Name: 형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 학습하세요 형광 현미경을 이용한 라이브 포유류 세포에서 플라스미드 복제 추적 방법을. lac 억제자 단백질을 활용해 세포 분열 중 바이러스 유전체 분배를 실시간 관찰하고 여러 세대에 걸쳐 개별 DNA 분자의 동역학을 분석합니다.

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이 작품은 NIH와 ACS, T32CA009135 포함 CA133027, CA070723 및 CA022443에서 교부금의 지원을받는되었다. 빌 Sugden은 미국 암 협회 연구 교수입니다.

1. 공개 Plasmids있는 세포 공학 <ol><li> 시각화 할 플라스미드에 유당 운영자 순서 (LacO)의 약 250 사본을 포함하는 DNA 조각을 소개 표준 제한 소화 또는 동종 재조합 기술을 사용합니다. 우리 플라스미드는 약 170 kbp의 BACmid이고 Kaposi 육종 - 관련 헤르페스 바이러스의 전체 게놈 (KSHV)와 hygromycin 12 인코딩 저항이 포함되어 있습니다. </li><li> 소개 LacO을 포함 Lipofectamine 2000 transfection하여 포유류의 세포에 플라스미드 DNA합니다. 우리는 25 μl Lipofectamine 2000, 0.5 ML OptiMEM, 및 3.5 ML DMEM으로 플라스미드 DNA를 정제 10 μg을 4 시간에 60mm 요리 헬러와 SLK 세포를 transfected. </li><li> 48 시간 10 % 태아 소 혈청 및 배양 세포 5 개 ML DMEM으로 문화 매체를 변경합니다. </li><li> 소개 찮아에 대한 항생제 선택을 포함하는 중간에 대형 요리와 문화 세포에서 낮은 밀도의 플레이트 세포smid, 우리는 300 μg / 3 주 ML의 hygromycin과 10% 태아 소 혈청과 DMEM에서 셀을 선택했습니다. </li><li> 새로운 문화 요리에 hygromycin 방지 식민지를 전송하는 살균, 트립신 - 젖은 거름 종이 조각을 사용합니다. </li><li> transfected 클론은 접시를 채우기 위해 성장했을 때, 제한 소화를 위해 DNA를 분리하고 남부는 플라스미드 LacO의 폴리머는 동질이며, 예상 크기 있도록 blotting. </li><li> 플라스미드는 LacI의 융합을 표현하기 위해 설계되지 않은 경우, 해당 LacI-tdTomato 같은 붉은 색 형광 단백질에 융합 유당 억제 (LacI)를 인코딩 레트로 바이러스와 적절한 클론을 감염. 우리는 tdTomato보다 긴 시간 14 여러 노출에서 발생하는 것 photoxicity을 최소화 할 녹색에 가까운 형광 단백질을 사용합니다. </li><li> 일단 LacI 융합 단백질은 문화 바인딩에서 융합 단백질을 차단하는 200 μg / ML 이소 프로필-BD-thiogalactoside (IPTG)의 존재에서, 세포 소개합니다DNA. </li><li> 문화 적어도 3 일 동안의 전지 LacI-tdTomato 단백질의 표현을 허용합니다. </li><li> 언 바운드 융합 단백질의 최소한의 배경 수준 별개의 신호를 보여 LacI - tdTomato의 최적 수준있는 사람을위한 화면 클론 (IPTG을 멀리 세척하고 아래에 설명 된대로 세포를 확인하여). </li></ol> 2. 이미징 시스템의 개발 우리의 이미징 시스템은 동력 무대와 계획 - Aochromat 63x/1.4 오일 목적 갖춘 Zeiss Axiovert의 200M으로 구성되어 있습니다. 형광 여기 광은 Colibri 시스템의 LED &quot;중립적 인 화이트&quot;에 의해 제공됩니다. 방출은 CascadeII에 의해 감지 : 1024 EMCCD 카메라를. 이 증폭기 신호의 게인 레지스터와 냉각, 백 얇게 카메라, 어두운 현재는 초당 픽셀 당 0.061 전자이며, 양자 효율은 0.90보다 큽니다. 시스템은 SmartExperiments 모듈을 포함 Axiovision 4.8 소프트웨어에 의해 제어됩니다. tdToma의 검출을위한우리가하는 통과 빛의 85 %는 형석 및 방출 빛의 95 %을 자극 할 수있는 Zeiss 필터 세트 75HE를 사용하면 방출 필터를 통과합니다. <ol><li> 여러 긴 시간 간격으로 이미지의 자동화 인수에 민감한 신호의 감지, 특정 여기 빠르게 shuttering, 동력 무대와 초점 팔의 LED 광원 및 소프트웨어 제어를위한 역 현미경과 EMCCD 카메라와 이미징 시스템을 조립 Z-스택. 