Name: RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 배우세요 RootChip을 이용한 Arabidopsis 뿌리 성장의 시간 저속 형광 이미징 방법을 통해 뿌리 미세환경을 정밀하게 제어하고 관찰하는 기술을 습득하세요.

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우리는 센서를 안달 표현 공장 라인을 제공하기위한 동영상 준비와 Bhavna Chaudhuri과 관련하여 도움이 필립 Denninger 감사드립니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (MCB 1,021,677), WBF, 국립 보건원에 에너지학과 (DE-FG02-04ER15542) 및 SRQGG에 하워드 휴즈 의학 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다하는 것은 EMBO 길이에 의해 지원되었다 교제 - 용어입니다. MM은 알렉산더 폰 훔볼트 재단에 의해 지원되었다.

참고 : 무균 조건 하에서 모든 단계 준비 단계를 수행합니다. 1. 종자 발아를위한 플라스틱 원뿔의 작성 <ol><li> 5mm의 두께로 1 %의 한천을 포함하는 성장 매체와 10cm 페트리 접시를 채우십시오. 우리는 Hoagland 매체 4를 수정한 반 강도를 사용하지만 중간 성분은 개별 실험적인 요구 사항에 맞게 선택되어야한다. </li><li> 매체가 여전히 액체이지만, 배양 접시에서 매체의 5 μl와 10 μl 피펫 팁을 채우기 위해 멀티 채널 피펫을 사용합니다. </li><li> 매체가 완성 때까지 똑바로 견고한 성장 매체를 포함하는 배양 접시에 4mm 긴 플라스틱 콘과 장소로 잘라, 피펫 팁 상자에 채워진 팁을 저장합니다. </li></ol> 2. 종자 발아와 묘목 성장 <ol><li> 5 분, 5 %의 NaOCl에 종자를 소독 표면 살균 물로 세 번 씻어 다음, 중간 채워진 원뿔의 각 상단에 하나의 씨앗 배치의. </li><li> 4에서 Micropore 테이프 (3M)와 상점과 음식을 봉쇄 ° C 발아를 동기화합니다. </li><li> 3 개월 후엔, 발아를 시작하는 성장 캐비닛에 번호판을 전송합니다. 우리의 성장 조건 16h 높은 light/8h 어두운 사이클에서 23 ° C (100 μE m -2 s의 -1 빛의 강도)입니다. </li><li> 5 칠일 발아 후 사이에, 묘목은 RootChip로 전송을위한 준비가 있어야합니다. 이때 루트 팁 플라스틱 원뿔의 아래쪽 콘센트 근처에 있어야합니다. 해부 현미경 묘목 건강, 루트 길이, 해당되는 경우, 형광 마커의 표현을 확인합니다. </li><li> 칩에 전송을위한 개별 모종을 표시한다. 케이스 하나에 10 명 이렇게 모종을 선택가 전송 중에 손상되었습니다. </li></ol> 3. RootChip쪽으로 모종의 양도 <ol><li> 장기적인 실험을위한 RootChip 멸균을 위해 싸다조직 종이, 유리 배양 접시에있는 장소, 그리고 압력솥에있는 장치. </li><li> RootChip가 냉각되면, 액체 성장 매체와 함께 다룹니다. RootChip 완전히 포장되어해야하지만, 유체 수준 RootChip 표면 위에서 더 이상 3보다 mm이어야합니다. </li><li> 20 μl 피펫으로 중간에 전망대 챔버를 채우는 루트 입구와 챔버 콘센트를 통해 매체를 당기십시오. </li><li> 플러그 플라스틱 콘은 RootChip의 inlets로 단계 2.5 선택했습니다. 콘은 inlets에 석판이 적합합니다. RootChip는 광학 유리의 얇은 레이어에 탑재되어 있기 때문에, 칩에 너무 많은 압력을 적용하지 않습니다. </li><li> 액체 배지에서 하룻밤 RootChip을 품어. 부동 방지하기 위해 칩에 두개의 유리 슬라이드를 넣습니다. 자기 볶음 표시줄을 추가하고 요리를 닫습니다. </li><li> 자기 활동가로 어셈블리를 전송하고 부드럽게 매체를 선동. </li><li> RootChip의 inlets는 faci에 정상 장치에 30 ° 각도로 채널을 교차채널 (그림 1A)에 뿌리 성장을 litate. 추가로 원하는 방향으로 성장을 지원하기 위해 콘센트의 칩 반대의 측면에서 배양 접시 아래에 유리 슬라이드를 배치하여 약간 어셈블리를 기울. </li><li> 타이머에 연결되어 : 다크 / 라이트 사이클을 유지하기 위해 링 스탠드 (100 μE m -2 s의 -1 빛의 강도)로 묘목을 캐는. </li></ol> 4. 