Name: 태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 배우세요 LysoTracker 염색법으로 마우스 배아와 배아 줄기 세포의 프로그램된 세포 사망을 시각화하는 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에서 세포 사멸 패턴을 분석하는 데 활용됩니다.

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우리는 프로토콜을 편집 도움을 Mariani 연구소의 회원 감사드립니다. 이 작품은 CIRM 박사 과정 이수 교육 기금 (JLF), CIRM 다리 인턴쉽 (TZTT), 로버트 E. 5 월 R. 라이트 재단 (FVM), 그리고 남부 캘리포니아 대학 (FVM)에 의해 재정 지원되었다.

1. 마우스 태아의 LysoTracker의 착색 <ol><li> 남성 스터드 케이지에 젊은 (성인 5-6 일주일 정도) 여성을 배치하여 마우스 배아를 생성합니다. 그 결합을 나타내는 질 플러그의 모양에 대한 다음과 같은 아침에 모니터가 발생했습니다. 여성의 임신 인 경우 그 날의 정오에는 0.5 dpc (일 게시물 성교)라고합니다. 여기에 제시된 절차는 배아 7-13 dpc에 이상적입니다. </li><li> 관심 배아 일에 승인 된 프로토콜에 따라 여성을 안락사시켜야과 자궁을 제거합니다. 행크스 BSS (페놀 레드 제외) 10cm 배양 접시에 decidua에서 배아를 제거합니다. 추가 - 배아 세포막을 제거하고 적어도 하나는 관계없는 조직과 혈액을 제거 할 행크스 BSS와 린스 않습니다. </li><li> LysoTracker의 배아 착색 솔루션 (행크스 BSS 5 밀리미터 LysoTracker)를 준비합니다. 1-2 litters을위한 편리한 볼륨은 5 ML입니다. 부드럽게 골고루 염료를 지출 할 수 섞는다. </li><li> LysoTracker의 배아 착색의 Solut에 배아를 추가합니다45 분의 microfuge 튜브 또는 37 ° C에서 유리 병 및 배양에 이온. </li><li> 행크스 BSS에서 매우 부드럽게 네 번, 5 분마다 빨래를 헹굴. </li><li> 밤새 4 % Paraformaldehyde에 해결했습니다. </li><li> 수정 프로그램을 제거 할 행크스 BSS, 10 분에 한 번 씻어. </li><li> 배경 얼룩을 제거 할 수있는 메탄올 시리즈 (50 %, 75 %, 80 %, 100 %, 5 분 각 단계)를 통해 탈수. 이 영상 중에 좋은 신호 대 노이즈를 달성하는 것이 중요합니다. </li><li> 이 시점에서 당신은 빛으로부터 보호, -20 ° C에서 메탄올에 무한정 배아 샘플을 저장할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 조직 샘플은 DNA의 genotyping에 대한 단계에서 촬영 될 수 있지만, 그렇게가이 단계에 대한 모든 샘플 배치 처리 할 수 있도록 단지 저장하기 전에 샘플을 채취하는 것이 가장 편리 할 수 있습니다. 각 배아의 꼬리, 다리, 또는 머리에서 조직 샘플을 수집하고 별도의 튜브에 모두 넣어. 조직 샘플을 Rehydrate하고 genoty 준비핑 (Ping). 2. ES 문화를 차별화 LysoTracker의 착색 <ol><li> 20 μl 드롭 당 500 세포의 시작 밀도 공중 드롭 방법 15을 통해 embryoid 몸을 준비합니다. </li><li> 삼일 후, 10cm 비 점착성의 배양 접시 (세균 작업에 사용되는 즉)에 정지 문화에 embryoid 몸을 전송할 수 있습니다. 미디어마다 2 일 변경 오일에 대한 문화. </li><li> 일 7, gelatinized 8 잘 챔버 슬라이드에 embryoid 기관을 이전 (챔버에 젤리 0.1 %를 추가, 5 분 기다리 제거 및 미디어 추가). 챔버 1-2 embryoid 몸을 전송합니다. </li><li> 매일 미디어를 변경 십일에 대한 문화. embryoid 몸이 유리 표면에 부착 교란하지 할만큼 챔버 슬라이드의 모서리에있는 피펫을 배치 할주의하십시오. 