표했다. transsynaptic 바이러스 확산이 TVA - 표현 세포, 정의 셀 유형에서 연결의 부재의 존재로 제한되어 있기 때문에 높은 해상도로보실 수 있습니다. 이 실험의 실험 플로우 차트는 그림 2에 표시됩니다. 여기 모델 회로를 보여, 마우스 망막에 방향 선택성의. 우리는 망막 신경절 세포 (RGCs)에 항성 amacrine 세포의 연결 (주머니)를 검사합니다.

synaptically 연결 뉴런을 추적하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 관심의 세포 인구가 유전자 정의 셀 유형에서 시냅스 입력을 받고 있는지 여부를 조사하기 위해 상류 세포의 TVA의 특이성을 사용합니다.

신경 회로를 연구하는 고전적인 방법들은 처리량이 상당히 낮습니다. 시냅스 간 전이 바이러스, 특히 가성광견병 바이러스(PRV)와 광견병 바이러스는...

다음 실험의 전반적인 목표는 중추 신경계의 미세 회로를 분석하기 위한 새로운 기술을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 TVA 수용체의 발현을 통해 감염될 뉴런 집단을 정의함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, 시냅스 간 전이 바이러스를 중추 신경계(CNS)에 주입하여 선택한 일차 뉴런을 감염시킵니다.다음으로, 바이러스는 TVA 수용체를 발현하는 연결된 뉴런으로만 시냅스 간 전파(trans-synaptic spread)됩니다. 이러한 뉴런들이 연결되어 있는지 확인하기 위해, 이미 알려진 연결 미세회로의 표지 검증을 바탕으로 본 기술이 미세회로 분석에 사용될 수 있음을 보여주는 결과를 얻습니다. 전기생리학이나 현미경 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 본 기술의 주요 장점은 뉴런 회로를 분석하는 고처리량(high-throughput) 방법이라는 점입니다.우리는 Wickersham 연구팀의 단일 시냅스 제한적 바이러스 추적에 관한 첫 연구를 읽었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 우리는 바이러스를 더욱 정교하게 설계함으로써 연결된 뉴런을 새로운 방식으로 연구할 수 있다고 생각했습니다. 계대 배양을 위한 세포를 생성하기 위해 VACCINIA T seven 시스템을 사용하여 CD NA로부터 VSV를 회수하는 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오.먼저 전날 분주한 80% 합류도의 TV eight 800 세포가 담긴 10 centimeter 플레이트 4개에서 배지를 흡입하여 제거하고, 보충제가 없는 DMEM 5 milliliters로 교체합니다. 표준 절차에 따라 선택한 당단백질을 인코딩하는 플라스미드 5 micrograms를 각 플레이트에 트랜스펙션합니다. 트랜스펙션 약 6시간 후, 배지를 10% FBS가 보충된 DMEM으로 교체합니다. 당단백질의 발현과 표면 축적을 위해 34 degrees Celsius, 5% carbon dioxide로 설정된 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다.배양 후, 배지를 흡입하여 제거하고 10% FBS가 포함된 DMEM 5 mL로 교체합니다. 그 다음, 감염다중도(MOI) 0.01에서 0.1로 MA 광견병 G 키메라 당단백질을 포함하는 VSV를 각 플레이트에 감염시키고 34 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 24시간 후, 형광 현미경을 통해 각 플레이트의 감염 수준을 확인합니다. 세포의 50% 이상이 감염되었다면, 배지를 수집합니다.5 mL의 신선한 배지로 교체한 다음, 수집된 배지를 -80 °C에서 동결합니다. 24시간 후 수집 절차를 반복하여 3일 동안 더 수행함으로써 총 4일간 수집합니다. 마지막 분주액이 -80 °C에서 완전히 동결된 후 수집된 배지의 각 분주액을 동결합니다. 이 시점에서 모든 수집 배지 분주액은 37 °C 상태여야 하며, 수집된 배지는 총 80 mL가 되어야 합니다. 수집된 배지를 얼음 위에서 0.45 µm 필터로 여과합니다.그 다음, 36 milliliters의 바이러스를 Beckman 원심분리 튜브에 분주하고, 4 °C에서 80,000 ×g로 90분간 초원심분리하여 상층액을 농축합니다. 원심분리 후 로터의 균형이 적절히 맞았는지 확인한 다음, 10% 표백제가 담긴 비커에 넣고 흡입기(aspirator)를 사용하여 튜브 측면의 액체를 제거합니다. 이어서 바이러스가 포함된 튜브를 4 °C에서 120 RPM으로 1시간 동안 흔들어 섞어준 뒤, 대개 30 µL 정도인 가능한 최소 부피로 바이러스 펠렛을 재현탁합니다.바이러스를 재현탁한 후, 293T 세포가 배양된 24웰 플레이트에 10배 단계 희석 시리즈(1에서 100만 배까지)로 감염시켜 감염 약 2일 후에 역가를 측정합니다. 표준 절차에 따라, 바이러스에 감염된 세포는 형광을 통해 검출할 수 있습니다. 이러한 실험에서는 적절한 세포주를 사용하는 것이 중요합니다.