마우스의 재발 포진 성 각막염 Stromal, 인간 HSK 유학을위한 모델

이 실험 절차의 전반적인 목적은 재발성 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 감염을 연구하는 것입니다. 우선 마우스의 각막 손상 없이 잠복 감염이 되도록 감염시킨 후, 잠복 상태가 완전히 확립되면 다음 단계로 UVB 광선에 노출시켜 바이러스를 재활성화합니다. 마지막 단계에서는 눈물막을 수집하여 바이러스 배출을 검출하고, 이후 최소 5주 동안 마우스를 관찰하며 질병 경과를 모니터링합니다.

최종적으로, 마우스에서 발생하는 질병의 정도는 헤르페스성 기질 각막염(Herpetic stromal keratitis)의 질환 점수 평가를 통해 측정할 수 있습니다. 이는 전 세계적으로 많은 사람에게 영향을 미치는 질병입니다. 특히 이 질환은 감염성 실명의 주요 원인 중 하나입니다.

저희는 이 특정 질환을 모사하기 위해 마우스 모델을 사용하고 있습니다. 이 질환을 모사할 수 있는 다른 모델들도 존재하지만, 저희는 이 모델이 해당 질환을 가장 잘 나타낸다고 판단합니다. 오늘 잠시 시간을 내어 이 영상에 등장할 분들을 소개해 드리겠습니다.

지난 몇 달 동안 저와 함께 일해 온 Chloe입니다. 이쪽은 실험실에서 근무 중인 하계 학생 Nippo입니다. T 150 플라스크에서 Vero 세포에 HSV one을 3~4일 동안 배양하여 80% confluence에 도달하게 하여 실험을 시작하십시오.

이 시점이면 세포들이 둥글게 말려 올라와 플라스크를 가볍게 쳐주는 것만으로도 쉽게 떨어져 나올 것입니다. 세포 현탁액을 멸균된 50 milliliter 원추형 튜브로 옮긴 후, 15분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킵니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 1,510 ×g로 설정하십시오.

다음으로, 상층액을 50 milliliter 멸균 oak ridge 튜브로 옮기고, 총 5 milliliter의 배지를 각 원뿔형 튜브에 나누어 넣어 재현탁합니다. 큰 펠렛을 현탁시킨 후, 재현탁된 펠렛을 1/32초 간격의 버스트로 2회, 총 1분 동안 초음파 처리합니다. 고속 바닥 원심분리기로 상층액을 원심분리하면 작은 바이러스 펠렛이 생성됩니다.

상층액을 버린 후, 소량의 바이러스 펠릿과 함께 침전물을 혼합하고 45초 동안 다시 초음파 처리합니다. 이제 벤치탑 원심분리기를 사용하여 초음파 처리된 세포 및 바이러스 용액을 280 ×g, 4°C에서 5분 동안 다시 원심분리한 다음, 상층액을 분주하여 -70°C에서 바이러스 스톡으로 보관하거나 타이터 플레이트에 사용합니다.

바이러스 스톡 상청액으로부터 10⁰에서 10⁻⁸까지 10배 단계 희석한 바이러스를, 12웰 멸균 플레이트에 담긴 Vero 세포의 두 가지 서로 다른 희석 세트에 각각 두 번씩 처리합니다. 마우스를 마취시켜 감염 절차를 시작합니다. 바이러스가 흡수될 수 있도록 마우스가 깨어나기 전까지 20분에서 30분 동안 완전히 마취된 상태를 유지해야 합니다.

그런 다음 해부 현미경 하에서 30게이지 바늘을 사용하여 오른쪽 눈의 각막에 긁힘 상처를 냅니다. 이제 이어펀치로 동물을 식별하여 번호를 매깁니다. 다음으로, 일차 감염 동안 각막 손상을 방지하기 위해 쥐에게 1 mL의 혼합 인체 혈청을 주입합니다.

그 다음, 20 µL 피펫을 사용하여 10⁶ PFU의 바이러스를 긁힌 눈에 감염시키고, 동물 마취 상태에서 감염 여부를 확인하는 동안 다른 쪽 눈이 건조해지지 않도록 HBSS 5 µL를 넣어줍니다. 멸균 면봉에 Vero 배지 1 mL를 적십니다. 감염 3일 후, 해당 면봉으로 감염된 눈을 닦아낸 다음, 스왑한 배지 100 µL를 1차 감염 후 최소 5주 동안 48-well 플레이트에서 배양한 Vero 세포에 접종합니다.

방금 보여드린 것과 같이 마취된 마우스의 감염된 눈을 면봉으로 닦아냅니다. 자발적인 눈깜박임에 의한 변수를 제어하기 위해 48웰 플레이트 뚜껑에 면봉 채취일을 0일차로 표시합니다. 그런 다음 마우스를 피크 파장이 302 nanometers인 UVB를 방출할 수 있는 트랜스일루미네이터(transluminator)에 배치하여 한쪽 눈만 UVB 광선에 노출되도록 하고, cm²당 250 millijoules의 UVB 광선을 조사합니다.

그 후 1일부터 7일까지 매일 눈을 면봉으로 닦아냅니다. 감염성 바이러스가 포함된 면봉의 경우, UVB 조사 후 12-well 플레이트를 이용한 표준 플라크 분석법(plaque assay)으로 바이러스 양을 측정하여 마우스의 임상적 안구 질환 여부를 평가합니다. 마우스를 이안식 해부 현미경 아래에 배치합니다.

각막 혼탁도는 0에서 4까지의 척도로 평가하며, 0은 투명한 실질, 1은 경미한 실질 혼탁을 나타냅니다. 2는 홍채가 식별 가능한 수준의 중간 정도의 혼탁을 나타냅니다. 3은 동공 가장자리를 제외하고 정의된 홍채 세부 구조가 소실된 심한 혼탁을 나타내며, 4는 후방 관찰이 불가능한 전체 혼탁을 나타냅니다.

신생혈관형성은 각막을 4개의 동일한 사분면으로 나누고 각 사분면의 혈관 형성 정도를 결정하여 1에서 8까지의 척도로 평가합니다. 첫 번째 그림에서, 잠복 감염된 마우스의 바이러스 재활성화를 위해 UVB 조사를 유도한 후 35일 동안 각막 혼탁도를 모니터링하였습니다. 이 데이터는 암컷 C 57 black six 마우스에서 14일에서 35일 사이에 바이러스 유도 질환이 유의하게 더 많이 나타났으며, 이에 따라 수컷 C 57 black six 마우스가 암컷 C 57 black six 마우스보다 각막 혼탁도가 유의하게 낮음을 보여줍니다.

마찬가지로, 동일한 실험 조건에서 각막 신생혈관 형성을 평가했을 때 수컷 마우스는 암컷 마우스보다 각막의 신생혈관 성장이 유의하게 적게 나타났으며, 다시 한번 14일에서 28일 사이에 암컷 C 57 black six 마우스에서 바이러스로 유도된 질환이 유의하게 더 심하게 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때, 마우스가 20분에서 30분 동안 수면 상태를 유지할 수 있도록 완전히 마취시키는 것을 잊지 마십시오. 이 영상을 통해 이 인간 질환을 연구하기 위한 재발성 기질 각막염 마우스 모델의 사용법을 이해하셨기를 바랍니다.