또한 신선한 미디어는 챔버의 모서리에있는 피펫을 넣고 천천히 미디어를 해제 추가 할 때. </li><li> 컬트 10 일 후우레는 긍정적 인 제어로 apoptosis를 유도하기 위해, 0.1 mm와 1.0 mm까지 H 2 O 2와 우물의 일부를 치료 60 분에 (신선한 미디어 믹스에 H 2 O 2를 추가 한 다음 셀에 추가). D-PBS와 일반 미디어 야간 문화와 두 번 씻어. </li><li> 부드럽게 기존의 미디어를 기음과 LysoTracker 셀 착색 솔루션을 (미디어 500 나노 미터 LysoTracker (최종 농도), 챔버 300 μl)를 추가합니다. </li><li> 15 분에 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> D-PBS 2 회, 5 분 각각 두 번 씻어. </li><li> RT에서 15 분에 4 % paraformaldehyde에 고정. </li><li> D-PBS, 5 분으로 두 번 씻어. </li></ol> 3. LysoTracker의 얼룩진의 태아 나 ES의 문화보기 <ol><li> D-PBS를 aspirating하여 현미경의 세포 샘플을 준비하고, 슬라이드에서 챔버를 제거, 공기는​​ 약 5 분 동안 건조, 그리고 수성 설치 매체 (DAPI 또는 이와 유사한과 Vectashield)을 추가. 마르고 동안 호일 장벽을 놓습니다g는 형광의 표백 감소합니다. Vectashield 또는 유사한에서 깊은 우울증 유리 접시 또는 작은 페트리 접시에 배아를 탑재합니다. </li><li> rhodamine 또는 텍사스 레드 필터를 장착 해부 또는 복합 현미경으로 시각화 (LysoTracker RED DND-99 여기 / 방출 : 590분의 577 nm의).에게 얼룩은 일반적으로 매우 밝은 오랫동안 노출은 일반적으로 필요하지 않습니다. </li></ol> 4. 이미징 기술을 사용하여 결과의​​ 정량화 <ol><li> 수동 모드에서 동일한 노출 상황에서 샘플의 디지털 사진을 찍습니다. </li><li> 어도비 포토샵 또는 이와 유사한 이미징 프로그램에서 이미지를 엽니 다. LysoTracker의 착색의 양을 확인하려면 빨간색 채널과 임계 값 붉은 얼룩은 이제 흰색 픽셀로 표시되는 등의 이미지 (검은 색과 흰색으로 이미지를 변환)를 선택합니다. 흰색 픽셀을 선택하고 전체 수를 얻기 위해 히스토그램 기능을 사용하십시오. </li><li> 계산하려면 파란색 채널을 사용하여분야에서 핵의 수. 이 이미지를 주석으로 수의 기록을 유지하는 데 유용 할 수 있습니다. </li><li> 값을 기록하고 세포 당 평균 착색 수준을 계산합니다. 당신은 샘플링하고자하는 모든 이미지에 대해 동일한 임계 값 설정으로이 분석을 반복합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 이러한 소닉 고슴도치 (쉬)와 같은 성장 인자의 유전자가, 16,17을 제거 할 때 변경할 수 배아 발달 동안 PCD의 정상적인 패턴이 있습니다. LysoTracker 매우 diffusible있는 작은 분자 염료이기 때문에, 전체 난자는 mesenchyme 12,13 내도 깊은 PCD의 영역을 평가하는 시각화 할 수 있습니다 그림 1은 정상과 쉬에 대한 LysoTracker의 착색 패턴 표시 -.에서 돌연변이 마우스 배아 - /를 10.5dpc. 특히 다리와 체절 regio에 돌연변이 배아 - / -이 단계에서, PCD은 크게 쉬에 증가NS. 배아의 일부는 전체 패턴을 평가하기 위해 높은 배율 (1B)에서 전체 마운트에 이미징 할 수 있습니다. 해부하는 부분은 진동 마이크로톰 (1C) 또는 더 자세히 PCD 지역을 표시하는 방법으로 그라 이오 스탯 (DF)와 sectioned 수 있습니다. transferase 터미널의 침투가 덜 문제가있는 곳 TUNEL 분석은 가장 얇은 부분으로 이루어집니다. LysoTracker의 착색과 TUNEL 분석은 같은 조직 (그림 1D-G)에서 수행 할 수 있습니다. 이러한 결과는 보여주고 LysoTracker 및 TUNEL의 착색, 상당히 PCD 중복의 일반적인 지역 사이에 엄격한 1시 1분 상관 관계가 있지 않지만. 높은 배율에서, 그것은 puncta를 볼 수 있습니다 그 TUNEL 분석과 긍정적 인 얼룩 아니라 LysoTracker의 LysoTracker의 염료와 만 금방 치료 염료, puncta, 그리고 puncta는 착색을 중복 그게.주세요 EB는 젤라틴 코팅 표면에 도금하는 경우, 차별화 세포는 migrat합니다e는 외부. 문화 10 일 후, 세포는 뉴런, 근육 세포, 그리고 cardiomyocytes 등의 세포 유형의 다양한으로 차별화해야합니다. 그림 2에 표시된 문화가 이러한 세포 유형의 혼합 인구를 포함하지만 하나는 관심의 특정 세포 유형의 PCD 공부하기위한 프로토콜을 적응 수 있습니다. 