Name: 손쥐 모델에서 창자의 조직 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 배우세요 손쥐에서 조직 공학적 소장 생성 기법을 오가노이드 단위-스캐폴드 방식으로. 이 방법은 장 재생 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

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트레이시 C. Grikscheit, 에릭 R. Barthel, 그리고 글쓴이 G. 살라은 캘리포니아 재생 의료 연구소 (CIRM), 교부금 번호 RN2 - 00946-1 (TCG)과 TG2-01168 (ERB, FGS)에 의해 지원됩니다. 앨리슨 L. Speer은 대학 외과 전문의 Ethicon 학자의 사회입니다. Yashuhiro Torashima는 어린이 병원 로스 앤젤레스 Saban 연구소 연구 경력 개발 친목으로 운용되고 있습니다.

1. Organoid 단위 준비 <ol><li> 마우스 해부 (가위와 집게)에 적합한 악기 압력솥의 소독을해야합니다. </li><li> 편안하게 지역 IACUC 프로토콜에 따라 기증자 마우스를 안락사시켜야. 동물이하기 전에 죽은 있는지 확인합니다. </li><li> 복막 캐비티에 액세스 할 수있는 중간 선 절개를합니다. 노출을 개선하기 위해 필요에 따라 피부 플랩이 반영 될 수 있습니다. </li><li> 작은 창자를 창자를 빼내다와 Treitz의 인대에 단지 말초을 나눕니다. 샤프하고 부드러운 무딘 절개를 사용하여 장간막에서 작은 창자를 분리합니다. ileocecal 접합을 파악하고 이에 대한 근위 작은 창자 5mm를 나눕니다. </li><li> 가위를 사용하면 (Invitrogen, 안티 - 안티) 10 ML 4 ° C, 멸균 행크스 &#39;버퍼 생리 (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X 항생제 - 항 곰팡이를 배양 접시에있는 antimesenteric 국경을 따라 길이 솔루션을 장을 엽니 다. 로 연 장에서 대변을 해제합니다부드러운 교반 한 다음 10 4의 ML ° C, 멸균 HBSS / 1X 안티 - 안티을 15ml 원심 분리기 튜브로 열린 장을 전송하기 만하면됩니다. </li><li> 4 10 ML에 열려있는 장을 세 번 씻어 ° C, 테스트 튜브에 안티 - 안티 살균 HBSS / 1X. 각 세척은 30 초에 15 ML 튜브의 약한 흔들림을 수행 할 수 있습니다. 진동 후, 장 조직은 관의 바닥에 가라. 중간 엽 파편이 부동 물질을 폐기하십시오. pipet을주의 깊게 세척 솔루션을 제거합니다. </li><li> 4 10 ML과 배양 접시에있는 세탁 장을 이기다 ° C, 멸균 HBSS / 가위를 사용하여보다 1mm 제곱 조각에 1X 안티 - 안티. 자동 pipet으로 다진 자료를 수집하고 테스트 튜브에 넣습니다. </li><li> 8 분 500 rpm으로 튜브를 원심 분리기. 뚱뚱하고 mesenchyme 포함되어있는 표면에 뜨는을 폐기하십시오. </li><li> 멸균 HBSS / 1X 안티 - 안티 플러스 0.125 MG / ML dispase (Invitrogen) 및 800 단위 / m의 10 ML과 다진, 씻은 자료를 소화리터 collagenase 타입 1 (워싱턴, 레이크 우드 NJ). 소화 솔루션의 40 ML를 준비하려면 dispase, collagenase의 142 밀리그램의 5 밀리그램을 무게, 40 ML의 볼륨으로 살균 HBSS를 추가 할 수 있습니다. 갓 때마다 organoid 단위 준비가되어이 솔루션을 준비하고, 사용하기 4에 ° C까지 준비해 놓아요. 단계 1.8에서 직접 펠릿으로 소화 솔루션을 추가합니다. </li><li> 20 분에 37 ° C에서 소화 솔루션과 다진, 씻은 재료를 포함하는 테스트 튜브를 품다. </li><li> 테스트 튜브를 검색하여 추가로 10 ML의 pipet으로 분쇄하여 소화 조직을 중단. 균일 한 모양을 얻을 때까지 20-50 시간 사이에 반복합니다. </li><li> 800 rpm으로 5 분 동안 테스트 튜브를 원심 분리기. 