대형 Unilamellar 소포와 검사 BCL-2 가족 기능

이 생화학적으로 정의된 거대 단층 소포(Large Unilamellar Vesicles) 모델 시스템은 미토콘드리아 외막을 모방하여 BCL2 단백질의 기능을 in vitro에서 관찰하기 위해 사용됩니다. 먼저, 지질을 혼합하여 밀봉된 바이알 내에 지질 막을 형성합니다. 그 다음, 신선한 LUV 용액을 준비하여 지질 막을 용해시킵니다.

다음으로, 지질 용액을 압출하고 젤 여과법을 통해 대형 LUV를 정제합니다. 마지막 단계는 세제 유도형 형광 증가 여부를 확인하기 위해 LUV를 분석하는 것입니다. 궁극적으로, LUV 모델 시스템은 재조합 BCL2 단백질과 같은 막 투과성 단백질의 기능과 조절을 평가하는 데 사용됩니다.

대형 단층 소포(unilamellar vesicles)를 사용하는 이 접근 방식은 미토콘드리아와 같은 기존 시스템에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 단백질이 없는 상태에서 정제된 지질로 생성되기 때문에, 조성과 크기 모두 생화학적으로 정의됩니다.

조사 대상이 되는 단백질이 직접 첨가한 것들뿐이므로 결과에 대한 명확한 해석이 가능합니다. 이 방법은 BCL-2 패밀리가 미토콘드리아 외막의 무결성을 조절하는 능력에 대한 기전적 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 막 재구성 및 투과 활성을 조사하는 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

여기에는 미토콘드리아 동역학 기전이나 세균 형성 독소가 포함될 수 있습니다. 최소한의 조명이 있는 흄 후드 내에서 작업하십시오. Hamilton Gast 타입 유리 주사기를 클로로포름으로 헹굽니다.

그 다음, 1.5 mL GL 유리 바이알에 클로로포름으로 가용화한 지질 4 mg을 혼합합니다. 이어서 클로로포름을 제거하기 위해 질소나 아르곤과 같은 불활성 가스를 약하게 흘려줍니다. 2~3시간 후, LUV 버퍼 내의 바이알 바닥과 벽면에 건조된 지질 박막이 형성되었는지 확인합니다.

폴리음이온 염료와 CAS 이온성 소광제 용액을 각각 500 µL씩 준비하여 볼텍싱합니다. 두 용액을 혼합합니다. 그런 다음 A NTS와 DPX 용액을 결합하여 1분 동안 볼텍싱하고, 초음파 세척기에서 초음파 처리하여 용액이 완전히 용해되고 균질해지도록 합니다.

이제 지질 박막에 A-N-T-S-D-P-X 용액을 넣고 바이알을 파라필름으로 밀봉한 뒤, 지질 박막을 5분 동안 초음파 처리하십시오. 초음파 처리 후 용액은 우윳빛으로 변합니다. 작은 지질 응집체는 이후 단계에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 용액이 완전히 가용화되었는지 확인하십시오. 또한, 바이알의 바닥과 측면에 남은 지질 박막이 없는지 확인하십시오.

제조사의 지침에 따라 압출기를 조립하고, LUV 버퍼를 사용하여 필터 지지대와 폴리카보네이트 막을 적십니다. 압출 과정에서 부피 손실이 발생하지 않도록 장치의 케이싱을 조이되, 막이 파손되지 않도록 너무 세게 조이지 마십시오. LUV 버퍼로 압출기를 테스트하여 누출이나 문제가 없는지 확인합니다. 이제 오른쪽 주사기에 지질 용액을 채우고, 거대 ELLA 소포가 막을 최소 한 번은 통과할 수 있도록 31회 압출하여 왼쪽 주사기에 수집합니다. 용액이 갑자기 빠르게 막을 통과하는 경우, 처음 몇 번의 압출 시에는 약간 더 높은 압력이 필요할 수 있습니다.

멤브레인의 파손 여부를 확인하고 필요 시 교체하십시오. 한 번에 컬럼에 추가하십시오. 비드 인터페이스가 흐트러지지 않도록 주의하십시오.