예를 들어, EB는 뉴런 19 차별화를 향상시킬 수 Retinoic 산성과 치료를 할 수 있으며, 다음 LysoTracker 분석은 서로 다른 조건 하에서 neuronal 세포 사망을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 차별화 된 ES 세포의 정상적인 문화에서 LysoTracker 및 / 또는 TUNEL의 assays (그림 2A)로 PCD 받아야하고 이러한이 감지 할 수있는 몇 가지 세포가 있습니다. PCD는 산화 손상을 유도하고 apoptotic 경로주세요 20,21을 시작 이러한 과산화수소 등 다양한 세포 독성 에이전트의 수 (H 2 O 2)에 의해 유도 할 수 있습니다. H 2 O 2의 저용량 둘 다 증가LysoTracker 및 TUNEL의 착색은, 아니 치료에 비해 세포 수축과 확산 LysoTracker 및 TUNEL의 긍정적에서 다량 결과 동안. 배아의 결과와 마찬가지로, 그것은 puncta를 볼 수 있습니다 그 TUNEL 분석과 긍정적 인 얼룩 아니라 LysoTracker의 LysoTracker의 염료와 만 금방 치료 염료, puncta, 그리고 puncta는 착색을 중복 그게.주세요 apopotosis을 유도 세포 독성 에이전트의 응용 프로그램의 결과는 autophagy (그림 2D)을 유도 혈청 기아 조건에 비교됩니다. 혈청 기아 (1 시간)의 기간을받은 세포는 LysoTracker과 TUNEL 염색법의 높은 상관 관계를하지 않는 다른 패턴을 나타냅니다. LysoTracker의 착색은 많은 치료 문화에 비해 증가하지만 TUNEL의 긍정적는 정상 수준에 있습니다. 어도비 포토샵에서 사용할 수있는 표준 도구 고용 LysoTracker의 착색은 단순 임계 값 방식을 정량화 할 수그 하나는 세포의 인구의 평균 착색 수준을 계산 할 수 있습니다. 그림 3A-B는 샘플 이미지가 정량화 과정에서 보이는 방법을 보여줍니다. 파란색 채널 (패널 3A)에 빨간색 채널 및 DAPI-스테인드 핵의 LysoTracker의 착색있는 기준 이미지를 시작으로,이 이미지의 붉은 채널이 흑백으로 이미지를 변환하고 흰색 픽셀이었습니다 thresholded되었습니다 그런 다음 선택하고 (그림 3A &#39;)시켰다. 임계 값 수준은 LysoTracker의 착색 패턴을 나타낸다는 것을 선정되었습니다. 이미지를 사용하는 정량화 방법과 마찬가지로, 그것은 잠재적으로 오버 강조 차이가 발생할 수 있습니다이로 사진을 overexposing 않도록하는 것이 중요합니다. 분야에서 핵의 수는 다음 갑자기 채널 (그림 3B)에서보고 (그림 3B &#39;) 계산하는 동안 같은 붓으로 그리기 도구를 사용하여 핵을 표시하여 계산 될 수있다. 하나는 일을 표현할 수 있습니다셀 당 얼룩의 평균 수준을 계산하여 착색의 전자 수준 (픽셀 / 핵 카운트 수). 바라던가 높은 통한 놔 검사를 위해이 알고리즘을 사용하면 대부분의 심사 패키지는 특정 채널에 밝기를 측정하고 또한 가장 일반적인 응용 프로그램 수동 방법은 빠른 그러나, 현장에서 핵을 계산하고, 될 개체 식별자 기능을 할 수 있습니다 간단합니다. 예를 제공하기 위해,도 2A-C에서 샘플 지역은 정량 및 결과 확인이 LysoTracker의 착색 높은 수준의 (그림 3C)에 H 2 O 2 결과의 농도를 증가시킨다.되었습니다 <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. / - - 배아 정상과 쉬의 LysoTracker의 착색. A, A &#39;보통과 쉬 -. / - LysoTracker 레드 물들 10.5 dpc,에서 마우스 배아는 Vectashield에 장착하고 아래 사진epiflourescence는 현미경을 해부. 괄호는 forelimbs의 위치를 나타냅니다 B, B &#39;정상과 쉬의 Forelimb -.. / - 배아는 높은 배율의 이미징. &#39;뒤 괴사 지대&#39;(별표로 표시)과 사지 꽃 봉오리 (화살표로 표시)의 근위 mesenchyme의 지역을 포함한 세포 죽음의 정상적인 도메인을 확인합니다. 쉬 수혜 사지 안쪽과 말초 부분에 강한 얼룩을 전시 정상과 널을 모두 사지 봉오리의 forelimb 꽃 봉오리를 통해. C, C &#39;. 중간 섹션을 제공합니다. 널 사지 꽃 봉오리에서 정상 사지 봉오리 등쪽과 복부 및 말초 mesenchyme 내에서 강한 착색의 근위 mesenchyme (화살표)와 AER (화살촉)에 착색의 존재를 확인합니다. DF. 