캐리어에 RootChip 연결 <ol><li> 다음 날, 액체 성장 매체 (그림 1B)로 sealable, pressurizable 병을 채운다. </li><li> 칩 캐리어 반전하고 안정된 표면에 놓으십시오. 액체 매질에서 RootChip를 제거하고 칩 캐리어 하단의 조리개로 PDMS 측을 아래로 삽입합니다. 동양 칩은 있도록 제어 계층 inlets을 포함 측면 캐리어 측면 벽에 압력 라인 튜브 커넥터의 측면에 직면하고 있습니다. </li><li> 에 덮개 유리를 건조부드럽게 티슈로 모래 바닥에 의한 칩의 바닥. 테이프 바로 온 회중과 함께 캐리어로 RootChip를 고정합니다. </li><li> 튜브 커넥터는 5cm 길이 조각으로 유연한 플라스틱 microbore 튜빙 (TYGON, 0.20 &quot;ID X 0.060&quot;OD)을 절단하고 스테인레스 스틸 microbore 튜브 (뉴잉글랜드 작은 튜브, 0.025 &quot;OD X 0.013&quot;ID X 0.75 &quot;로 연결하여 만들어진다 긴). 칩 해당 컨트롤 계층 입구에 주사기 및 플러그 각 튜브 커넥터를 사용하여 물로 튜브 커넥터를 채우십시오. 물이 나중에 컨트롤 레이어 채널을 채울 것이며 micromechanical 밸브에 압력을 전송하는 데 사용됩니다. </li><li> 미디어 / 솔루션 유리병 (들)에 라인의 반대편 끝을 연결합니다. 공기 주사기와 솔루션 유리병에 압력을 적용합니다. 솔루션 유리병 내에서 증가 공기 압력 라인에 액체를 강제합니다. </li></ol> 5. 현미경에서 RootChip 마운트 <ol><li> microsc에 캐리어를 놓고ope 단계. 방에 진동에 의한 실험의 과정을 통해 변화 어셈블리의 가능성을 줄이기 위해 이동 통신사 무대 인서트의 노치에 정확히 맞도록해야합니다. </li><li> 칩을 통해 칩 밸브 및 매체의 흐름은 공기 압력에 의해 제어됩니다. 규제가있는 두 개의 라인 메인 압력 라인의 오프 측쇄있다 - 하나는 채널을 통해 매체 흐름을 제어하는​​ 데 사용되며, 기타는 제어 계층의 푸쉬 - 업 밸브 행동시키다 솔레노이드 에어 밸브에 연결됩니다. 솔레노이드 밸브는 밸브의 USB 컨트롤러 (라파엘 고메즈-Sjöberg, 로렌스 버클리 국립 연구소에 의해 개발)를 통해 컴퓨터에서 운영하고 있습니다. 칩을 연결하기 전에 두 압력 레귤레이터를 닫습니다. </li><li> 어셈블리 내의 습도를 높게 유지하기 위해 운송인의 저수지에 물을 몇 ML를 추가합니다. 이 단계 말리는에서 식물을 유지하는 이상의 실험 과정을 통해 반복해야합니다. t를 최소화하기 위해 볼륨은 줄이고현미경에 쏟았 수있는 액체의 그 금액입니다. 장기 실험은 칩 콘센트에서 유출은 microbore 튜빙 (단계 4.4 참조)와 저수지에 칩 콘센트를 연결하여 운송인의 저수지로하실 수 있습니다. 양자 택일로, 칩 표면에 축적 유출은 pipetting에 의해 수집된 수 있습니다. </li><li> 시트 보호 장치에서 투명 플라스틱 (C 라인)의 제곱 시트를 준비합니다. 어셈블리의 높은 습도를 유지하기 위해 양면 테이프로 캐리어에 투명 플라스틱을 수정합니다. </li><li> 칩 위에 링 빛을 위치와 다크 / 라이트 사이클을 유지하고 있습니다. 고리 빛이 직접 조명 이미지 컬렉션에 방해하므로, 형광 마커를 사용하는 모든 실험이 시작하기 전에 꺼져 있어야합니다. </li></ol> 6. LabView 인터페이스를 사용 RootChip 운영 LabView 소프트웨어 플랫폼을위한 RootChip 컨트롤러 인터페이스 수저희 웹 사이트에서 다운로드할 수 <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> 칩 밸브는 솔레노이드 공기 밸브를 열어이 경우 제어 계층에 압력을 적용하여 종료됩니다. 컨트롤러 인터페이스는 밸브 번호 아래의 버튼을 클릭하여 밸브의 작동이 가능합니다. 밝은 녹색 칩 밸브 (그림 2B)의 압력과 폐쇄의 응용 프로그램을 나타냅니다. 압력 레귤레이터를 열기 전에 컨트롤러 인터페이스의 세 가지 솔루션 유입 밸브를 활성화합니다. 참고 : 컨트롤러 인터페이스는 시스템의 상태 모니터링을 허용 피드백 루프를 갖추고 있습니다. 