이 시스템은 진동으로부터 격리 할 공기 테이블에 앉아해야합니다. </li><li> 37 ° C, humidified 챔버에 5~10%의 CO 2 세포를 유지하기 위해 무대 위로 배양기를 조립. 실험이 진행되는 동안 이동 유물을 최소화하기 위해 안정적인 온도에 와서 할 수있는 시스템에 대한 충분한 시간을 허용합니다. </li><li> 샘플에서 열을 빼돌 렸에서 목적을 방지 할 수있는 목적을위한 온수 칼라를 사용하십시오. </li></ol> 3. 레이블 DNA의 시각화 <ol><li> 35mm의 플레이트 세포셀의 쌍 중복없이 8-16 세포의 식민지로 분할 할 수 있습니다 미만 10 % 합류의 밀도에 유리 바닥 요리. 가능한 세포가 분열 할 시간이 너무 이미징 전에 최소한 24-48 시간을 수행합니다. </li><li> 영상의 시작 전에 1 ~ 3 시간은 선택 마약과 IPTG를 모두 부족 문화 매체로 판에게 3 번 씻어. 이 절차는 거리에 비 가능한 세포를 씻어하고 LacI 융합 단백질은 plasmids의 LacO 사이트를 바인딩 할 수 있습니다. </li><li> 10% 태아 소 혈청과 25 밀리미터 HEPES 2 개 ML DMEM으로 문화 매체를 교체하십시오. </li><li> CultFoil있는 배양 접시의 상단을 바꾸기 35mm 요리에 장착 링에되었다. 이 커버는 시간이 지남에 따라 소금 농도를 증가하고 세포를 죽일 문화 매체의 증발을 억제합니다. </li><li> 세포를보고보기의 여러 분야에서 상단 및 세포 하단의 초점 비행기를 결정하는 차동 간섭 대비 (DIC) 이미지를 사용합니다.각 분야에서 세포의 정상에서 초점 평면에 방식의 약 1 / 3 아래로 이동합니다. , y를 x를 저장, z는 저장 단계 위치 목록에서 조정합니다. 참고 : 플라스미드 신호는 세포가 LacI 융합 단백질에 적합한 파장의 LED가에 의해 조명하는 접안 렌즈를 통해 표시되지 않을 수 있습니다. 약 신호는 시간이 지남에 따라 신호의 통합을 허용하기 때문에 효율적으로 약한 신호를 증폭 EMCCD 카메라의 사용과 표시 될 수 있습니다. </li><li> 현미경 제어 소프트웨어에서 각 저장 단계 위치에 수행 할 이미지의 Z-스택을 정의합니다. Z 치수 14 대략 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링로 수 0.35-0.50 μm의 AZ 단계 크기를 선택합니다. 셀이있는 위하고 비행기 아래의 &quot;추가&quot;조각을 포함,이 조각은 세포주기 동안 세포 움직임에 따라 검색을 할 수 있으며, 또한 이미지 스택의 후 수집 처리 (deconvolution)에 사용됩니다. 이 포함 거예요셀의 두께에 따라 40-60 이미지의 스택에 발생. </li><li> 현미경 제어 소프트웨어 (plasmids를 시각화를위한 10-60 분 간격으로 30 분 간격 (긴 시간 동안 세포 분열 및 마이그레이션을 추적하기위한)와 형광 이미지에서 Z-스택의 시야 이미지를 수집하기 위해 시계열 실험을 정의 세포 내에서). 이 긴 실험의 과정을 통해 광독성에 불필요한 셀을 표시 할 수 있습니다 표준 시야 영상,보다 더 많은 빛을 필요로 실험이 진행되는 동안 DIC 이미지를 사용하지 마십시오. </li><li> 소프트웨어 제어 실험을 시작합니다. 시스템이 실험이 진행되는 동안 (초과 객실 조명 등에 노출 친) 방해하지 않습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 필요한 경우, 실험이 진행되는 동안 가습 시스템에서 물을 보충. </li></ol> 4. 이미지의 후 수집 처리 <ol><li> 각 Z-스택 및 시간 포인트에 대한 이미지를 검토합니다. 불필요한 지역을 자르기다음 단계에서 컴퓨터 처리 시간을 줄일 수있는 이미지. </li><li> 각 Z-스택 15 원산지의 픽셀에 신호 강도를 다시 할당 할 deconvolution 알고리즘을 사용합니다. 이 deconvolution가 이미징 시스템을위한 이론적 점 확산 함수 (point spread function)를 기반으로 할 수 있지만, 영상 형광 마이크로하여 특정 시스템의 점 확산 함수 (point spread function)를 측정하고, deconvolution 알고리즘에서이 측정을 사용하는 것이 바람직합니다. 