태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

다음 절차의 목적은 세포 사멸 패턴을 검출하기 위해 lyo tracker dye로 마우스 배아와 분화된 줄기 세포의 두 가지 유형의 샘플의 리소좀을 유지하는 방법을 보여주는 것입니다. 배아 샘플을 준비하기 위해 먼저 배아를 외과적으로 분리하고 접시에 넣어 분화된 세포를 준비합니다. 배아 줄기 세포는 배아체를 만드는 데 사용됩니다.

이 배아체는 현탁액에서 배양된 다음 챔버 슬라이드에서 단층으로 성장합니다. 모든 판매 단층을 판매한 배아는 ot tracker red로 배양한 다음 헹구고 고정 샘플을 촬영하여 검사하고 정량화할 수 있으며 염색 결과를 얻을 수 있습니다. 염색은 배아 및 배양된 세포에서 세포 사멸을 프로그래밍하는 데 사용할 수 있는 간단한 절차입니다.

터널 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 OT 추적기 염료가 작은 분자이기 때문에 두꺼운 조직을 빠르고 쉽게 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 마우스 배아 및 분화된 배양에서 프로그래밍된 세포 사멸 패턴에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 닭 배아 및 분화 성체 줄기 세포와 같은 다른 조직 유형에도 적용할 수 있습니다. 어린 암컷 쥐를 스터드 수컷과 짝을 이루고 다음 아침에 짝짓기가 발생했음을 나타내는 질 마개가 있는지 확인하십시오.

질 마개가 나타나는 날 정오는 사실상 0.5일입니다. 관심 있는 배아 날에 코투스를 게시하고 승인된 프로토콜에 따라 암컷을 안락사시키고 자궁을 행크의 BSS로 10cm 페트리 접시에 넣고 혈액을 헹굽니다. 배아를 분리하여 자궁에서 제거합니다.

여분의 배아 막을 제거하고 행크의 BSS로 최소 한 번 헹구어 외부 조직과 혈액을 제거합니다. 청소하는 동안 절개된 배아를 얼음 위에 보관하십시오. 다른 사람들.

5ml의 Liso tracker 배아 염색 용액을 준비합니다. 이것은 하나 또는 두 개의 배아 수집을 위한 충분한 부피입니다. 용액을 부드럽게 혼합하여 염료를 분산시키고 배아를 용액에 균등하게 옮긴 다음 배아를 용액으로 옮기고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다.

배양 후 Hank's BSS의 배아를 5분씩 4회 부드럽게 헹굽니다. 조직이 손상되지 않도록 부드럽게 헹구는 것이 중요합니다. 액체를 제거하고, 섬세한 배아가 있는 곳을 천천히 세심하게 살피고, 항상 배아를 덮고 있는 액체의 일부를 남겨 두십시오.

그런 다음 다음날 밤새 4% 파라 포름알데히드에 배아를 고정합니다. Hank's BSS에서 배아를 한 번 헹구어 고정액을 제거합니다. 이제 메탄올 계열을 통해 조직을 탈수하여 배경 염색을 제거합니다.

이 단계는 저장 전에 이미징하는 동안 신호 대 잡음비를 개선합니다. 필요한 경우 유전자 분석을 위해 각 배아에서 조직 샘플을 수집합니다. 나중에 유전형 분석 전에 조직 샘플을 재수화합니다.

배아를 조직 샘플과 일치하는 라벨이 있는 개별 튜브로 분리합니다. 이제 분리된 배아를 섭씨 영하 20도의 메탄올에 무기한 저장할 수 있습니다. 빛으로부터 보호됩니다.

행잉 드롭(hanging drop) 방법을 통해 배아를 준비하는 것으로 시작합니다. 3일 후 20마이크로리터 드롭당 500개의 세포 밀도로 시작 밀도로 배아체를 10cm 비부착성 페트리 접시의 현탁액 배양으로 이동합니다. 5일 동안 배양하고 5일 후에는 2일마다 미디어를 변경합니다.

배아체를 젤라틴화된 8개의 챔버 슬라이드로 옮기고, 각 챔버에 하나 또는 두 개의 배아체를 배치합니다. 배아를 10일 더 배양합니다. 10일 후 격일로 배지를 교체하고 기존 배지를 부드럽게 흡입하고 각 챔버에 300마이크로리터의 Lyo 추적기 세포 염색 용액을 추가합니다.

매체를 수동으로 피펫으로 빼내고 피펫 팁을 챔버 모서리에 놓도록 주의하십시오. 이렇게 하면 실수로 제거하지 않고 유리 표면에서 모든 본체를 부착할 수 있습니다. 미디어를 다시 추가할 때 피펫 팁을 챔버 모서리에 놓고 미디어를 매우 천천히 다시 추가합니다.

챔버를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 헹굴 때마다 5분 동안 DPBS로 두 번 헹굽니다. 이제 실온에서 15분 동안 4%파라알데히드에 셀을 고정합니다.