이 기능은 컨트롤러 인터페이스에 &quot;Readback&quot;버튼을 클릭하면 활성화됩니다. </li><li> 제어 계층에 대한 압력 조절기를 열고 처음에 15 PSI로 설정한 다음, 흐름 계층을위한 레귤레이터를 열고 처음 5 PSI로 설정합니다. Depen원하는 유속에 땡, 압력 나중에 조정할 수 있습니다. </li><li> 매체와 챔버를 플러시하는 선택의 성장 매체의 입구 밸브를 엽니다. </li><li> 현미경 흐름 경로를 확인합니다. 일반적으로 공기 흐름 채널에 갇혀하고 제거해야합니다. 또한, 컨트롤 레이어의 채널은 여전히​​ 튜브 커넥터 (막다른 충전)을 통해서 물이 밖으로 강제하고 교체해야 공기가 포함되어 있습니다. 두 작업 모두 공기가 PDMS로 채널 ( &quot;degassing&quot;)에서 강제 때까지 8 챔버 각각의 여러 번 (5 PSI)를 플러시에 의해 달성된다. 참고 : 컨트롤러 인터페이스가 실험을 자동화하도록 프로그래밍 할 수 있습니다. 이러한 루틴은 가스를 제거하다 칩에도 사용할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 RootChip의 주요 목적은 통합을 높은 수준으로 단일 장치의 이미징 플랫폼과 관류 시스템을 결합하는 것입니다. 조작을 입증하려면뿌리의 microenvironment에서 우리는 어두운 식용 색소 (인거 매체 1시 4분 희석)와 챔버 스를 플러시하고 챔버 내의 유체의 교환을 측정했습니다. 5 PSI의 권장 압력에서 우리는 약 1.5 μl / 분 (그림 3)의 계산 유량에서 10 초 이내에 전체 교환을 측정했습니다. 우리는 또한이 사건 어둠 속에서 성장하고 외부 에너지원 (그림 4)와 같은 10 MM 포도당과 함께 제공에 모종의 루트 성장을 관찰했다. 이러한 빛과 매체의 구성과 같은 성장 조건에 따라 식물의 세 일 동안 RootChip에서 볼 수 있습니다. RootChip는 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 5-7을 바탕으로 유전자 인코딩 nanosensors을 표현 뿌리에서 세포내 포도당과 갈락토 오스 수치를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 칩의 뿌리는 포도당이나 갈락토 오스 솔루션의 사각형 펄스로 perfused되었다 ( <strong&gt; 그림 5). 설탕의 세포내 수준 모니터링되었으며 여기에 표시된 기증자 ECFP의 강도에 대한 수용체의 형광단의 황수정의 강도의 비율로 표현됩니다. 비율의 상승은 설탕의 축적을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. RootChip 원리. <ol class="ualpha"><li> RootChip은 뿌리의 성장과 이미징위한 8 개의 관측 실이 있습니다. 종자는 먼저 플라스틱 콘에서 발아 - 플라스틱 피펫 팁에서 가공 - 어떤은 고체 매체로 가득합니다. 루트 팁이 매체를 통해 성장과 액체 매체의 지속적인 흐름 챔버 상수의 조건을 유지 챔버에 도달합니다. Micromechanical 밸브 (적색)는 흐름을 제어합니다. 이 칩은 광학 커버 유리에 마운트됩니다. 확장하지 그리기. (Grossmann 외., 2011 식물 세포의 허가로 적응.) </li><li> SCH다이어프램 (적색)와 pressurizable 솔루션 유리병의 리. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 연결 및 RootChip를 장착. <ol class="ualpha"><li> 완전히 연결된 RootChip와 이동 통신사 위로보기는 거꾸로 현미경에 장착. </li><li> 제도 valving 시스템과 컨트롤러 인터페이스를 설명. 단일 챔버에 유체 흐름을 안내하는 설정 밸브에 대한 예를 나타납니다. 동안 밸브 4 싱글 밸브, 단체에서 3 행위를 통해 밸브를 0과 같은 여덟 행위를 통해. 이 시스템을 통해 개별 챔버는 밸브의 조합을 활성화하여 해결하실 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 관측 채널의 솔루션의 교환ambers. 염료 용액을 사용하여 관측 챔버의 유체의 교환의 시각화. 이미지는 명시야 및 염료 신호의 허위 색의 강도의 오버레이이다. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 온칩 루트 성장. 관측 형광등을 표현하는 하나의 성장 루트는 20h의 과정을 통해 포도당 / 갈락토 오스를위한 nanosensor 초조해. 