RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

이 문서 RootChip의 Arabidopsis 모종 배양을위한 프로토콜, 미세한 루트 모니터링 및 세포내 신진 대사 단계의 걱정 기반의 측정과 성장 조건의 자동 제어를 결합한 microfluidic 이미징 플랫폼을 제공합니다.

최대 수확량을 제공하기 위해 식물에는 일련의 영양소가 제공되어야 하며, 영양 결핍, 추위 또는 극심한 더위, 가뭄 또는 병원균과 같은 스트레스는 매년 작물 수확량에 막대한 손실을 초래합니다. 이러한 많은 문제들의 근원은 흔히 지하에 있다. 뿌리는 식물의 물리적 닻이지만 수분 흡수와 질소, 황산인 및 많은 미량 원소와 같은 미네랄 영양소의 흡수를 담당하는 기관이기도 합니다.

높은 작물 수확량을 생산하기 위한 지속 가능한 접근 방식을 개발하려면 뿌리가 어떻게 발달하는지, 뿌리가 어떻게 광범위한 영양소를 흡수하는지, 공생 및 병원성 유기체와 어떻게 상호 작용하는지 더 잘 이해해야 합니다. 이를 위해서는 명백한 이유로 미시적 수준에서 뿌리를 탐구 할 수 있어야합니다. 뿌리의 생물학을 연구하는 것은 식물의 공중 부분을 연구하는 것보다 항상 더 어려웠습니다.

뿌리는 일반적으로 지하에 숨겨져 있기 때문에 현미경 연구를 위해 쉽게 접근할 수 없습니다. 토양에서 제거하면 뿌리 시스템에 심각한 손상을 입히므로 그들의 행동을 연구하는 좋은 방법이 아닙니다. 뿌리에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하는 한 가지 해결책은 지드에서 뿌리를 키우는 것이거나 이 예에서는 수경 재배 매체에서 보여줍니다.

젤리 배지 또는 수경 재배 매체의 성장 계획은 많은 뿌리 연구에서 매우 성공적으로 사용되었지만 이러한 방법을 사용하면 성장하는 뿌리에 가능한 한 가까이 다가가고 이미징 준비로 인한 물리적 스트레스를 피하기 위해 현미경 세부 사항과 장기간에 걸쳐 뿌리를 연구하는 것이 여전히 매우 어렵습니다. 우리는 뿌리를 성장시키고 이미지화할 수 있는 플랫폼을 구축하며, 동시에 매우 높은 정밀도와 속도로 뿌리의 미시환경을 제어하고 수정할 수 있습니다. 이 플랫폼을 우리는 루트 칩이라고 불렀습니다. 루트 칩은 실리콘 기반 유기 고분자인 PDMS로 제작된 미세유체 장치입니다.

이 칩에는 토끼 opsis 묘목의 뿌리 성장 및 이미징을 위한 관찰 챔버가 있습니다. 씨앗은 먼저 플라스틱 피펫 팁으로 제작된 플라스틱 원뿔에서 발아하고 단단한 매체로 채웁니다. 그런 다음 루트 팁은 매체를 통해 성장하고 챔버에 도달하여 액체 매체의 지속적인 흐름을 경험하여 챔버의 조건을 유지합니다.

스탠포드 대학의 Steve Quake 연구실에서 개발한 고정 마이크로 기계식 밸브는 빨간색 제어 장치로 표시되어 있습니다. 흐름은 칩이 일반적으로 현미경 검사에 사용되는 투명 커버 유리에 장착되기 때문에 관찰 챔버의 모든 프로세스를 도립 현미경에서 모니터링 할 수 있습니다. 유체 흐름을 안내하는 분기 채널 구조는 현미경으로 볼 수 있습니다.

루트 칩은 두 개의 층으로 구성되며, 제어 층은 성장 매체 테스트 용액이 관찰실로 흐르는 채널을 포함하는 유동 층의 밸브를 포함합니다. 이 챔버의 부피는 약 400나노리터입니다. 이는 매우 적은 양의 용액만 필요하고 조건을 매우 빠르게 변경할 수 있음을 의미합니다.

이 프로토콜은 8개 또는 애기장대 묘목의 살아있는 뿌리가 뿌리 칩에서 병렬 현미경 이미징을 위해 준비되고 배지가 여전히 액체 상태인 동안 1% 한천을 포함하는 성장 배지로 10mm 페트리 접시를 채우는 것으로 시작하여 최대 3일 동안 관찰하는 방법을 설명합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 10마이크로리터 피펫 팁을 페트리 접시의 배지 5마이크로리터로 채웁니다. 채워진 팁은 매체가 고체가 될 때까지 피펫 팁 상자에 보관됩니다.

그런 다음 4mm 길이의 플라스틱 원뿔로 자르고 고체 성장 배지가 들어있는 페트리 접시에 똑바로 세웁니다. 표면 살균 후, 단일 씨앗은 미디어로 채워진 원뿔 위에 배치됩니다. 그런 다음 접시를 미세 기공 테이프로 밀봉하고 플레이트를 4도로 보관하여 발아를 동기화합니다.

