형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

본 절차의 전반적인 목적은 분열 중인 세포 내에서 바이러스 게놈의 분배를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 형광 현미경으로 시각화할 수 있는 플라스미드를 제작함으로써 수행됩니다. 여기서는 락토스 오퍼레이터 서열(LAC O)의 탠덤 반복물을 포함하도록 플라스미드를 설계합니다. 두 번째 단계는 분열 중인 세포에 이 플라스미드를 도입한 후, 형광 단백질과 융합된 락토스 억제제(lac I)를 인코딩하는 레트로바이러스를 세포에 감염시키는 것입니다.

락토스 억제제 융합 단백질은 플라스미드 sub의 락토스 오퍼레이터 서열에 특이적으로 결합합니다. 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 여러 세포 주기에 걸쳐 개별 플라스미드를 추적합니다. 최종적으로, 획득한 이미지를 처리하여 분열하는 세포 내에서 바이러스 게놈이 어떻게 유지되는지 결정합니다.

정량적 PCR, 서던 블로팅 또는 형광 인시튜 하이브리다이제이션과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 개별 플라스미드를 여러 시점에서 관찰할 수 있다는 것입니다. 형광 현미경으로 플라스미드를 시각화하기 위해, 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 약 250개의 락토스 오퍼레이터 서열 또는 LAC O를 포함하는 DNA 단편을 플라스미드에 도입합니다. 본 예시에서 플라스미드는 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)의 전체 게놈을 포함하고 하이그로마이신 내성을 인코딩하는 약 170 kilobase pairs의 BACMID입니다.

트랜스펙션을 통해 plasmid DNA를 포함하는 LAC O를 hela 및 SLK 포유류 세포에 도입합니다. 60mm 디쉬에서 세포를 10 µg의 정제된 plasmid DNA, 25 µL의 lipectomy 2000, 0.5 mL의 Optum, 그리고 3.5 mL의 DMEM과 함께 4시간 동안 배양합니다. 배지를 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM으로 교체하고 세포를 48시간 동안 회복시킵니다.

그 후, 형질전환된 세포를 커다란 배양 접시에 낮은 밀도로 도말하고, 도입된 플라스미드를 선별하기 위해 10% fetal bovine serum과 300 micrograms per milliliter hygromycin이 포함된 DMEM에서 3주 동안 배양합니다. 멸균된 팁 조각과 적신 여과지를 사용하여 hygromycin 내성 콜로니를 새로운 배양 접시로 옮깁니다. 형질전환된 클론이 접시를 가득 채울 때까지 1~2주 후 접시를 인큐베이터에 넣고, LAC O 플라스미드의 폴리머가 균일하며 예상되는 크기인지 확인하기 위해 제한효소 절단 및 southern blotting용 DNA를 분리합니다. 본 예시 블롯은 클론 1의 LAC O 폴리머가 균일하며 양성 대조군과 동일함을 보여줍니다.

7번 레인에서, 플라스미드가 lactose repressor lacI 융합 단백질을 발현하도록 설계되지 않은 경우, lacI가 TD-tomato와 같은 적색 형광 단백질에 융합된 레트로바이러스를 사용하여 적절한 클론에 감염시킵니다. 장시간의 반복 노출로 인해 발생할 수 있는 광독성을 최소화하기 위해, 녹색에 가까운 형광 단백질 대신 TD-tomato가 선택되었습니다. LACI 융합 단백질이 도입되면, 융합 단백질이 DNA에 결합하는 것을 차단하기 위해 200 µg/mL IPTG가 포함된 배지에서 세포를 배양합니다. 이 과정에서 가장 중요한 측면 중 하나는 적절한 형광 강도를 가진 클론을 확보하는 것입니다.

최적의 형광 배양 특성을 가진 클론을 식별하기 위해 다수의 클론을 스크리닝해야 합니다. LacI-tdTomato 단백질이 발현될 수 있도록 세포를 최소 3일 동안 배양하십시오. 결합되지 않은 융합 단백질의 배경 신호는 최소화하면서 LacI-tdTomato 수준이 최적화되어 뚜렷한 신호를 나타내는 클론을 스크리닝합니다. 이미징 24~48시간 전에 LacI-tdTomato를 발현하는 세포를 35mm 유리 바닥 배양 접시에 10% 미만의 밀도(confluence)로 플레이팅하십시오. 이렇게 하면 이미징 시작 1~3시간 전에 세포 쌍이 서로 겹치지 않고 8~16개의 세포로 구성된 콜로니로 분열될 수 있습니다.

선택 약물과 IPTG가 모두 없는 배양액으로 플레이트를 세 번 헹굽니다. 이렇게 하면 생존 불가능한 세포가 씻겨 나가고 lac eye 융합 단백질이 플라스미드의 LAC 세포에 결합할 수 있습니다. 배양액을 10% 태아 송아지 혈청과 25 millimolar Hippies가 포함된 DMEM 2 mL로 교체하고 1~3시간 동안 배양합니다. 이미징 직전에 배양 접시 상단을 35 millimeter 접시용 마운팅 링에 고정된 cult foil로 덮습니다.