시간 형식 : HH : MM, 스케일 바 : 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 사용하여 측정 세포 내 설탕 수준은 nanosensors을 무서워. <ol class="ualpha"><li> 센서의 금액은 루트 팁 이내 황수정 강도 (왼쪽)으로 표시됩니다. 세포 내의 반​​응은 포도당이나 갈락토 오스 솔루션의 응용 프로그램에 nanosensor이 ratiometric 이미지로 표시됩니다 초조해. (Grossmann 외로부터 허가를 적응. 2011 괞찮아가NT 셀) 규모 모음 :. 100 μm의. </li><li> 추적은 세 반복 평방 포도당의 펄스 (녹색)와 갈락토 오스 (적색)에 대한 응답으로 비율 변화를 무서워. </li></ol>

<ol><li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
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<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li>
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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

기존의 성장 방식을 통해 RootChip의 주요 장점은 현미경을위한 최소한 침략적 준비, reversibly 반복 루트 환경을 변경할 수있는 능력, 그리고 몇 일간의 기간 동안 발달 능력과 생리학적으로 건강한 조직의 지속적인 관찰을위한 용량입니다. 이전에는 모종은 gelled 미디어에 수직으로 성장되었으며 한 번에 8 시에 하나의 뿌리를 측정하는 허용 실험 직전 관류 시스템에 전송. Microfluidic 도구는 Arabidopsis에게뿐만 아니라 낮은 통합 레벨 9 또는 관류 컨트롤 열없이 사용되었습니다. RootChip 정확한 흐름지도를 통해 실험을 자동화하는 기능과 함께 통합의 높은 수준을 자랑합니다. 모든 microfluidic 장치 11 특성이 플랫폼, 또 다른 이점은 액체의 단지 최소한의 금액이 필요한 너트와 루트를 제공하는 데 필요한 것입니다심지어 며칠 걸치는 실험을위한 rients. RootChip는 현재 단일 사용 장치로 설계되어 있지만, 칩의 생산 비용이 낮은이기 때문에, 소비 시약의 소량은 여전히​​ 매우 비용 효율적인 칩을 만들 수 있습니다. 모종의 건강을 보장하기 위해 촬영해야합니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : 플라스틱 원뿔의 부피는 공기에 노출되면 건조되기 시작합니다서만 3-4 μl입니다. 따라서 그것은 원뿔이 빠르게 칩에 전송되고 뿌리가 충​​분한 물로 그들을 공급할 것입니다 전망대 챔버를 도달할 때까지 습도가 높은 유지되는 것이 중요합니다. 4.2-4.5 단계는 빠르고 모종의 건조를 방지하기 위해 중단없이 수행되어야한다. 단계 3.5-3.8는 뿌리가 관측 실로 성장하는 동안에 액체 매체 칩의 인큐베이션을 설명합니다. 이 단계는 C에 칩을 장착하여 생략 수 있습니다arrier 즉시과 성장 매체와 지속적인 관류를 시작합니다. 그것이 몇 가지 장점이있다 그러나, 우리는 하룻밤 사이에 성장 매체에 몸을 담글 좋습니다 묘목들이 관찰 챔버로 성장로서 desiccated 될 확률이 적은있다 그래야 그것이 습한 환경을 조성 1), 2) 칩은 액체에 배어 있으므로 degassing (6.4 단계)이 빠르게 될 것입니다. 그것은 낮은 용질 농도와 미디어를 사용하는 것이 중요합니다. 더 농축 솔루션은 칩은 며칠 동안 사용되고 특히, 침전 및 채널을 방해할 수 있습니다. 장치가 공기 압력 라인에 연결되면, 매체의 유량은 밸브의 유압 압력을 변경하여 제어됩니다. micromechanical 밸브의 적절한 종결을 보장하기 위해서는 유동 압력보다 약 세 배 높다 제어 압력을 선택하는 것이 중요합니다. 유체가 루트 inlets에서 밀쳐되므로 유동 압력이 15 Psi를 넘지 않아야합니다. 높은 압력 mAY는 또한 칩을 사용할 수 없게를 렌더링 칩, 박리의 원인. RootChip의 제한은 PDMS는 다공성과 소수성이라는 것입니다. 자료가 수성 솔루션에 거의 불활성이지만, 그것은 유기 화합물에게 12 흡수할 수 있습니다. 이것은 유기 화합물이 화합물의 공급 장치가 입구에서 중지되었습니다에도 물질로부터 누출 수 있으므로 솔루션의 신속한 교환을 방해할 수 있습니다. 