우리는 우리의 이미징 시스템의 점 확산 함수 (point spread function)을 측정하고 적용 AxioVision 소프트웨어 (AxioVision 소프트웨어 설명, Zeiss)의 최대 가능성 알고리즘을 반복 제약. </li><li> 강도의 변화와 움직임 plasmids의 세포주기 동안과 딸 세포에 plasmids의 파티션을 추적 할 이미지를 검사합니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 설명 된 방법은 여러 세대에 걸쳐 시간이 지남에 따라 실시간으로 포유류의 세포에 plasmids를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 여기 빛에 노출을 제한함으로써, 우리는 최소 72 시간, 3 셀 부문을 대표하는 16-32 세포의 콜로니를 통해 새로 분할 쌍의 세포를 수행하는 이러한 기술을 사용했습니다. 이 실험은 정량 PCR, blotting 남부 및 어류와 같은 정적 assays에서 얻을 수없는 정보를 제공합니다. 예를 직렬 LacO 반복과 같은 반복적 인 시퀀스와 plasmids를 사용하는 경우 rearrangements가 발생할 수 있으므로 그것은 동질적인 구조 plasmids에 대한 세포의 클론을 상영하는 것이 필수적입니다. 또한, 최적의 신호 강도에 대한 레트로 바이러스 감염과 감염된 세포의 화면 클론을 최적화하기 위해 유용합니다. 너무 많은 LacI 단백질을 표현 세포는 핵에 높은 배경 형광을 가지게 될 것이며, 너무 작은 표현들이 약 신호를해야합니다. 마...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11,965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31,985 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 </td><td> 시그마 </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> 스트렙토 마이신 황산 </td><td> 시그마 </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> SLK 400 μg / ML, 300 μg / 헬러에 ML </td></tr><tr><td> 이소 프로필 - BD-thiogalactoside (IPTG) </td><td> 로슈 </td><td> 10 724 815 001 </td><td> 최종 농도 200 μg / ML </td></tr><tR&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15,630 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 바닥 요리 </td><td> MatTek </td><td> P35G - 1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> 중립 백색 LED </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 큐브 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> 계획 - 고차 색지움의 63x/1.4 목표 </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII : 1024 EMCCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 미니 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 디지털 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI 컨트롤러 3700 디지털 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 히터 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> 무대 난방 삽입 P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> 무대 위로 보육 S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> 가습기 시스템 </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