목표는 매핑하고자 하는 세포 유형에 TVA 수용체가 발현되도록 하는 것입니다. 이는 바이러스 방법을 통해 TVA 수용체를 발현시키거나 형질전환 대립유전자를 통해 달성할 수 있습니다. 본 실험에서는 6~10주령의 삼중 형질전환 마우스를 사용합니다.조건부 TVA 대립유전자를 발현하는 마우스를 chat, Cree 대립유전자를 발현하는 마우스와 교배합니다. 그 다음, 이 마우스들을 형광 TD tomato 대립유전자를 발현하는 라인과 교배합니다. 최종 전이유전자 마우스는 관심 대상인 starburst omicron 세포를 포함하여 Cree를 발현하는 모든 세포에서 TVA와 조건부 TD tomato 대립유전자를 발현합니다.그리고 이러한 발현은 형광 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 마우스 뇌 지도에서 관심 영역의 정위 좌표를 확인하고, 마이크로 인젝터 컨트롤러를 켜고 플런저와 전극 홀더를 제자리에 이동시켜 정위 고정 장치를 준비합니다. 그다음 바이러스와의 인터페이스를 제공하기 위해 바늘을 미네랄 오일로 역충전하고, 바늘에 기포가 없는지 확인하며 바늘을 플런저 위에 배치합니다.바이러스를 해동하여 얼음 위에 둡니다. 마이크로 인젝터를 흡입 모드로 설정하고, 바이러스 튜브를 마이크로 인젝터의 모세관 아래로 이동시킵니다. 모세관의 팁을 바이러스 용액 속에 넣고 실험에 필요한 양의 바이러스를 흡입합니다.부프레노르핀(buprenorphine)을 수술 전 투여한 후, 기관 지침에 따라 동물에게 적절히 마취를 실시합니다. 발가락 꼬집기 테스트(toe pinch)를 수행하여 반사 반응이 없는지 확인합니다. 이후 절차를 시작합니다.마취된 마우스를 마우스 위치 조절을 위해 이동식 스탠드 위에 놓인 가열 패드 위에 올립니다. 동물이 마취된 동안 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. 이제 이어바(ear bars)를 외이도에 조심스럽게 삽입하여 마우스를 정위 고정 장치에 배치합니다.머리가 스테레오 정위 고정기(stereo attacks)의 바닥면과 평행하며 측면으로 움직이지 않는지 확인하십시오. 다음으로, 머리를 안정적으로 고정하기 위해 바이트 바(bite bar)를 조정합니다. 절개 부위의 털을 제거하십시오.그 다음 이 부위를 에탄올로 3회 세척하고, 이어서 요오드로 3회 세척합니다. 가위로 피부에 정중선 절개를 하여 두개골이 드러나게 한 후, 수제 수술용 갈고리를 사용하여 피부를 뒤로 젖힙니다. 그런 다음 bgma로 마이크로 모세관을 고정하고 다이얼을 사용하여 마이크로 인젝터를 외측 슬상핵(lateral geniculate nucleus) 좌표로 이동시킵니다.LGN의 위치를 확인한 후, 주입 부위 상단의 두개골에 작은 구멍을 뚫습니다. 모세관을 구멍 위에 배치하고 뇌 표면의 바로 등쪽 위치까지 천천히 내립니다. 이 지점이 등-배(dorsal ventral) 좌표의 제로 지점이 됩니다.마이크로 모세관은 생쥐의 경막을 뚫을 수 있을 만큼 충분히 날카로워야 합니다. 따라서 이를 2.75 millimeters 깊이까지 천천히 내린 후, 분당 약 100 liters의 속도로 필요한 양의 바이러스를 주입하십시오. 주입 부위에서 바이러스가 확산되도록 하고 바이러스가 바늘을 따라 역류하는 것을 방지하기 위해, 바늘을 뇌 속에 약 7분 동안 그대로 두십시오.그 후 2분에 걸쳐 매우 천천히 주입 부위에서 바늘을 들어 올려 뇌 밖으로 제거합니다. 마지막으로 수술 부위를 봉합하고 동물들이 마취에서 회복될 때까지 모니터링합니다. 2일 동안 12시간마다 buprenorphine을 투여합니다.일반적으로 VSV의 시냅스 간 전파는 주입 후 약 24시간 후에 관찰할 수 있습니다. 다만, 대기 시간을 더 길게 가지면 전파 범위가 더 넓어집니다. 이산화탄소 흡입법으로 마우스를 안락사시킨 후, 안구를 적출하여 4% formaldehyde에 넣고 안구가 완전히 잠긴 상태로 1시간 동안 배양합니다.그 다음 안구를 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 55번 핀셋을 사용하여 각막을 빠르게 제거하고, 망막을 느슨하게 하여 다른 조직으로부터 분리 및 절제합니다. 전체 마운트 분석을 수행합니다.망막이 평평하게 놓이도록 유리 슬라이드 위에서 절단합니다. 장기 보존용 금 도금 마운팅 미디어를 사용하여 유리 슬라이드 커버의 가장자리에 실리콘 스페이서를 배치한 다음, 망막 절편 분석을 위해 두께가 0인 유리 커버슬립으로 덮습니다. 망막이 완전히 잠길 때까지 PBS 내 30% sucrose에 넣어 둡니다.그 다음, 망막을 OCT와 30% sucrose 용액을 1:1 비율로 혼합한 용액에 넣고 3시간 동안 둡니다. 마지막으로, 망막을 급속 냉동시킨 후 섹셔닝 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관합니다. 이 이미지는 vsv A/rg에 의한 TVA 800 세포와 2 9 3 T 세포의 감염성을 입증하는 시간 경과 실험을 보여줍니다.상단 패널은 감염 후 6시간, 1일 및 2일 시점의 TVA 800 세포를 보여줍니다. 