다공성으로 인해 유기 용제를 사용하면 PDMS 12 부기의 원인이 될 수 있습니다. 우리는 작물 식물의 뿌리 RootChip을 최적화하고 예를 들어, 자사의 유틸리티를 확장하는 것을 계속한다. 우리는 치료와 관찰에 대한 루트 액세스를 향상시킴으로써, RootChip 같은 microfluidic 도구 루트 연구의 새로운 차원을 열었을 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 항목 </td><td> 출처 </td><td> 안내 </td></tr><tr><td> 칩 캐리어, 소프트웨어 및 기타 정보를 제공합니다. </td><td> 카네기 연구소 - DPB </td><td> 캐리어 제조, 컨트롤러 소프트웨어 및 자세한 정보는 CAD와 CNC 파일은 웹 사이트에서 다운로드할 수 있습니다 <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip의</a> 캐리어도이 웹 사이트에서 주문할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> 스탠포드 주조 </td><td> 마스크 설계 및 제조 프로토콜은 요청시 가능합니다. 즉시 사용하기 RootChips는 주문할 수 <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> 칩 컨트롤러 </td><td> 가정 내장</td><td> 자동 밸브 컨트롤러 시스템은 원래 라파엘 고메즈 - Sjöberg, 로렌스 버클리 국립 연구소에 의해 개발되었다. 어떻게 자신의 actuated 밸브 컨트롤러를 구축하는 자세한 지침은에서 찾을 수 <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

rootchip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

뿌리 식물의 물리적 앵커와 같은 기능과 같은 식물이 토양으로부터 취득하는 질소, 인, 황산 및 추적 구성 요소로서 물과 미네랄 영양소의 이해에 대한 책임 기관입니다. 우리가 높은 작물 수확량을 생산에 지속적인 접근법을 개발하고자한다면, 우리는 더 뿌리가 영양분의 다양한 스펙트럼을 소요하고, 공생과 병원성 유기체와 상호 작용, 개발 방법을 이해해야합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 몇 분 거리 일까지 기간 동안 미세한 자세하게 뿌리를 탐구 할 수 있어야합니다. 기반 microfluidic 장치, 이미징 1 (그림 1)에 대한 준비를하는 동안 뿌리에 어떠한 물리적인 스트레스를 피하는 동안 우리 Arabidopsis 모종의 성장 및 이미지 뿌리하실 수 있습니다 - 우리는 RootChip, polydimethylsiloxane (PDMS)을 개발했다. 장치는 유체 흐름을 안내하는 micromechanical 밸브를 갖춘 bifurcated 채널 구조를 포함솔루션 inlets에서 8 개의 관측 실이 각각 있습니다. 이 관류 시스템은 루트 microenvironment를 조절하고 정밀도와 속도로 수정할 수 있습니다. 챔버의 부피 따라서 테스트 솔루션에만 최소한의 금액을 필요로하는 약 400 NL이다. 여기 실시간 해상도로 영상 기반 접근 방법을 사용하여 RootChip에 루트 생물학을 공부를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 뿌리는 시간 저속 현미경을 사용하여 며칠 동안 분석할 수 있습니다. 루츠는 영양 솔루션이나 저해제로 perfused 수 있으며, 최대 8 모종은 병렬로 분석할 수 있습니다. 이 시스템은 화학, 유전자 발현의 형광 기반의 분석 및 biosensors의 분석의 존재 또는 부재의 루트 성장의 분석을 포함하여 어플 리케이션의 광범위한 잠재력을 가지고, 예를 들어이 nanosensors 3 초조해.

이 문서 RootChip의 Arabidopsis 모종 배양을위한 프로토콜, 미세한 루트 모니터링 및 세포내 신진 대사 단계의 걱정 기반의 측정과 성장 조건의 자동 제어를 결합한 microfluidic 이미징 플랫폼을 제공합니다.

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

뿌리는 식물의 물리적 고정 장치 역할을 하며, 물과 질소와 같은 무기 영양분의 흡수를 담당하는 기관입니다.