3일 후, 플레이트는 발아를 시작하기 위해 성장 캐비닛으로 옮겨집니다. 이 실험에서 우리의 성장 조건은 23도입니다. 발아 후 5일에서 7일 사이에 16시간 하이라이트, 8시간 암흑 주기에서 묘목은 뿌리 칩 묘목 건강 뿌리 길이로 옮길 준비가 되어야 하며, 해당되는 경우 해부 현미경으로 형광 마커의 발현을 확인해야 합니다.

묘목의 뿌리 끝이 플라스틱 원뿔의 하단 배출구에 도달하자마자 개별 묘목이 칩으로 옮겨지도록 표시됩니다. 10 개 정도의 식물 묘목은 뿌리 칩을 살균하기 위해 운반하는 동안 손상된 경우를 대비하여 선택해야합니다. 장기 실험을 위해 장치를 티슈로 싸서 유리 페트리 접시와 오토클레이브에 넣습니다.

이 칩은 이전에 오토클레이브였습니다. 칩을 냉각시킨 후 실험은 액체 성장 매체로 오버레이됩니다. 칩은 완전히 덮여야 하지만 유체 레벨은 칩 표면에서 3mm를 넘지 않아야 합니다.

20마이크로리터 피펫은 루트 주입구와 챔버 배출구를 통해 매체를 끌어당기는 데 사용됩니다. 이것은 관찰실을 채웁니다. 미디어를 선택하면 이제 플라스틱 콘이 루트 칩에 연결됩니다.

원뿔은 입구에 꼭 맞아야 합니다. 루트 칩은 광학 유리의 얇은 층에 장착되기 때문에 칩에 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의해야 합니다. 이 단계에서 칩은 이제 칩이 뜨는 것을 방지하기 위해 액체 매체 내에서 하룻밤 동안 배양할 준비가 됩니다.

반으로 자른 두 개의 유리 슬라이드가 칩에 놓입니다. 마그네틱 교반 막대가 추가되고 접시가 닫힙니다. 어셈블리는 이제 자기 교반으로 옮겨져 매체를 부드럽게 교반하여 배출구를 향한 뿌리 성장을 촉진합니다.

루트 칩입니다. 흡입구는 원하는 방향으로 성장을 더욱 지원하기 위해 비스듬히 펀칭됩니다. 콘센트 반대쪽에 있는 칩 쪽을 들어 올려 어셈블리를 약간 기울입니다.

칩은 링 램프로 조명되며 밝고 어두운 리듬을 유지하기 위해 타이머 스위치에 연결됩니다. 하룻밤 배양 후, 액체 성장 배지를 밀봉 가능한 가압 바이알에 준비합니다. 다음 단계는 묘목의 건조를 방지하기 위해 중단없이 신속하게 수행해야합니다.

이제 칩이 액체 매체에서 제거되고 칩 캐리어의 하단 구멍에 거꾸로 놓이며, 이는 역시 반전됩니다. 칩은 제어 레이어 입구를 포함하는 면이 압력 라인의 측면을 향하도록 방향을 지정해야 합니다. 캐리어 측벽에 있는 두 개의 큰 커넥터.

칩 바닥의 커버 유리는 티슈 페이퍼로 부드럽게 두드려 건조시키고 캐리어에 부착합니다. 테이프를 사용하면 전체 어셈블리가 반전됩니다. 튜빙 커넥터는 주사기를 사용하여 물을 채우고 각 튜빙 커넥터는 해당 입구에 연결됩니다.

칩에. 튜브가 매체와 용액에 연결되어 있습니다. 그런 다음 공기 주사기로 용액 담즙에 압력을 가하여 바이알과 공기를 라인에서 제거하고 캐리어는 투명 플라스틱으로 덮습니다.

어셈블리에서 높은 습도를 유지하기 위해 캐리어를 현미경 스테이지에 놓습니다. 스테이지의 노치에 정확히 맞아야 합니다. 칩 밸브와 칩을 통한 매체의 흐름은 공기 압력에 의해 제어됩니다.

레귤레이터가 있는 두 개의 라인은 주 압력 라인에서 분기됩니다. 하나는 유체 흐름을 제어하는 데 사용되고 다른 하나는 솔레노이드 공기 밸브에 연결됩니다. 이 밸브는 USB 밸브 컨트롤러를 통해 컴퓨터에서 작동되며 칩의 밸브를 작동시키는 역할을 합니다.

칩을 연결하기 전에 두 압력 조절기를 모두 닫아야 합니다. 튜브, 커넥터 및 용액 바이알은 이제 해당 압력 라인에 연결됩니다. 몇 밀리리터의 물이 캐리어의 저장소에 추가됩니다.

이 단계는 더 긴 실험 과정에서 반복해야 할 수도 있습니다. 습도를 높게 유지하려면 현미경에 쏟아질 수 있는 액체의 잠재적 양을 최소화하기 위해 체적 부하를 유지하십시오. 링 라이트는 실험이 시작될 때까지 라이트 다크 사이클을 유지하기 위해 칩 위의 위치로 이동합니다.