하단 패널은 동일한 시점의 2 9 3 T 세포를 보여줍니다. 바이러스는 TVA를 발현하는 세포 사이에서 수 시간 내에 확산되는 반면, TVA 수용체를 발현하지 않는 2 9 3 T 세포에서의 확산은 발생하기는 하지만 훨씬 더 느리게 진행됩니다.스케일 바는 100 microns를 나타냅니다. 이 이미지는 TVA를 발현하지 않는 마우스의 망막 신경절 세포의 대표적인 감염 상태를 보여줍니다. 동물들의 LGN에 vsv A/RG 바이러스를 주입하였습니다.R-A-B-V-G로 가상 타이핑(pseudo typed)하였으며, 주입 2일 후에 조직을 채취하였습니다. 여기서는 희박한 감염 상태가 관찰되며, 노란색 화살표 머리로 망막 신경절 세포가 표시되어 있습니다. 이 이미지는 더 조밀한 감염 상태를 보여줍니다.여기서 보는 바와 같이, 더 높은 바이러스 TI와 양질의 주입을 통해 이를 달성할 수 있습니다. 소수지상 신경절 세포, 1형 멜라놉신 신경절 세포, 방향 선택적 신경절 세포(DS GCs) 및 on-off DS GCs를 포함하여 형태학적 특징에 따라 다양한 유형의 망막 신경절 세포를 식별할 수 있습니다. 여기서 스케일 바는 TVA를 발현하는 마우스의 다음 이미지들에서 보는 바와 같이 50 microns를 나타냅니다.on-off DS GC에서 Starburst omics로의 VSVA/RG 전달은 예상된 패턴을 따릅니다. 녹색으로 채워진 흰색 화살촉으로 표시된 on-off DS GC는 노란색 화살촉으로 표시된 다수의 starburst omics로 바이러스를 전달합니다. 여기서 볼 수 있듯이, DS GC가 아닌 모든 녹색 세포는 Cree 리포터와 함께 라벨링되어 이들이 TVA를 발현하는 Starburst omics임을 나타냅니다.녹색 채우기가 된 흰색 화살표 머리로 표시된 DS GC와 노란색 화살표 머리로 표시된 starburst omics는 망막 내망상층(IPL)의 적절한 층을 층별화하며, 바이러스가 전달되는 세포에는 on 및 off 세포가 모두 포함됩니다. Starburst omicron. 이 그림의 숫자는 IPL의 층을 나타냅니다. 숙련되면, 적절하게 수행할 경우 전체 실험은 1~2일 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 거친 후 VSV의 속도는 주요한 장점 중 하나가 됩니다. 바이러스 회로 추적을 검증하고 이러한 시냅스 연결의 특성을 분석하기 위해 channel red, opsin 기반 회로 매핑과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 바이러스 배양부터 생체 내(in vivo) 주입, 그리고 형광 표지된 뉴런의 분석에 이르기까지 바이러스 회로 추적에 포함된 대부분의 다양한 단계들에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

viral-tracing-of-genetically-defined-neural-circuitry

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 제공 추적기에 대한 실질적인 가이드를...

멀티 컬러의 신경 회로 지형을 공개

Transsynaptic tracing은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중심 원심성을 분석하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. 여기에서는 시냅스경이 횡단하는 광견병 바이러스를 활용하여 기능적인 뇌 회로를 식별하고 국소화하는 프로토콜을 제시한 다음, 식별된 뉴런 그룹 간의 회로에서 특정 연결을 검증하기 위한 고전적인 요로 추적 기술을 제시합니다.

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다.

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

이 프로토콜은 생체 내에서 직접 다시 프로그래밍 된 인터뉴런을 생성하는 것을 목표로, 뇌의 AAV 기반 바이러스 시스템과 생체 내에서 세포 식별 및 추가 분석을 허용하는 FLEX 시냅신 구동 GFP 리포터를 사용하여.

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

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여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

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배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

학습하세요 중추신경계 미세회로 분석을 위한 유전적 바이러스 추적법을 사용하는 방법을. TVA 수용체를 이용한 고효율 신경 회로 매핑 기술로 시냅스 연결 뉴런을 정확히 추적할 수 있습니다.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

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