최대 수확량을 확보하기 위해 식물에는 일련의 영양분이 공급되어야 하며, 영양 결핍이나 저온 또는 극심한 고온과 같은 스트레스, 가뭄, 혹은 병원균은 매년 작물 수확량에 막대한 손실을 초래합니다. 이러한 문제들의 많은 원인은 흔히 땅속에 있습니다. 뿌리는 식물을 물리적으로 고정하는 역할을 하지만, 동시에 수분을 흡수하고 질소, 인, 황산염 및 여러 미량 원소와 같은 무기 영양분을 흡수하는 기관이기도 합니다.작물 수확량을 높이기 위한 지속 가능한 접근 방식을 개발하려면, 뿌리가 어떻게 발달하고 이 광범위한 영양소를 어떻게 흡수하며, 공생 및 병원성 생물과 어떻게 상호작용하는지 더 잘 이해해야 합니다. 이를 위해서는 분명한 이유로 뿌리를 미세 수준에서 탐구할 수 있어야 합니다. 뿌리의 생물학적 특성을 연구하는 것은 식물의 지상부를 연구하는 것보다 항상 더 어려웠습니다.뿌리는 보통 땅속에 숨겨져 있어 현미경 연구를 위해 접근하기가 쉽지 않습니다. 토양에서 뿌리를 제거하면 뿌리 체계에 심각한 손상이 발생하므로, 이는 뿌리의 거동을 연구하는 좋은 방법이 아닙니다. 뿌리의 접근성을 높이기 위한 한 가지 해결책은 본 예시에서 보여주는 것과 같이 수경 재배 배지에서 뿌리를 성장시키는 것입니다.겔 배지 또는 수경 재배 배지에서 식물을 성장시키는 방법은 많은 뿌리 연구에서 매우 성공적으로 사용되어 왔으나, 이러한 방법으로는 뿌리를 미세한 수준까지 상세히 관찰하거나 장기간 연구하는 것이 여전히 매우 어렵습니다. 성장하는 뿌리에 최대한 가까이 접근하고 이미징 준비 과정에서 발생하는 물리적 스트레스를 방지하기 위해, 우리는 뿌리를 성장 및 이미징하는 동시에 뿌리의 미세환경을 매우 높은 정밀도와 속도로 제어하고 수정할 수 있는 플랫폼을 구축하였습니다. 우리는 이 플랫폼을 루트 칩(root chip)이라 명명했습니다. 루트 칩은 실리콘 기반 유기 폴리머인 PDMS로 제작된 미세유체 장치입니다.이 칩은 토끼꼬리풀(rabbit opsis) 유묘의 뿌리 성장 및 이미징을 위한 관찰 챔버를 갖추고 있습니다. 먼저 종자는 플라스틱 피펫 팁으로 제작하고 고체 배지를 채운 플라스틱 콘 안에서 발아합니다. 그 후 뿌리 끝이 배지를 통해 성장하여 챔버에 도달하며, 이곳에서 액체 배지의 지속적인 흐름을 통해 챔버 내 조건이 유지됩니다.Stanford University의 Steve Quake 연구실에서 개발한 정밀 마이크로 기계 밸브가 여기 빨간색 제어부로 표시되어 있습니다. 칩이 현미경 관찰에 일반적으로 사용되는 투명 커버 글라스 위에 장착되어 있으므로, 관찰 챔버 내의 모든 공정은 도립 현미경으로 모니터링할 수 있습니다. 유체 흐름을 안내하는 분기형 채널 구조를 현미경으로 확인할 수 있습니다.루트 칩은 두 개의 층으로 구성되며, 밸브가 포함된 제어층과 성장 배지 및 테스트 용액이 관찰 챔버로 흐르는 채널이 포함된 유체층으로 이루어져 있습니다. 이 챔버의 부피는 약 400 nanoliters입니다. 이는 매우 적은 양의 용액만으로도 실험이 가능하며, 조건을 매우 빠르게 변경할 수 있음을 의미합니다.이 프로토콜은 8개의 Arabidopsis 묘목 생뿌리를 루트 칩(root chip)에서 병렬 현미경 이미징을 위해 준비하고 최대 3일 동안 관찰하는 방법을 설명합니다. 먼저 1% agar가 포함된 배지가 액체 상태일 때 10mm 페트리 접시에 배지를 채웁니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 5µL의 배지를 10µL 피펫 팁에 채웁니다. 배지가 고체 상태가 될 때까지 채워진 팁들을 피펫 팁 박스에 보관합니다.그 다음 4 mm 길이의 플라스틱 원뿔을 잘라 고체 배지가 들어 있는 페트리 접시에 똑바로 세워 배치합니다. 표면 살균 후, 배지가 채워진 원뿔 상단에 씨앗을 하나씩 놓습니다. 그 후 접시를 마이크로포어 테이프로 밀봉하고, 발아를 동기화하기 위해 플레이트를 4 °C에서 보관합니다.3일 후, 플레이트를 성장 챔버로 옮겨 발아를 시작합니다. 본 실험의 성장 조건은 23 °C입니다. 발아 후 5일에서 7일 사이, 16시간 광주기와 8시간 암주기 조건에서 묘자가 루트 칩으로 옮겨질 준비가 되었는지 확인하기 위해 묘자의 건강 상태와 뿌리 길이를 확인하고, 해당되는 경우 해부 현미경 하에서 형광 마커의 발현 여부를 확인해야 합니다.