같은 섹션 (12 미크론, 냉동 섹션) LysoTracker과 TUNEL의 착색 (로슈 1684795)에 대한 이미징되었습니다. 섹션 쉬 널 mesenc의 말초 부분을 통과hyme. AER에 화살촉을 가리 킵니다. 전체 패턴이 두 방법을 사용하여 매우 비슷 얼마나 참고 그러나 착색이 완전히 중복되지 않습니다. G, G &#39;가. AER과 mesenchyme 높은 배율에서, 하나는 LysoTracker 또는 TUNEL - 긍정적 인 puncta의 존재를 모두 볼 수 있습니다 만뿐만 아니라 puncta으로 착색을 중복는데. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 차별화 된 ES 세포의 LysoTracker의 착색. ​​세포를 차별화는 난생의 부재에 8 챔버 슬라이드에 도금되었습니다. autophagy 경로는 혈청 기아 1 시간을 사용하여 유도 동안 LysoTracker과 TUNEL 염색법의 비교 방법을 표시하려면, apoptosis 경로는 H 2 O 2 개 중 2 개의 다른 복용을 유도했습니다. 이 이미지는 Zeiss LSM5 공 촛점 현미경으로 촬영 된 A- &#39;:. LysoT로 표시로 치료 문화는 몇 가지 일반적인 apoptosis를 보여racker 및 TUNEL의 착색. 대부분 두 기술 중복 (흰색 화살표)를 사용하여 패턴 그러나, 한 LysoTracker 만 긍정적 인 (빨간색 화살표)입니다 몇 puncta을 볼 수 B-B &#39;, CC &quot;. H 2 증가 양의 치료를 O 2는 apoptosis를 촉진 . 낮은 복용량보다 LysoTracker 및 치료 세포에 비해 TUNEL 긍정적 인 puncta을 보여줍니다. 높은 용량을 더욱 LysoTracker과 TUNEL 긍정적 인 puncta에 유도한다. 흰색 화살표 지점 중복 착색에 만 LysoTracker에 양성 반응이 그 puncta에 빨간색 화살표가 점하는 동안. 이 TUNEL의 착색 (녹색 화살표) 만 긍정적 인 puncta를 볼 수도 있습니다 DD &quot;. 세럼 기아는 리소좀과 autophagolysosomes의 자료 축적을 자극 할 수있는 autophagy를 유도 할 수 있습니다. 치료 문화에 비해 볼 수 있습니다 얼마나 많은 LysoTracker의 puncta합니다. TUNEL 긍정적 인 puncta이 존재 (이 대부분 LysoTracker는 얼룩 중복ING, 흰색 화살표)는 그러나, 그 수는 치료 조건에 비해 크게 증가하지 않습니다. 또한, 혈청 기아 조건 하에서, LysoTracker 전용 긍정적 puncta은 매우 유행 아르 (빨간색 화살표). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 어도비 포토샵을 사용하여 세포의 인구에 얼룩의 수준을 평가하는 정량화 방법. A : 그림 2A의 부분은 선택했고 LysoTracker (적색 채널) 및 DAPI의 얼룩은 (핵, 파랑 채널)이 패널에 표시됩니다 A &#39;:. 그림 3A의 붉은 채널은 검은 색과로 변환 thresholded되었습니다 이미지 흰색. 흰색 픽셀는 선택하고 히스토그램 함수를 사용하여 계산 될 수 B-B &#39;:. 파란색 채널은 핵을 보여줍니다 그들을 계산하는 동안 이미지는 붓으로 그리기 기능을 사용하여 주석을 추가 할 수 있습니다 C :.이가 전합니다패널 2A-C에서 샘플의 충분한 양을 정함. 데이터는 핵 당 픽셀로 표현되는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

apoptosis의 중요한 특징은 caspase 활동의 검출과 함께 TUNEL 분석과 DNA 손상의 검출 (mAbs 또는 ZVAD-fmk으로 구속력 분자를 감​​지), 세포 변화의 관찰, 그리고 phosphatidylserine의 표현 (PS를 포함 막 표면에) (Annexin V 구속력을 감지). 이러한 assays의 각 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, TUNEL 분석에 사용 transferase 터미널은 몇 세포 층 이상 침투하지 않습니다. 또한 Annexin V는 막 손상 (Annexin V는 세포 안으로 숨는 내부 전단지에 PS를 표시)가있는 것으로 apoptosis를 겪고되지 않은 셀을 표시 할 수 있습니다. 