하나의 셀을 포함하는 표면에 뜨는을 폐기하십시오. </li><li> 4 ° C, 멸균 Dulbecco의 수정 된 이글 중간 (DMEM, Invitrogen) 플러스 10% 브이 / v 열 inactivated 태아 소 혈청 (HI-FBS, Invitrogen)의 10 ML과 소화 반응을 중지합니다. pelle을 Resuspendt와 튜브를 흔들. </li><li> 800 rpm으로 5 분 동안 테스트 튜브를 원심 분리기. 마지막 몇 방울까지 자동 pipet으로 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 resuspending 방지하기 위해 지난 몇 방울을위한 일회용 플라스틱 pipet을 사용합니다. </li></ol> 2. Polyglycolic 산성 발판으로로드 <ol><li> 로 참조에 설명, nonwoven polyglycolic 산 (다공성&gt; 95 %, Concordia는 섬유, 코번 트리의 RI 2 mm 시트의 두께, 60 MG cm-3 벌크 밀도)에서 양식 2 mm 길이 5 mm 외경 원통 공사장 공중 발판. 4. </li><li> 증류수에 70 % 에탄올로 만든 가위로 팁을 일회용 1000 마이크로 리터의 pipet의 말초 2mm를 잘라. </li><li> 4 잘 문화 판에 비계를 놓으십시오. 처음 루멘으로하고 바깥 쪽 표면에, 1000 마이크로 리터의 pipet으로 발판 위에 organoid 단위를로드합니다. 루멘의 코팅을 보장하기 위해 집게를 사용하십시오. 중단 또는 폴리머의 원통형 모양을 깨뜨하지 마십시오. </리&gt; </ol> 3. 호스트 마우스에 주입 <ol><li> 기증자 가능한 경우와 같은 배경 syngeneic 호스트 마우스를 사용합니다. 그렇지 않으면, 면역 저하 nonobese의 당뇨병 환자 (잭슨 연구소, 새크라멘토 CA) 동물 / 심한 결합 immunodeficient 또는 NOD / SCID를 사용합니다. </li><li> isoflurane과 전신 마취를 유도. , 사립를 면도하고 마우스의 복부를 내리면 t. </li><li> 복막 캐비티에 입학을 얻기 위해 5mm 중간 선 절개를합니다. 확인하고 조심스럽게 큰 omentum을 골자를 빼 버리다. omentum로로드 된 폴리머를 배치하고 조직과 함께 포장. omentum을 찢어하지 마십시오. </li><li> 5-0 monocryl의 봉합과 함께 omentum에 폴리머를 고정합니다. 부드럽게의 해부학 위치로 포장 폴리머로 omentum를 교체하십시오. </li><li> 4-0 vicryl 봉합을 사용하여 레이어의 복부 절개를 닫습니다. 근육 폐쇄를 실행하고 절개 아래 복부 내장을 손상하지 돌. 피부 중단 봉합을 사용하여. </li><li> 절개에 인접 피하 wheal으로 멸균 물에 2 밀리그램 / kg 케토 프로 펜 (Ketofen, 포트 닷지 동물 건강)와 수술 후 진통제를 관리 할 수​​ 있습니다. 동물은 매일 평가해야하고 동물이 통증이나 고통의 흔적을 보여주는 경우 케토 프로 펜의 추가 투여는 수술 후 2 일에 실시 될 수 있습니다. 세 번째 수술 일까지, 동물 완전히 통증이나 고통의 증거도없이 복구 할 수 있어야합니다. 통증이나 고통이 포스트 수술 일 3 지속되면, 이것은 비정상적인 것으로 간주되고 IACUC과 동물 보호 시설 프로토콜에 따라 해결해야합니다. </li><li> 회복 할 수있는 마우스와 조직 - 엔지니어링 소장은 4 주 동안 성장 할 수 있습니다. 쥐 수유 (랩 다이어트 5001, PMI 영양, 세인트 루이스 MO) 5 ML (하이테크 Pharmacal, Amityville NY)에 1:100 희석 당 Septra 200 밀리그램 / 40 MG와 물 동물 광고 libitum 액세스를 제공합니다. </li></ol> 4. 수확 <ol><li> Humanely 사주 주입 한 후 호스트 동물을 안락사시켜야. </li><li> 원래 절개을 열고 피부를 반영는 복막 캐비티에 대한 액세스를 용이하게 cephalad. </li><li> 근육 레이어를 열고 조직의 세계로 조직 - 엔지니어링 구조를 확인합니다. </li><li> 날카로운 해부를 사용하여 intraabdominal 내장의 구조에 adhesions을보십시오. </li><li> 설치하기 파라핀을위한 포르말린에 구조를 수정, 또는 실시간 PCR 또는 단백질 분리와 같은 생화학 assays에 대한 새로운 조직을 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