몇 자연스럽게 - 발생 plasmids은 포유류의 세포에 보관됩니다. 이 중 여러 사람이 malignancies 1-3의 원인 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 Kaposi 육종 - 관련 herpesvirus (KSHV)를 포함 감마 herpesviruses의 genomes이 있습니다. 이 두 genomes들은 부족 전통 centromeres 4-8에도 불구하고 라이센스 방식으로, 하나의 바이러스 단백질과 세포의 복제 기계를 사용하여 각 복제하고 있으며, 세포 분열 동안 딸 세포에 전달됩니다. 많은 작품은 그러한 남부 blotting 및 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광과 같은 방법을 사용하여 이러한 플라스미드 genomes의 복제를 특징 완료되었습니다. 이러한 방법은하지만 제한됩니다. 양적 PCR 및 남부 blots은 세포의 인구 세포 당 plasmids의 평균 개수에 대한 정보를 제공합니다. 물고기는 평균 수와 플라스미드의 배포를 모두 보여 단일 셀 분석입니다<html> 하지만 세포 인구의 당 세포 검사 셀의 부모 나 자손에 대한 정보를 허용하지 정적입니다. 여기, 우리는 라이브 셀의 plasmids를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 관심을 9 플라스미드의 여러 사이트에 휘황 태그 유당 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 관심 DNA는 유당 연산자 (LacO) 시퀀스의 약 250 탠덤 반복을 포함 할 수 있도록 설계되어 있습니다. LacO은 특히 형광 단백질에 융합 할 수있는 유당 억제 단백질 (LacI)에 의해 구속된다. 융합 단백질은 하나 엔지니어링 플라스미드 또는 retroviral 벡터에 의해 도입에서 표현 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, DNA 분자는 휘황 태그하므로 형광 현미경을 통해 볼 수가 있습니다. plasmids이 볼 수 할 준비가 될 때까지 융합 단백질은 IPTG의 존재의 배양 세포에 의해 플라스미드 DNA를 바인딩에서 차단됩니다. ontent는 &quot;&gt;이 시스템은 plasmids은 여러 세대에 걸쳐 세포를 생활의 합성의 속성을 드러내고과 딸 세포에 파티션에서 모니터 할 수 있습니다. 이상적인 세포가 자기편 있으며, 쉽게 transfected, 대형 핵을 갖추고 있습니다.이 기술은 결정하는 데 사용 된 것으로 EBV-파생 plasmids의 84 %가 각 세대를 합성하고 새로 합성 plasmids 파티션의 88 %가 충실하게 헬러 셀의 딸 세포에.이 EBV의 plasmids의 페어가에서 자신의 합성 이후에 묶여 또는 자매 chromatids와 관련된 것으로 볼 수 있었다 S- 그들이 Anaphase 10 구분 자매 chromatids로 분리 볼 때까지 단계가. 방법은 현재 헬러 셀 및 SLK 세포에서 KSHV의 genomes의 복제를 연구하는 데 사용하고 있습니다. 헬러 세포는 인간의 상피 세포를 불후의하고 있으며, SLK 셀이 남을 아르 내피 인간 세포. SLK 세포가 원래 KSHV의 병변에서 파생 된 있지만, 헬러이나 SLK 셀 라인도 자연스럽게 harbors KSHV의 genomes 11. 바이러스 복제를 공부하는 것 외에도,이 시각화 기술은 또한, 제거, 또는 합성, 현지화 및 기타 재조합 플라스미드 DNAs의 파티션에 대한 다양한 DNA 시퀀스 요소의 돌연변이의 효과를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

<html> 대표 실험에서 얻은 Z-스택의 최대 강도 계획은 그림 3에 표시됩니다. 일반적인 플라스미드 신호들은 단일 또는 plasmids의 클러스터 대표 여부에 따라 Z-스택의 3-8 조각,에 존재한다. 셀 유사 분열에 도달 할 때까지 EBV 및 KSHV 파생 plasmids의 경우, 신호가 세포 내에서 천천히 이동합니다. 세포 자체가 실험의 과정을 통해 마이그레이션. 또한 구형이되고 유사 분열 동안 음식에서 분리. 건강 헬러와 SLK 세포에 대한 세포주기는 약 24 시간 정도 소요되며 세포주기를 완료하는 데 30 개 이상의 시간을 이러한 유형의 세포가 건강에 해로운 것으로 간주되어야한다. 딸 세포는 일반적으로 서로 가까이에 첨부하고 다음 세포주기에서 동시에 분할로 이동하십시오. 세포주기를 완료하려면 표시 할 수 있습니다 만 셀은 분석해야합니다. 05/4305fig1.jpg &qu...