또한 caspase의 assays는 apoptosis에 연결되어 있지 않습니다 caspase 활동을 감지 할 수 있습니다. LysoTracker이 assays를 대체 할 수 없습니다, 그러나 그것은 상황에 따라 유용한 보완 분석 할 수 있습니다. Lyso...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td></td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> LysoTracker 레드 DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Cellgro </td><td> 25-025 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate </td><td> Cellgro </td><td> 25-000 - CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> 펜 패 혈성 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> B-메르 캅토 에탄올, 50 MM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> LabTek-II 상공 회의소 슬라이드 (8도) </td><td> Nalge Nunc 인터내셔널 </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> 젤리 0.1 % </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 PBS (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 요리법 4 % Paraformaldehyde 100 ML는 다음과 같습니다 <ol><li> 4g의 paraformaldehyde, 90 ML H 2 O와 NaOH를 (2N NaOH의 드롭) 섞는다. 당신은 pH를 높이기 위해 몇 가지 NaOH를 추가 할 때까지 paraformaldehyde이 솔루션으로 이동하지 않습니다. </li><li> 60 저어와 열 ° C 모든 가루가 솔루션 (~ 10-20 분)에까지. 과열하지 마십시오. </li><li> 100 ML의 최종 볼륨을 달성하기 위해 ~ 10 ML 10X PBS를 추가합니다. </li><li> 편리 (~ 10 ML 또는 ~ 40 ML) aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. </li></ol> 경고 : &#39;주름&#39;양식 (작은 알약을 압축)에서 Paraformaldehyde이 덜 가루이며, 따라서 후드의 외부 측정 할 수 있습니다. 하지만 당신은 여전히 보호 먼지 마스크 (N95를 착용해야합니다이상) 처리하는 동안. EB 문화 미디어 500 ML EB 미디어를 들면 : <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM : </td><td> 404.5 ML </td></tr><tr><td> FBS : </td><td> 75.0 ML </td></tr><tr><td> L-글루타민 : </td><td> 5.0 ML </td></tr><tr><td> 페니실린은 / 스트렙토 마이신 : </td><td> 5.0 ML </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 : </td><td> 5.0 ML </td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate : </td><td> 5.0 ML </td></tr><tr><td> β-메르 캅토 에탄올 : </td><td> 500μl </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 lysotracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