묘목의 뿌리 끝이 플라스틱 콘의 바닥 배출구에 도달하면, 칩으로 옮길 개별 묘목을 표시합니다. 루트 칩으로 옮기는 과정에서 손상될 경우를 대비하여 10개 정도의 묘목을 선택해야 합니다. 장기 실험의 경우, 장치를 조직지로 감싸 유리 페트리 접시에 넣고 오토클레이브 멸균합니다.이 칩은 방금 오토클레이브 멸균을 마친 상태입니다. 칩을 냉각시킨 후, 액체 배지를 칩 위에 덮어줍니다. 칩 전체가 완전히 덮여야 하며, 액체 높이는 칩 표면으로부터 3 mm를 넘지 않아야 합니다.20 µL 파이펫을 사용하여 Root 입구와 챔버 출구를 통해 배지를 끌어당깁니다. 이렇게 하면 관찰 챔버가 채워집니다. 배지가 채워지면 플라스틱 콘으로 root 칩을 막습니다.콘은 유입구에 딱 맞게 삽입되어야 합니다. 루트 칩이 얇은 광학 유리 층 위에 장착되어 있으므로, 칩에 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의해야 합니다. 이 단계가 끝나면, 칩이 뜨는 것을 방지하기 위해 액체 배지 내에서 하룻밤 동안 배양할 준비가 완료됩니다.반으로 자른 것을 포함하여 총 2장의 유리 슬라이드를 칩 위에 배치합니다. 마그네틱 스터 바를 넣고 디쉬를 닫습니다. 이제 이 조립체를 마그네틱 교반기로 옮기며, 여기서 배지를 부드럽게 교반하여 뿌리가 배출구를 향해 자라도록 유도합니다.루트 칩의 입구는 원하는 방향으로의 성장을 더욱 지원하기 위해 각도를 주어 뚫려 있습니다. 출구 반대편의 칩 측면을 들어 올려 어셈블리를 약간 기울이십시오.칩은 명암 리듬을 유지하기 위해 타이머 스위치에 연결된 링 램프로 조명 처리합니다. 하룻밤 동안 배양한 후, 밀폐 가능한 가압 바이알에 액체 성장 배지를 준비합니다. 유묘가 마르는 것을 방지하기 위해 다음 단계들은 중단 없이 신속하게 수행해야 합니다.이제 칩을 액체 배지에서 꺼내어, 마찬가지로 뒤집혀 있는 칩 캐리어의 하단 개구부에 거꾸로 놓습니다. 이때 제어층 입구가 포함된 면이 압력 라인 쪽을 향하도록 칩의 방향을 맞춰야 합니다. 캐리어 측벽에는 두 개의 큰 커넥터가 있습니다.칩 바닥의 커버 글라스를 티슈 페이퍼로 가볍게 닦아 건조시킨 후 캐리어에 고정합니다. 그 다음 테이프를 사용하여 전체 어셈블리를 뒤집습니다. 주사기를 사용하여 튜빙 커넥터에 물을 채우고, 각 튜빙 커넥터를 해당 입구에 연결합니다.칩 위에 배치합니다. 튜브를 배지와 용액에 연결합니다. 그런 다음 공기가 충전된 주사기로 용액 바이알에 압력을 가해 라인에서 바이알과 공기를 제거하고, 캐리어는 투명 플라스틱으로 덮습니다.조립 과정에서 높은 습도를 유지하기 위해 캐리어를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 캐리어는 스테이지의 노치(Notch)에 정확하게 맞게 배치되어야 합니다. 칩 밸브와 칩을 통한 배지의 흐름은 공기압으로 제어합니다.메인 압력 라인에서 조절기가 달린 두 개의 라인이 분기됩니다. 하나는 유체 흐름을 제어하는 데 사용되며, 다른 하나는 솔레노이드 공기 밸브에 연결됩니다. 이 밸브들은 USB 밸브 컨트롤러를 통해 컴퓨터에서 작동하며, 칩 위의 밸브들을 작동시키는 역할을 합니다.칩을 연결하기 전에 두 압력 조절기를 모두 닫아야 합니다. 이제 튜빙, 커넥터 및 용액 바이알을 해당 압력 라인에 연결합니다. 캐리어의 리저버에 수 밀리리터의 물을 추가합니다.이 단계는 더 긴 실험 과정 동안 반복해야 할 수도 있습니다. 습도를 높게 유지하기 위해, 현미경 위로 액체가 쏟아질 가능성을 최소화하도록 부피 부하를 낮게 유지하십시오. 실험이 시작될 때까지 명암 주기를 유지하기 위해 칩 위로 링 라이트를 이동시켜 배치합니다.칩 상의 밸브는 솔레노이드 공기 밸브를 열어 압력을 가함으로써 닫힙니다. LabVIEW 인터페이스에서는 밸브 번호 아래의 버튼을 클릭하여 밸브를 제어할 수 있습니다. 밝은 녹색은 압력이 가해져 칩 밸브가 닫혔음을 나타냅니다.이 도식은 밸브 시스템의 구성을 보여주며, 밸브 4번부터 8번까지는 단일 밸브로 작동하고 밸브 0번부터 3번까지는 그룹으로 작동합니다. 이 시스템에서는 밸브의 조합을 활성화하여 개별 챔버를 지정할 수 있습니다. 예를 들어, 유체 흐름을 위에서 세 번째 챔버로만 안내하려면 밸브 0번, 3번 및 4번을 닫아야 합니다. 