이 덮개는 배양액의 증발을 억제하며, 증발이 일어날 경우 시간이 지남에 따라 염 농도가 증가하여 세포가 사멸하게 됩니다. 본 실험에 사용된 이미징 시스템은 전동 스테이지와 신호의 민감한 검출을 위한 EM CCD 카메라가 장착된 Zeiss Axio 200 M 도립 현미경으로 구성됩니다. 형광 여기광은 Collibra 시스템의 중성 백색 LED에 의해 제공됩니다.

이미징 시스템은 다중 Z 스택을 포함하여 장시간 간격으로 이미지를 자동 획득하는 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 습윤 챔버 내에서 세포를 37 °C, 5~10% carbon dioxide 상태로 유지하기 위해 스테이지 상단 인큐베이터를 사용합니다. 대물렌즈의 사이펀 현상을 방지하기 위해 오일 대물렌즈용 가열 칼라를 사용하십시오.

샘플을 가열하여 시스템이 안정적인 온도에 도달할 수 있도록 충분한 시간을 둡니다. 실험 중 움직임으로 인한 아티팩트를 최소화하기 위해, 이미징 시스템은 진동으로부터 격리될 수 있도록 에어 테이블 위에 설치해야 합니다. 표지된 DNA를 시각화하는 절차를 시작하려면, DIC 이미징을 사용하여 세포를 관찰하고 각 시야에서 세포의 상단과 하단의 초점 평면을 결정합니다. 각 시야에서 세포 상단으로부터 약 3분의 1 지점의 초점 평면으로 이동한 후, x, y, Z 좌표를 저장된 스테이지 위치 목록에 저장합니다.

저장된 각 위치는 현미경 제어 소프트웨어에서 세포를 캡처하기 위한 Z-stack 이미지의 중심이 됩니다. 저장된 각 스테이지 위치에서 수행할 Z-stack 이미지를 정의하고, 세포가 위치한 평면의 위아래로 추가 슬라이스를 포함하여 세포 전체가 캡처될 수 있도록 충분한 슬라이스 수를 정의하십시오. Z축 방향으로 대략적인 나이퀴스트 샘플링(Nyquist sampling)이 가능하도록 Z 스텝 크기를 0.35에서 0.50 microns로 선택하십시오. 이러한 슬라이스들은 세포 주기 동안 발생하는 세포의 움직임을 추적할 수 있게 하며, 이미지 스택의 획득 후 처리 과정에서도 사용됩니다.

이는 세포의 두께에 따라 40~60장의 이미지 스택으로 생성됩니다. 30분 간격으로 Zacks의 명시야(bright field) 이미지를 수집하고, 10~60분 간격으로 형광 이미지를 수집하는 시계열 실험을 설정하십시오. 실험 중에는 DIC 이미징을 사용하지 마십시오. DIC 이미징은 표준 명시야 이미징보다 더 많은 빛을 필요로 하며, 이는 장기 실험 과정에서 세포를 불필요한 광독성에 노출시킬 수 있습니다.

소프트웨어 제어 실험을 시작합니다. 실험 중에 시스템이 방해받지 않도록 주의하십시오. 실험에 필요한 모든 이미지를 획득한 후, 각 Zack 및 시점별 이미지를 검토하고 컴퓨터 처리 시간을 단축하기 위해 이미지에서 불필요한 영역을 잘라냅니다.

다음 단계에서는 각 Z 스택의 픽셀에 신호 강도를 다시 할당합니다. 이미징 시스템의 측정된 점 확산 함수(point spread function)를 기반으로 Axio vision 소프트웨어의 디콘볼루션 알고리즘을 사용하십시오. 디콘볼루션의 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

이미지를 검토하여 세포 주기 동안 플라스미드의 강도 변화와 이동, 그리고 딸세포로의 플라스미드 분배를 추적하십시오. 서로 다른 신호가 존재하는 여러 Z-평면을 포함하도록 계산적으로 생성된 이 이미지들은, 융합 단백질의 핵 국소화 신호로 인해 LAC eye TD tomato를 발현하는 HELOC 세포의 핵이 형광을 띠며 핵에 국소화되어 있음을 보여줍니다. I-P-T-G-K-S-H-V가 없는 상태에서 LAC O 서열을 인코딩하는 게놈은 많은 수의 형광 단백질을 모집하며, 핵의 배경 강도보다 밝은 신호로 나타납니다.

반면, IPTG가 존재할 때 LAC eye 형광 단백질은 인식 대상인 lack O 서열에 결합하는 것이 억제됩니다. 대표적인 실험에서 다섯 번의 시간 지점에서 획득한 HeLa 세포 주기의 최대 강도 투영(maximum intensity projections)이 이 그림에 나타나 있습니다. 패널 A의 세포에서 보이는 형광 표지된 바이러스 게놈은 패널 B에 표시된 대로 합성됩니다. 이후 바이러스 게놈은 패널 C, D 및 E에서 관찰되는 것처럼 세포 분열 동안 딸세포로 분배됩니다. 건강한 HeLa 세포의 세포 주기는 약 24시간이 소요되며, 딸세포는 일반적으로 서로 가까이 부착되어 다음 세포 주기에서 동시에 분열합니다.

본 프로토콜을 사용하여 세포 내 바이러스 게놈을 여러 세대에 걸쳐 추적할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 실험 전 과정 동안 세포가 건강한 상태를 유지하는지 확인하기 위해 세대 시간 동안 세포 형태를 관찰하는 것이 중요합니다.