프로그래밍 세포 죽음 (PCD)는 일반 조직 항상성을 유지하고 embryological 개발하는 동안 조직과 장기 1,2,6,7를 형성하기 위해 성인에서 발생합니다. 개발하는 동안 독성 화학 물질이나 유전자 변이가 PCD 증가 시키거나 발달 이상이나 기형아 출산은 3-5의 결과 PCD 패턴을 변경할 수 있습니다. 이러한 결함의 병인을 이해하기 위해서는 배아의 연구는 배아 줄기 (ES) 세포를 차별화 사용하는 체외 assays에 구비 할 수 있습니다. Apoptosis는 caspase 효소 폭포를 활성화 신호 고유와 외부를 모두 포함 PCD의 잘 공부 형태입니다. 특성 세포 변화가 막 blebbing, 원자력 축소, 그리고 DNA의 조각이 포함되어 있습니다. PCD의 다른 형태의 caspase 활성화를 포함하지 않고 장시간 autophagy의 최종 결과 일 수 있습니다. 상관없이 PCD 경로의, 죽어가는 세포를 제거해야합니다. 성인에서 면역 세포 완벽하게태아에 면역 체계가 아직 발달되지 않은 곳, 제거 다른 메커니즘에 의해 발생하는 동안이 기능을 ORM. 이 메커니즘은에 복용 이웃 세포를 ( &quot;비 전문 phagocytes&quot;)를 포함 phagocytic 역할들이 죽어 셀 빨아들이다 그것에게 8-10를의 표면에 신호 &#39;내 식사&#39;를 인식하고 있습니다. engulfment 후, 그 잔해가 저하의 lysosome로 이동합니다. 따라서 관계없이 PCD 메커니즘, lysosomal 활동의 증가는 증가 세포 죽음과 상관 될 수 있습니다. PCD, 두꺼운 조직 및 다층 차별화의 문화권에서 리소좀을 시각화하는 간단한 분석을 공부하려면 유용 할 수 있습니다. LysoTracker의 염료는 lysosome 11-13로 산성 subcellular 구획에서 유지되는 높은 가용성 작은 분자이다. 염료는 확산 의해 순환 통해 이루어집니다. 침투는 두꺼운 조직 및 멀티 레이어 문화에 PCD의 방해, 시각화 아니므로 12,13 수 있습니다 </&gt;를 논의하게 될 것입니다. 절차는 단말기의 입력 / 투자율이 transferase 필요하기 때문에 반대로, TUNEL (터미널 deoxynucleotidyl transferase dUTP 닉 최종 라벨) 분석 14, 작은 샘플, 조직 학적 부분, 그리고 monolayer 문화로 제한됩니다. diffuses 및 용매에 의해 용해되어 아닐린 블루, 대조적으로, LysoTracker 레드 DND-99은 고칠 밝고 안정적​​입니다. 착색는 전체 마운트 또는 수성이나 솔벤트 기반의 설치 미디어 12,13를 사용하여 섹션의 표준 형광 또는 공 촛점 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. 여기 정상과 음속의 고슴도치 널 마우스 배아에서 PCD 볼이 염료를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 ES 세포의 문화를 차별화의 PCD의 분석을 보여줍니다 및 간단한 정량화 방법을 제시한다. 요약하면, LysoTracker의 착색은 PCD을 검출 다른 방법에 큰 보완 할 수 있습니다.

우리는 마우스 배아의 프로그래밍 세포 죽음의 영역 (PCD)와 LysoTracker라는 높은 가용성 염료를 사용하여 배아 줄기 (ES) 세포 문화를 차별화를 시각화하는 간단한 프로토콜을 제시한다.

태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

프로그래밍된 세포 사멸(Programmed cell death, PCD)은 성인의 정상적인 조직 항상성을 유지하기 위해, 그리고 배아 발달 과정에서 조직의 형태를 형성하고...

다음 절차의 목적은 세포 사멸 패턴을 감지하기 위해 LysoTracker 염료를 사용하여 두 가지 유형의 시료인 생쥐 배아와 분화된 줄기세포의 리소좀을 유지하는 방법을 시연하는 것입니다. 배아 시료를 준비하려면, 먼저 배아를 외과적으로 분리하여 배양 접시에 넣고 분화된 세포를 준비합니다. 배아 체형을 만들기 위해 배아줄기세포가 사용됩니다.이 배아체들은 부유 배양된 후 챔버 슬라이드 위에서 단층으로 성장시킵니다. 단층으로 배양된 모든 배아를 LysoTracker Red로 인큐베이션한 후 세척하고 고정합니다. 이후 샘플을 촬영하여 LysoTracker 염색 결과를 확인하고 정량화합니다. 염색은 배아 및 배양 세포에서 프로그램된 세포 사멸을 분석하는 데 사용할 수 있는 간단한 절차입니다.터널 분석(tunnel analysis)과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 OT 추적 염료가 저분자 물질이기 때문에 두꺼운 조직을 빠르고 쉽게 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 마우스 배아 및 분화 배양액의 프로그램된 세포 사멸 패턴에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 닭 배아 및 분화 중인 성체 줄기세포와 같은 다른 조직 유형에도 적용할 수 있습니다. 