라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.

천연 발생 플라스미드 중 포유류 세포 내에서 유지되는 경우는 드뭅니다. 여기에는 Epstein-Barr virus (EBV)를 포함한 감마-헤르페스바이러스의 게놈이 포함됩니다...

본 절차의 전반적인 목적은 분열 중인 세포 내에서 바이러스 게놈의 분배를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 형광 현미경으로 시각화할 수 있는 플라스미드를 제작함으로써 수행됩니다. 여기서는 락토스 오퍼레이터 서열(LAC O)의 탠덤 반복물을 포함하도록 플라스미드를 설계합니다. 두 번째 단계는 분열 중인 세포에 이 플라스미드를 도입한 후, 형광 단백질과 융합된 락토스 억제제(lac I)를 인코딩하는 레트로바이러스를 세포에 감염시키는 것입니다.락토스 억제제 융합 단백질은 플라스미드 sub의 락토스 오퍼레이터 서열에 특이적으로 결합합니다. 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 여러 세포 주기에 걸쳐 개별 플라스미드를 추적합니다. 최종적으로, 획득한 이미지를 처리하여 분열하는 세포 내에서 바이러스 게놈이 어떻게 유지되는지 결정합니다.정량적 PCR, 서던 블로팅 또는 형광 인시튜 하이브리다이제이션과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 개별 플라스미드를 여러 시점에서 관찰할 수 있다는 것입니다. 형광 현미경으로 플라스미드를 시각화하기 위해, 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 약 250개의 락토스 오퍼레이터 서열 또는 LAC O를 포함하는 DNA 단편을 플라스미드에 도입합니다. 본 예시에서 플라스미드는 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)의 전체 게놈을 포함하고 하이그로마이신 내성을 인코딩하는 약 170 kilobase pairs의 BACMID입니다.트랜스펙션을 통해 plasmid DNA를 포함하는 LAC O를 hela 및 SLK 포유류 세포에 도입합니다. 60mm 디쉬에서 세포를 10 µg의 정제된 plasmid DNA, 25 µL의 lipectomy 2000, 0.5 mL의 Optum, 그리고 3.5 mL의 DMEM과 함께 4시간 동안 배양합니다. 배지를 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM으로 교체하고 세포를 48시간 동안 회복시킵니다.그 후, 형질전환된 세포를 커다란 배양 접시에 낮은 밀도로 도말하고, 도입된 플라스미드를 선별하기 위해 10% fetal bovine serum과 300 micrograms per milliliter hygromycin이 포함된 DMEM에서 3주 동안 배양합니다. 멸균된 팁 조각과 적신 여과지를 사용하여 hygromycin 내성 콜로니를 새로운 배양 접시로 옮깁니다. 형질전환된 클론이 접시를 가득 채울 때까지 1~2주 후 접시를 인큐베이터에 넣고, LAC O 플라스미드의 폴리머가 균일하며 예상되는 크기인지 확인하기 위해 제한효소 절단 및 southern blotting용 DNA를 분리합니다. 본 예시 블롯은 클론 1의 LAC O 폴리머가 균일하며 양성 대조군과 동일함을 보여줍니다.7번 레인에서, 플라스미드가 lactose repressor lacI 융합 단백질을 발현하도록 설계되지 않은 경우, lacI가 TD-tomato와 같은 적색 형광 단백질에 융합된 레트로바이러스를 사용하여 적절한 클론에 감염시킵니다. 