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우리는 organoid 단위 온 발판 접근 방식을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기위한 프로토콜을 제시한다. 가장 중요한 단계는 organoid 단위의 준비가 일반적입니다. 주의 적절하게 청소하고 기계적으로 조직을 처리하는 이동해야하지만 소화를 수행 한 후에 동일한주의 (단계 1.11) organoid 단위를 overdigest 또는 overtriturate하지 않도록해야합니다. 이 작업을 수행하는 경우, organoid 단위 단계 1.12의 표면에 뜨는에서 손실 될 수 단일 세포로 감소하고, 조직 - 엔지니어링 소장을 생산 살아남을 가능성이 될 수 장 줄기 세포 틈새로 보존되지 않을 케이스. 마우스의 작은 사이즈는 직접 생체에 그 기능을 테스트하기 위해 호스트 동물의 창자에 조직 - 엔지니어링 구조를 합한다 어렵습니다. 또는 쥐가 생체 문합에 용이하게 TESI의 성장을 위해 더 큰 모델을 대표하고이미 이런 이유로 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 114170-112 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Gibco </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase의 타입 1 </td><td> 워싱턴 </td><td> LS004194 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM 높은 포도당 1X </td><td> Gibco </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 열 inactivated FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td></td></tr><tr><td> Biofelt 백퍼센트 PGA </td><td> Concordia는 의료 </td><td> FELT01-1005 </td><td> 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오.4 </td></tr><tr><td> 폴리-L-락트산 </td><td> Durect </td><td> B6002-1 </td><td> 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오. 4 </td></tr><tr><td> I 콜라겐, 쥐 꼬리 입력 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C3867-1VL </td><td> 참조에서와 같이 폴리머 준비하십시오. 4 </td></tr><tr><td> 케토 프로 펜 100 MG / ML </td><td> 요새 닷지 동물 건강 </td><td> 71 - KETOI - 100-50 </td><td></td></tr><tr><td> LabDiet 5,001 쥐 급식 </td><td> LabDiet </td><td> 5001 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML, USP 당 Septra 200 밀리그램 / 40 밀리그램 </td><td> 하이테크 Pharmacal </td><td> 50383-824-16 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane, USP </td><td> 피닉스 제약 </td><td> 57319-507-06 </td><td></td></tr></tbody></table>

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

조직 - 엔지니어링 소장 (TESI)가 성공적으로 40일 이내에 수술 전 근력로 돌아 발생, 거대한 작은 창자 절제술 후 루이스의 쥐를 구출하는 데 사용되었습니다. 인간 1, 대규모 작은 창자 절제술 짧은 창자 증후군, 기능 malabsorptive이 발생할 수 있습니다 중요한 병적 상태, 사망률, 그리고 비경 영양 의존도, 간 장애 및 간경변, 그리고 multivisceral 장기 이식의 필요성 2.이 문서에 포함 의료 비용을 수여 국가는, 우리는 마우스 모델에서 조직 - 엔지니어링 소장을 만들기위한 우리의 프로토콜을 설명하고 문서화 다세포 organoid 단위 온 발판 방식으로. Organoid 단위는 점막과 중간 엽 모두 요소를 포함하는 장에서 파생 다세포 집계, 3 장 줄기 세포 틈새 시장을 유지하는 사이의 관계입니다. 지속적인와 미래의 연구에서 4로 우리 기술의 전환마우스는이 종에서 사용할 수있는 유전자 변형 도구를 이용하여 TESI 형성하는 동안 관련된 프로세스의 조사를 허용합니다. 면역 저하 마우스 종자의 5 가용성도 우리 인간의 장 조직에 기술을 적용하고 같은 인간 TESI의 형성을 최적화 할 수 있도록 허용합니다 인간에의 전환하기 전에 마우스 이종 이식. 우리의 방법은 좋은 제조 연습 (GMP) 시약 및 이미 인간의 환자에 사용하기 위해 승인, 따라서 decellularized 동물의 조직에 의존 접근 방식에 비해 상당한 장점을 제공 한 자료를 사용하고 있습니다. 이 방법의 궁극적 인 목표는 짧은 창자 증후군의 재생 의료 치료 전략으로 인간의 번역입니다.