젊은 암컷 마우스를 수컷 마우스와 짝지어 주고, 다음 날 아침마다 질전(vaginal plug)이 있는지 확인하여 교배 여부를 판단합니다.질전(vaginal plug)이 관찰된 날의 정오를 실질적인 0.5일로 간주합니다. 관심 있는 배아일(embryonic day)의 교배 후, 승인된 프로토콜에 따라 암컷을 안락사시키고 자궁을 Hank's BSS가 담긴 10cm 페트리 접시로 옮겨 혈액을 씻어냅니다. 배아들을 분리하여 자궁에서 꺼냅니다.여분의 배아 막을 제거하고 Hank's BSS로 최소 한 번 헹구어 불필요한 조직과 혈액을 제거합니다. 세척하는 동안 해부한 배아를 얼음 위에 보관하십시오. 나머지 부분도 동일하게 처리합니다.5 mL의 Liso tracker 배아 염색 용액을 준비합니다. 이 양은 한두 번의 배아 수집에 충분한 부피입니다. 용액을 부드럽게 섞어 염료를 균일하게 분산시킨 후, 배아를 용액으로 옮겨 37 °C에서 45분 동안 배양합니다.배양 후, 배아를 Hank's BSS로 5분씩 4회 조심스럽게 헹굽니다. 조직이 손상되지 않도록 부드럽게 헹구는 것이 중요합니다. 섬세한 배아의 위치를 세심하게 살피며 액체를 천천히 제거하되, 배아를 덮을 수 있도록 항상 소량의 액체를 남겨두십시오.그 후 다음 날 4% para formaldehyde에서 배아를 하룻밤 동안 고정합니다. 고정액을 제거하기 위해 Hank's BSS로 배아를 10분 동안 한 번 헹굽니다. 이제 배경 염색을 제거하기 위해 메탄올 시리즈를 통해 조직을 탈수시킵니다.이 단계는 보관 전 영상 촬영 시 신호 대 잡음비를 향상시킵니다. 필요한 경우, 유전자 분석을 위해 각 배아에서 조직 샘플을 채취하십시오. 이후, 유전자형 분석 전에 조직 샘플을 재수화하십시오.배아를 조직 샘플과 일치하는 라벨이 부착된 개별 튜브에 나누어 담습니다. 이제 분리된 배아를 -20 °C의 메탄올에 넣어 무기한 보관할 수 있습니다. 차광 보관하십시오.먼저 행잉 드롭(hanging drop)법을 통해 배아체(embryo bodies)를 준비합니다. 20 µL 드롭당 500 cells의 초기 밀도로 3일간 배양한 후, 배아체를 10 cm 비부착성 페트리 접시의 현탁 배양액으로 옮깁니다. 이를 5일 동안 배양하며, 5일 이후부터는 2일마다 배지를 교체합니다.배아 몸체를 젤라틴 처리된 8챔버 슬라이드로 옮기고, 각 챔버에 배아 몸체를 하나 또는 두 개씩 배치합니다. 배아 몸체를 10일 동안 더 배양합니다. 10일 후 이틀마다 배지를 교체하며, 기존 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거한 후 각 챔버에 300 µL의 Lyo tracker 세포 염색 용액을 첨가합니다.피펫 팁을 챔버의 구석에 위치시켜 배지를 수동으로 조심스럽게 파이펫팅하여 제거하십시오. 이렇게 하면 유리 표면에 여전히 부착되어 있는 개체들을 실수로 제거하지 않을 수 있습니다. 배지를 다시 추가할 때도 피펫 팁을 챔버 구석에 두고 배지를 매우 천천히 추가하십시오.챔버를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그 다음 DPBS로 5분씩 두 번 헹굽니다. 이제 실온에서 4% paraldehyde로 15분 동안 세포를 고정합니다.그 다음 DPBS를 사용하여 5분씩 두 번 헹궈 고정액을 제거합니다. 배아를 마운팅하려면, 배아를 깊은 홈이 있는 유리 슬라이드나 작은 페트리 접시 인펙터 쉴드(infector shield)에 넣습니다. DPBS를 흡입하여 제거함으로써 세포 샘플을 현미경 관찰이 가능하도록 준비합니다.슬라이드에서 챔버를 제거하고 약 5분 동안 자연 건조시킵니다. 형광 물질을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 그런 다음 DAPI가 포함된 Vector Shield와 같은 수성 마운팅 매질을 첨가하고 그 위에 커버슬립을 덮습니다.이제 슬라이드 마운팅이 완료되어 이미지 촬영 준비가 되었습니다. Rodamine 또는 Texas red 필터가 장착된 실체 현미경이나 복합 현미경으로 시료를 관찰하십시오. 염색 상태가 보통 매우 밝으므로, 수동 모드에서는 긴 노출 시간이 일반적으로 필요하지 않습니다.모든 샘플을 동일한 노출 조건에서 디지털 사진으로 촬영합니다. 