완충액이 컬럼 밖으로 모두 흘러나오게 합니다. 흐름이 멈추면 컬럼을 막고 LUV 완충액을 조심스럽게 채우되, 비즈가 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 막개를 제거하고 1 mL씩 6개의 분획을 수집합니다.

AUV는 보통 세 번째와 네 번째 분획에서 용출되며, 흐릿한 외관으로 식별할 수 있으므로 컬럼 세척액을 회수하여 4 °C에서 보관하십시오. 컬럼 분획 내의 UUV는 chaps의 존재로 인한 형광 증가를 통해 검출됩니다. 모든 LUV 연구에는 반드시 불투명한 검은색 96 웰 플레이트를 사용하십시오.

LUV 버퍼 또는 0.5% chaps가 포함된 LUV 100 µL를 6개의 웰에 각각 피펫팅합니다. 각 웰에 해당 분획 5 µL를 추가하고 biotech H one synergy를 위해 혼합합니다. gen five 2.0 소프트웨어를 실행하고, 여기 파장 355 nm와 방출 파장 520 nm를 설정합니다.

상단 125 광학 위치에서 전압 이득을 설정하고 판독 높이를 5.5 millimeters로 올립니다. 이제 37 degrees Celsius에서 플레이트를 판독하여 LUV 함유 분획을 식별합니다. 정제된 LUV 분획을 추출합니다.

이 분석법들은 BCL2 단백질이 LUV 투과를 직접 유도하는 능력과 투과 활성의 조절 능력을 측정하기 위해 설계되었습니다. 분석 구성 성분을 첨가 순서대로 혼합하십시오. BS 및 bid 단백질의 적정에 관한 세부 사항은 동반된 논문에서 확인할 수 있습니다.

분석 시점까지 반응물을 37 °C에서 배양합니다. 플레이트를 마이크로플레이트 리더기에 넣으면, 앞서 보여준 것과 같이 플레이트를 흔들어 형광을 측정합니다. 이 실험에서는 LUV 투과 양성 대조군을 생성하기 위해 OG 세제로 활성화된 백(backs)을 사용합니다.

참고로, 0.025% 미만의 OG 농도는 여기에서 LUV 투과성에 직접적인 영향을 미치지 않습니다. 또한, 분석당 LUV 형광의 최대량을 결정하기 위해 0.5% chaps 처리가 사용됩니다. BCL-2 패밀리 단백질을 이용한 LUV 투과성을 연구하기 위해 필수적인 시작점은 최적의 방출을 촉진하는 Bax 및 Bid의 농도를 설정하는 것입니다.

이러한 backs 및 bid의 적정 곡선은 최소한의 배경 방출과 최적의 시너지 효과를 보여줍니다. 대안적으로, LUV 투과도를 동역학적으로 측정할 수 있습니다. 이러한 측정은 30분 동안 2분 간격으로 수행되었으며, 각 측정 전에는 2초 동안 플레이트를 가볍게 흔들어 주었습니다.

본 실험에서는 항-apoptosis 단백질이 Bak 및 Bid 의존적 LUV 투과성에 미치는 영향을 결정합니다. BCL-XL은 Bak 및 Bid의 활성을 농도 의존적으로 억제합니다. D-repression 분석에서 이러한 억제 효과는 이후 BH3-only 단백질을 추가함으로써 되돌릴 수 있습니다.

예를 들어, puma beta는 BCL xl에 결합하며, 이를 통해 bax와 bid가 시너지 효과를 내어 투과성을 높일 수 있게 합니다. 대형 ELLA 소포 생성 기술을 숙달하면, 외미토콘드리아 막과 유사한 생화학적으로 정의된 환경에서 BCL two 가족 단백질, 펩타이드 및 소분자를 효율적이고 빠르게 분석할 수 있습니다. 중요한 점은, 이 분석법을 통해 종말점 및 동역학적 파라미터 모두를 사용하여 수백 가지 조건을 신속하게 분석할 수 있다는 것입니다.

UUV와 BCL2 단백질 모두 계면활성제로 인한 아티팩트에 매우 취약하다는 점을 유념하십시오. 재현 가능한 결과를 얻으려면 계면활성제가 없는 깨끗한 장비를 사용하십시오.