그림 1은 여기에 설명 된 프로토콜에 대한 전반적인 스키마를 보여줍니다. 이 프로토콜의 최종 결과는 동일한 구조를 표시하는 루멘, 점막, submucosa, 그리고 muscularis. 그림 2A를 둘러싼 것은 시작 폴리머 비계. 그림 2B에 비해 전형적인 세계를 보여줍니다과 조직 - 엔지니어링 손쥐 소장의 세계 또는 구형 구조입니다 급의 루멘을 나타 내기 위해 bivalved. 그림 3은 부화 후 4 주 후 전형적인 성공적인 구조의 hematoxylin / eosin-스테인드 파라핀 장착 단면을 보여줍니다. 참조합니다. 4, 우리는 (44 임플란트 39 개) 시간의 조직 - 엔지니어링 소장 성공적으로 89 % 생산 할 수 있었다. 실패 구조는 진행하지 점막 양식입니다. 그것은 전 세계 최종 histologic 분석 점막을해야합니다 여부를 수확에서 총 모양...

이 문서와 함께 비디오 organoid 단위 온 발판 접근법을 사용하여 마우스에 조직 - 엔지니어링 소장을 생성하기 위해 우리의 프로토콜을 제시한다.

조직공학 소장(tissue-engineered small intestine, TESI)은 대량의 소장 절제술을 받은 루이스 쥐(Lewis rats)를 구제하는 데 성공적으로 사용되었으며, 그 결과 ...로의 복귀를 이끌어냈습니다.