이미지를 정량화하려면 Adobe Photoshop 또는 이와 유사한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 사진을 엽니다. lyo tracker 염색 정도를 결정하려면 레드 채널을 선택합니다.히스토그램 기능을 통해 확인된 전체 이미지의 픽셀 수를 기록하십시오. 다음으로, 적색 염색 부위가 흰색 픽셀로 표시되도록 이미지를 임계 처리(threshold)합니다. 이 과정을 통해 이미지가 흑백으로 변환됩니다.임계값 수준을 설정하고 세트 내의 모든 이미지에 이 수준을 적용하십시오. 색상 범위 도구를 사용하여 흰색 픽셀을 선택하고, 히스토그램 기능을 사용하여 전체 흰색 픽셀 수를 구하십시오. 청색 채널을 사용하여 시야 내의 핵 수를 계산하십시오.이미지에 주석을 달아 세포 수를 기록하고, 해당 값을 기록한 뒤 이를 사용하여 세포당 평균 염색 수준을 계산하는 것이 유용할 수 있습니다. 나머지 모든 이미지에 대해 동일한 임계값 설정을 적용하여 이 분석을 반복하십시오. 샘플링을 위해 LysoTracker를 사용하여 sonic hedgehog 돌연변이 배아를 염색하였습니다.ly O tracker는 크기가 작고 확산성이 높은 분자이므로, 교배 후 10.5일에 염색된 전체 배아의 심부 영역을 관찰하였습니다. 그 결과, sonic hedgehog 결핍 돌연변이 배아에서 프로그램된 세포 사멸(PCD)이 크게 증가하였으며, 특히 사지 및 체절 영역에서 두드러지게 나타났습니다. 전체적인 패턴을 평가하기 위해 사지 싹(limb buds)을 고배율로 홀 마운트(whole mount) 이미징 하였으며, 적출된 일부 부위는 진동 마이크로톰(vibrating microtome)을 이용하여 절편을 제작하였습니다.화살표는 크라이오스탯(cryostat)으로 얻은 절편에서 sonic hedgehog null 원위단(distal tip)의 TUNEL 염색 증가를 가리킵니다. 이 절편들에서는 OT Tracker와 TUNEL 염색을 병행하여 사용하였으며, LysoTracker와 TUNEL 염색 사이에 엄격한 일대일 상관관계가 있는 것은 아니나, 고배율에서 PCD가 발생하는 일반적인 영역이 상당 부분 겹칩니다. TUNEL 분석에서 양성으로 염색된 세포, LysoTracker로만 염색된 세포, 그리고 두 염색이 중첩되어 나타나는 세포를 모두 확인할 수 있습니다. 10일간의 배아 체내 배양 후, 세포들은 뉴런, 근육 세포, 심근세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화되었습니다.분화된 ES 세포의 일반 배양에서는 lyo tracker 및 tunnel 분석으로 검출되는 소수의 PCD 발생 세포들이 관찰됩니다. 다음으로, 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸을 유도하기 위해 세포에 과산화수소를 처리하였습니다. 과산화수소를 저농도로 처리했을 때, 처리하지 않은 경우와 비교하여 lyo tracker 및 tunnel 염색이 모두 증가하였습니다.배아에서의 결과와 유사하게, 두 가지 염색 모두 공통 세포와 고유 세포를 표지하였습니다. 고농도의 과산화수소 처리는 세포 수축을 유발했으며, OT 트래커와 tunnel 양성 반응이 더 광범위하게 나타났습니다. 비교를 위해, 1시간의 혈청 기아 상태를 통해 자가포식을 유도하였습니다.OT tracker 염색이 증가하였습니다. 하지만 tunnel 양성 반응은 정상 수준을 유지하였습니다. 따라서 reer은 간편하고 유용하지만, 샘플 정량 후 해당 염색이 세포사멸(apoptosis)을 나타내는지 아니면 자가포식(autophagy)을 나타내는지 결정하기 위해 추가 분석으로 후속 확인을 하는 것이 중요합니다.앞서 시연한 간단한 Photoshop 방법을 사용하여 분석한 결과, 과산화수소의 농도가 증가할수록 Lysotracker 염색 수준이 더 높아지는 것이 확인되었습니다. 이 염색 절차를 숙달하고 적절히 수행한다면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후, 세포 사멸의 유형을 확인하기 위해 Annexin V 또는 LC3 면역 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 현재 Tracker Green은 살아있는 세포에서만 작동하므로, 고정이 필요한 시료에는 Track Red가 가장 적합한 선택지라는 점에 유의하십시오.

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