칩의 밸브는 압력을 가하여 닫히며,이 경우 솔레노이드 공기 밸브를 엽니 다. lab view 인터페이스를 사용하면 밸브 번호 아래에 있는 버튼을 클릭하여 밸브를 제어할 수 있습니다. 밝은 녹색은 압력이 가해지고 칩 밸브가 닫혔음을 나타냅니다.

이 계획은 밸브 4에서 8이 단일 밸브 밸브 0에서 3으로 작용하는 동안 밸브 시스템의 구성을 보여줍니다. 이 시스템을 사용하는 그룹에서는 예를 들어 밸브 조합을 활성화하여 개별 챔버를 처리 할 수 있으며, 예를 들어 유체 흐름을 상단 밸브 0, 3 및 4를 닫아야 합니다. 또한 밸브 6, 7 및 8은 흡입구 A, B 및 C를 세척하는 데 사용되는 용액을 제어하여 이제 3개의 용액 흡입구 밸브를 모두 활성화하여 닫습니다.

컨트롤러 인터페이스에는 시스템 상태를 모니터링할 수 있는 피드백 루프가 있습니다. 이 기능은 다시 읽기 버튼을 클릭하여 활성화할 수 있습니다. 제어 층의 압력 조절기가 먼저 열리고 15PSI로 설정됩니다.

그런 다음 유동층의 조절기가 열리고 5PSI로 설정됩니다. 선택한 성장 매체에 대한 입구 밸브를 열고 챔버를 여과재로 플러시하고 유체 흐름 경로를 현미경으로 확인해야 합니다. 대부분의 경우 공기는 채널에 갇혀 있으므로 제거해야 합니다.

또한 제어 공기의 채널에는 여전히 강제로 빼내고 튜빙 커넥터의 물로 교체해야 하는 공기가 포함되어 있습니다. 이 과정을 막다른 골목 충전이라고 합니다. 두 작업 모두 모든 공기가 채널에서 PDMS로 강제 유입될 때까지 8개의 챔버 각각을 여러 번 세척하여 수행됩니다.

실험을 자동화하도록 시스템을 프로그래밍할 수 있습니다. 이러한 루틴은 칩의 가스를 제거하는 데에도 사용될 수 있습니다. 루트 칩의 주요 목적은 이미징 플랫폼과 풍부한 시스템을 단일 장치에 결합하는 것입니다.

뿌리의 미세환경 조작을 입증하기 위해 챔버를 염료로 세척하고 챔버 내 유체 교환을 측정했습니다. 권장 압력인 5PSI에서 분당 약 1.5마이크로리터의 계산된 유속으로 10초 이내에 완전 교환을 측정했습니다. 우리는 또한 이 경우 어둠 속에서 자라고 외부 에너지원으로 10밀리몰의 포도당이 공급되는 묘목의 뿌리 성장을 관찰했습니다.

빛과 배지의 구성과 같은 성장 조건에 따라 식물은 최대 3일 동안 뿌리 칩에서 관찰할 수 있습니다. 이 시스템은 유전적으로 암호화된 나노센서를 발현하는 뿌리의 세포 내 포도당 및 갈락토오스 수치를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 첫 번째 또는 공명 에너지 전달 또는 프렛을 기반으로 하는 이러한 센서는 Fromer 실험실에서 개발되었습니다.

이 실험을 위해 칩의 뿌리에 포도당 또는 갈락토오스 용액의 사각 펄스가 관류되었습니다. 당의 세포 내 수준을 모니터링하고, 여기에 나타내고, 왼쪽의 공여체 ECFP의 강도에 대한 수용체 플루오로 4 시트린의 강도의 비율로 표현된다. 우리는 루트 팁의 중간 또는 비율 메트릭 이미지에서 센서 시트린의 양을 관찰하고, 오른쪽에서는 빨간색으로 표시된 녹색과 갈락토오스의 포도당의 세 가지 반복되는 사각형 펄스에 대한 반응으로 설탕의 양을 추적합니다.

비율의 상승은 설탕의 축적을 나타냅니다. 기존 성장 방법에 비해 뿌리 칩의 주요 장점은 현미경 검사를 위한 최소 침습적 준비, 뿌리 환경을 가역적이고 반복적으로 변경할 수 있는 능력, 며칠 동안 발달 능력이 뛰어나고 생리학적으로 건강한 조직을 지속적으로 관찰할 수 있는 능력입니다. 또 다른 중요한 장점은 시간이 지남에 따라 뿌리에 필요한 모든 영양분을 공급하는 데 최소한의 액체만 필요하다는 것입니다.

이것은 뿌리 치프를 매우 비용 효율적으로 만들며, 특히 값비싼 시약을 적용할 때 유용합니다. 우리는 이 중요한 기관을 치료 및 관찰에 더 쉽게 접근할 수 있도록 함으로써 뿌리 칩과 같은 미세유체 도구가 잠재적으로 식물 연구의 새로운 차원을 열 것이라고 믿기 때문에 뿌리 칩을 지속적으로 최적화하고 유용성을 확장하고 있습니다. 루트 칩 시스템을 구축하는 방법에 대한 자세한 내용은 당사 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.

칩은 Stanford Foundry에서 주문할 수 있습니다.