본 영상에서는 스캐폴드 기반의 오가노이드 유닛 접근법을 사용하여 마우스의 조직 공학적 소장을 생성하는 기술을 시연합니다. 본 실험에서 동물들은 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 로스앤젤레스 어린이 병원 Savon 연구소 동물 관리 시설의 가이드라인에 따라 처리되었습니다. 첫 번째 단계는 마우스의 소장 전체를 확보하는 것입니다.인도적으로 안락사시킨 마우스와 기구들을 70% 에탄올 수용액으로 소독하고, 복강에 진입하기 위해 정중선 절개를 실시합니다. 소장을 적출하여 trites 인대 바로 원위부에서 절단합니다. 그 후 예리한 절개와 둔성 박리를 통해 장간막 및 그 혈관으로부터 소장을 분리합니다.마지막으로, 회장-맹장 판막에서 근위쪽으로 5mm 지점에서 회장을 절단합니다. 채취한 소장의 크기가 표시되어 있습니다. 이제 1X 항생제 및 항진균제 용액이 포함된 Hank's buffered saline 내에서 장의 반장간막 경계를 따라 길이 방향으로 절개합니다.그 후 디시 내의 분변 물질을 제거하고, 시험관을 사용하여 HBSS로 세 번 반복 세척합니다. 장 조직은 튜브 바닥으로 가라앉으며, 떠오르는 물질은 중간엽 파편이므로 폐기해도 됩니다. 세척액은 피펫을 사용하여 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 가위를 사용하여 장을 1mm² 미만의 조각으로 잘게 다집니다. 다져진 조직을 자동 피펫으로 수집합니다. 이제 다져진 세척 조직은 소화 단계를 거칠 준비가 되었습니다.소화액은 항생제 및 항진균제가 포함된 HBSS에 DASE 0.125 milligrams per milliliter와 collagenase 800 units per milliliter를 함유하고 있습니다. 항생제 및 항진균제가 포함된 HBSS와 비교하여 소화액의 색상이 갈색을 띤다는 점에 유의하십시오. 소화액은 즉석에서 조제하며, 이를 10 milliliters 취해 다져진 조직에 첨가합니다.이를 로테이터에서 37°C로 20분 동안 배양합니다. 여기에서 보여주는 것처럼 피펫으로 반복적으로 분쇄하여 조직을 더욱 파쇄합니다. 균일한 외관이 나타날 때까지 이 과정을 20~50회 반복합니다.10 milliliter 피펫 팁이 최적의 크기입니다. 이를 위해 10% fetal bovine serum이 포함된 4°C DMEM 3 milliliter를 사용하여 반응을 중단시킵니다. 시료를 10분 동안 원심분리합니다.500 RPM에서 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 10% fetal bovine serum이 포함된 4°C DMEM 10 milliliters의 세척액으로 펠릿을 재현탁합니다. 그다음 800 RPM에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액에 남아 있어 제거되는 단일 세포를 제외한 모든 조직을 회수합니다. 펠릿에는 오가노이드 단위가 포함되어 있으며, 핀셋과 폐기물로 표시된 상단의 더 가벼운 물질들이 존재합니다.이 층 아래의 혈청 함유 DMEM을 피펫으로 제거합니다. 이때 펠렛이 피펫으로 인해 부유되지 않도록 주의합니다. 마지막 몇 방울은 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 더 안전하게 제거할 수 있습니다.여기에 본 실험에 사용된 폴리글리콜산(polyglycolic acid) 또는 PGA 폴리머 스캐폴드가 제시되어 있습니다. 일회용 1000 µL 피펫 팁의 끝부분 2 mm를 멸균 가위로 잘라냅니다. 폴리머로부터 재료가 퍼지는 것을 최소화하기 위해 4-wall 배양 플레이트에서 오가노이드 단위를 폴리머에 로딩합니다.피펫을 사용하여 오가노이드 단위를 먼저 루멘(lumen)에 넣고, 그다음 외벽 표면에 로딩하여 스캐폴드에 배치합니다. 루멘에 적절히 코팅되었는지 확인하기 위해 두 번째 포셉을 사용하며, 이때 폴리머의 원통형 모양이 손상되지 않도록 주의합니다. 형질전환 공여자를 사용하는 경우, 수용 마우스로는 면역결핍 비만형 당뇨병(non-obese diabetic) 마우스를 사용합니다.중증 복합 면역결핍 gamma chain 결핍 또는 NSG 마우스를 사용합니다. 또는 동계 숙주를 이식용으로 사용할 수 있습니다. 전신 마취를 유도한 후, 복부를 제모하고 소독 및 드레이핑을 실시합니다.0.5 cm의 정중선 절개를 실시합니다. 대망을 확인하고 조심스럽게 밖으로 꺼냅니다. 적재된 폴리머를 대망으로 감싼 후 5-0 Monocryl 봉합사로 고정합니다.그물망(omentum)이 찢어지지 않게 하는 것이 매우 중요하며, 그렇지 않을 경우 세포가 복강(Peritoneum) 내로 누출될 수 있습니다. 폴리머가 충전되어 그물망이 고정된 상태로 복부에 다시 삽입하며, 복부는 층별로 봉합합니다. 봉합 시에는 4-0 Vicryl 봉합사를 사용하여 간헐 봉합법으로 마무리합니다.먼저 근육층에, 그다음 피부에 수술 후 진통제로 kg당 2mg의 Ketoprofen을 멸균수에 녹여 절개 부위 인근에 피하 주사합니다. 이식 4주 후, 숙주 동물을 인도적으로 안락사시키고 원래의 절개 부위를 다시 엽니다. 조직 공학적 구조체는 구형으로 확인되며, 위장 및 복강 내 장기에 부착되어 있을 수 있습니다.유착 부위를 정교하게 제거하고 조직 공학적으로 제작된 장의 스테로이드를 회수합니다. 여기에는 회수된 스테로이드를 초기 폴리머와 직접 비교하여 보여줍니다. 이 이미지에서는 공학적으로 제작된 장의 내강을 정교하게 절개하여 내부를 드러낸 모습입니다.조직은 조직학적 분석을 위해 고정하거나, 다른 논문에서 입증한 바와 같이 다양한 분자 생물학적 분석을 위해 신선한 상태로 사용할 수 있습니다. 여기 제시된 사진은 성공적으로 제작된 전형적인 조직 공학 소장 구조물의 저배율 헤마톡실린-에오신 염색 현미경 사진입니다. 왼쪽 화살표는 장 점막으로 둘러싸인 내강을 나타내며, 오른쪽 화살표는 숙주 췌장을 보여줍니다.그것이 컨스트럭트에 부착되었습니다.

tissue-engineering-of-the-intestine-in-a-murine-model

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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장 부분 방해의 마우스 모델

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이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

우리는 장 조작을 통해 생성된 수술 후 장폐색의 쥐 모델을 설명합니다. 위장 통과 기능, 병리학적 변화 및 면역 세포 활성화는 수술 후 24시간 후에 평가되었습니다.

수술 후 장폐색 쥐 모델

배우세요 손쥐에서 조직 공학적 소장 생성 기법을 오가노이드 단위-스캐폴드 방식으로. 이 방법은 장 재생 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

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