또한, 밸브 6번, 7번 및 8번은 입구 A, B, C의 세척에 사용될 용액을 제어합니다. 이제 세 개의 용액 입구 밸브를 모두 활성화하여 닫으십시오.컨트롤러 인터페이스에는 시스템 상태를 모니터링할 수 있는 피드백 루프 기능이 있습니다. 이 기능은 read back 버튼을 클릭하여 활성화할 수 있습니다. 컨트롤 층의 압력 조절기를 먼저 열고 15 PSI로 설정합니다.그 후 유동층의 레귤레이터를 열고 5 PSI로 설정합니다. 선택한 배양 배지의 유입 밸브를 열어 챔버를 배지로 세척하고, 현미경 하에서 배지 흐름 경로를 확인해야 합니다. 대부분의 경우 채널 내에 공기가 갇혀 있으며 이를 제거해야 합니다.또한, 제어 공기 채널에는 여전히 공기가 남아 있으며, 이는 튜브 커넥터에서 공급되는 물에 의해 밀려나 교체되어야 합니다. 이 과정을 데드 엔드 필링(dead end filling)이라고 합니다. 여덟 개의 챔버 각각을 여러 번 플러싱하여 모든 공기가 채널에서 PDMS로 밀려나게 함으로써 이 두 가지 작업을 모두 수행합니다.이 시스템은 실험 자동화를 위해 프로그래밍할 수 있습니다. 이러한 루틴은 칩의 탈기(degas) 과정에도 사용될 수 있습니다. 루트 칩의 주된 목적은 이미징 플랫폼과 프로퓨전(profusion) 시스템을 하나의 장치로 결합하는 것입니다.뿌리 미세환경 조절 능력을 입증하기 위해, 챔버를 염료로 세척하고 챔버 내 유체의 교환을 측정하였습니다. 권장 압력인 5 PSI에서, 약 1.5 µL/min의 계산된 유속으로 10초 이내에 완전한 교환이 이루어짐을 확인하였습니다. 또한, 암실에서 배양하며 외부 에너지원으로 10 mM glucose를 공급한 묘목의 뿌리 성장을 관찰하였습니다.빛과 배지의 조성과 같은 생장 조건에 따라, 식물을 루트 칩(root chip)에서 최대 3일 동안 관찰할 수 있습니다. 이 시스템은 유전적으로 부호화된 나노센서를 발현하는 뿌리 내의 세포 내 글루코스 및 갈락토스 수준을 모니터링하는 데 사용되어 왔습니다. FRET(형광 공명 에너지 전달) 기반의 이러한 센서들은 Fromer 연구실에서 개발되었습니다.본 실험에서는 칩 내부의 뿌리에 포도당 또는 갈락토스 용액을 사각 펄스 형태로 관류하였습니다. 세포 내 당 농도를 모니터링하여 좌측에 수용체 형광 단백질인 citrine의 강도와 공여체 ECFP의 강도 비율로 표시하였습니다. 중앙의 ratiometric 이미지에서는 뿌리 끝의 센서 citrine 양을 관찰할 수 있으며, 우측에서는 포도당(녹색)과 갈락토스(적색)의 3회 반복 사각 펄스에 반응하여 변화하는 당의 양을 추적하여 나타내었습니다.비율의 증가는 당분의 축적을 나타냅니다. 기존의 배양 방법과 비교하여 루트 칩(root chip)이 갖는 주요 장점은 현미경 관찰을 위한 준비 과정이 최소 침습적이라는 점, 뿌리 환경을 가역적이고 반복적으로 변경할 수 있다는 점, 그리고 수일 동안 발달 능력이 있고 생리적으로 건강한 조직을 지속적으로 관찰할 수 있다는 점입니다. 또 다른 매우 중요한 장점은 시간이 지남에 따라 뿌리에 필요한 모든 영양분을 공급하는 데 최소한의 액체량만으로도 충분하다는 것입니다.이를 통해 루트 칩(root chip)의 비용 효율성을 매우 높일 수 있으며, 특히 고가의 시약을 사용할 때 그 효과가 더욱 두드러집니다. 우리는 루트 칩을 지속적으로 최적화하고 사용 가능성을 확장하고 있는데, 이는 이 중요한 기관에 대한 처리 및 관찰 접근성을 높임으로써 루트 칩과 같은 미세유체 도구가 식물 연구의 새로운 지평을 열어줄 잠재력이 있다고 믿기 때문입니다. 루트 칩 시스템 구축 방법에 대한 더 자세한 정보는 저희 웹사이트에서 확인하실 수 있습니다.칩은 Stanford Foundry에서 주문할 수 있습니다.

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Research

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JoVE Journal

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RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

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