그런 다음 5분 동안 두 번 헹궈 DPBS가 함유된 고정제를 제거합니다. 배아를 장착하려면 깊은 함몰 유리 슬라이드나 작은 페트리 접시 감염 실드에 넣으십시오. DPBS를 흡인하여 현미경 검사를 위한 세포 샘플을 준비합니다.

슬라이드에서 챔버를 제거하고 약 5분 동안 자연 건조시킵니다. 플루로를 보호하기 위해 호일로 덮으십시오. 그런 다음 dappy와 함께 vector shield와 같은 수성 장착 매체를 추가하고 그 위에 커버 슬립을 놓습니다.

이제 슬라이드가 장착되었으며 이미징할 준비가 되었습니다. 막대, 도민 또는 텍사스 레드 필터가 장착된 해부 현미경 또는 복합 현미경으로 샘플을 시각화합니다. 염색은 일반적으로 매우 밝기 때문에 일반적으로 수동 모드에서는 장시간 노출이 필요하지 않습니다.

동일한 노출 조건에서 모든 샘플의 디지털 사진을 찍습니다. 이미지를 수량화하려면 Adobe Photoshop 또는 유사한 이미징 프로그램에서 이미지를 엽니다. lyo tracker staining의 정도를 확인하려면 빨간색 채널을 선택합니다.

전체 이미지의 픽셀 개수는 histogram 함수에 의해 표시됩니다. 다음 임계값, 빨간색 염색이 이제 흰색 픽셀로 표시되는 이미지입니다. 이렇게 하면 이미지가 흑백으로 변환됩니다.

임계값 수준을 선택하고 세트의 모든 이미지에 이 수준을 사용합니다. 색상 범위 도구를 사용하여 흰색 픽셀을 선택하고 히스토그램 기능을 사용하여 총 흰색 픽셀 수를 구합니다. 파란색 채널을 사용하여 필드에 있는 핵의 수를 계산합니다.

이미지에 주석을 달아 개수를 기록하고, 값을 기록하고, 이를 사용하여 세포당 평균 염색 수준을 계산하는 것이 유용할 수 있습니다. 나머지 모든 이미지에 대해 동일한 임계값 설정으로 이 분석을 반복합니다. 샘플을 만들기 위해 추적기는 음파 고슴도치 돌연변이 배아를 염색하는 데 사용되었습니다.

y O tracker는 작고 확산성이 높은 분자 영역이기 때문에 cotus programmed cell death 또는 PCG 후 10.5일에 염색된 전체 배아의 meen 내 깊숙한 곳에서 sonic hedgehog null 돌연변이 배아, 특히 사지 및 기타 영역에서 크게 증가했습니다. 사지 새싹은 전체 패턴을 평가하기 위해 더 높은 배율로 구멍 마운트에서 이미지화되었습니다. 절개된 부분도 진동하는 마이크로톤으로 절단되었습니다.

화살촉은 저온 유지 장치 터널 염색으로 얻은 섹션에서 null 원위 팁의 염색이 증가했음을 가리키며, 이러한 슬라이스에서 OT Tracker와 함께 사용되었지만, lyo tracker와 터널 염색 사이에 엄격한 일대일 상관 관계는 없지만 PCD의 일반적인 영역은 더 높은 배율에서 상당히 겹칩니다. 터널 분석으로 양성으로 염색된 펑크는 볼 수 있지만, 겹치는 염색이 있는 거문고 다이와 펑크로만 염색되는 otra die puncture는 볼 수 없습니다. 배아 배양 10일 후 세포는 뉴런, 근육 세포, 심근 세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화했습니다.

분화된 ES 세포의 정상적인 배양에는 lyo tracker 및 tunnel assay로 검출된 PCD를 거친 세포가 몇 개 있습니다. 다음으로 세포를 과산화수소로 처리하여 산화적 스트레스 세포의 사멸을 유도했습니다. 저용량의 과산화수소는 무처리에 비해 lyo tracker와 tunnel staining을 모두 증가시켰습니다.

배아에서의 결과와 유사하게, 두 염색 모두 공통 세포와 고유 세포로 분류되었습니다. 과산화수소를 고용량으로 투여하면 세포가 수축하고 OT 추적기 및 터널 양성이 더 널리 퍼졌습니다. 비교를 위해, 혈청 결핍은 혈청 결핍 1시간 후 자가포식을 유도하기 위해 사용되었다.

OT 추적기 염색이 증가했습니다. 그러나 터널 양성률은 정상 수준을 유지했습니다. 따라서 reer는 쉽고 유용하지만, 샘플을 정량화한 후 염색이 세포사멸 또는 자가포식을 나타내는지 확인하기 위해 추가 분석을 수행하는 것이 중요합니다.

앞서 시연된 간단한 포토샵 방법을 사용하여 결과적으로, 과산화수소의 농도가 증가하면 리스 트래커 염색 수준이 높아진다는 것이 확인되었습니다. 이 절차를 적절하게 수행하면 이 염색 절차를 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 세포 사멸 유형을 확인하기 위해 NX in five 또는 lc 3 면역 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 현재 Trecker green은 살아있는 세포에서만 작동하므로 Reca red는 고정이 필요한 샘플에 가장 적합한 옵션이라는 것을 잊지 마십시오.