장시간의 반복 노출로 인해 발생할 수 있는 광독성을 최소화하기 위해, 녹색에 가까운 형광 단백질 대신 TD-tomato가 선택되었습니다. LACI 융합 단백질이 도입되면, 융합 단백질이 DNA에 결합하는 것을 차단하기 위해 200 µg/mL IPTG가 포함된 배지에서 세포를 배양합니다. 이 과정에서 가장 중요한 측면 중 하나는 적절한 형광 강도를 가진 클론을 확보하는 것입니다.최적의 형광 배양 특성을 가진 클론을 식별하기 위해 다수의 클론을 스크리닝해야 합니다. LacI-tdTomato 단백질이 발현될 수 있도록 세포를 최소 3일 동안 배양하십시오. 결합되지 않은 융합 단백질의 배경 신호는 최소화하면서 LacI-tdTomato 수준이 최적화되어 뚜렷한 신호를 나타내는 클론을 스크리닝합니다. 이미징 24~48시간 전에 LacI-tdTomato를 발현하는 세포를 35mm 유리 바닥 배양 접시에 10% 미만의 밀도(confluence)로 플레이팅하십시오. 이렇게 하면 이미징 시작 1~3시간 전에 세포 쌍이 서로 겹치지 않고 8~16개의 세포로 구성된 콜로니로 분열될 수 있습니다.선택 약물과 IPTG가 모두 없는 배양액으로 플레이트를 세 번 헹굽니다. 이렇게 하면 생존 불가능한 세포가 씻겨 나가고 lac eye 융합 단백질이 플라스미드의 LAC 세포에 결합할 수 있습니다. 배양액을 10% 태아 송아지 혈청과 25 millimolar Hippies가 포함된 DMEM 2 mL로 교체하고 1~3시간 동안 배양합니다. 이미징 직전에 배양 접시 상단을 35 millimeter 접시용 마운팅 링에 고정된 cult foil로 덮습니다.이 덮개는 배양액의 증발을 억제하며, 증발이 일어날 경우 시간이 지남에 따라 염 농도가 증가하여 세포가 사멸하게 됩니다. 본 실험에 사용된 이미징 시스템은 전동 스테이지와 신호의 민감한 검출을 위한 EM CCD 카메라가 장착된 Zeiss Axio 200 M 도립 현미경으로 구성됩니다. 형광 여기광은 Collibra 시스템의 중성 백색 LED에 의해 제공됩니다.이미징 시스템은 다중 Z 스택을 포함하여 장시간 간격으로 이미지를 자동 획득하는 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 습윤 챔버 내에서 세포를 37 °C, 5~10% carbon dioxide 상태로 유지하기 위해 스테이지 상단 인큐베이터를 사용합니다. 대물렌즈의 사이펀 현상을 방지하기 위해 오일 대물렌즈용 가열 칼라를 사용하십시오.샘플을 가열하여 시스템이 안정적인 온도에 도달할 수 있도록 충분한 시간을 둡니다. 실험 중 움직임으로 인한 아티팩트를 최소화하기 위해, 이미징 시스템은 진동으로부터 격리될 수 있도록 에어 테이블 위에 설치해야 합니다. 표지된 DNA를 시각화하는 절차를 시작하려면, DIC 이미징을 사용하여 세포를 관찰하고 각 시야에서 세포의 상단과 하단의 초점 평면을 결정합니다. 각 시야에서 세포 상단으로부터 약 3분의 1 지점의 초점 평면으로 이동한 후, x, y, Z 좌표를 저장된 스테이지 위치 목록에 저장합니다.저장된 각 위치는 현미경 제어 소프트웨어에서 세포를 캡처하기 위한 Z-stack 이미지의 중심이 됩니다. 저장된 각 스테이지 위치에서 수행할 Z-stack 이미지를 정의하고, 세포가 위치한 평면의 위아래로 추가 슬라이스를 포함하여 세포 전체가 캡처될 수 있도록 충분한 슬라이스 수를 정의하십시오. Z축 방향으로 대략적인 나이퀴스트 샘플링(Nyquist sampling)이 가능하도록 Z 스텝 크기를 0.35에서 0.50 microns로 선택하십시오. 이러한 슬라이스들은 세포 주기 동안 발생하는 세포의 움직임을 추적할 수 있게 하며, 이미지 스택의 획득 후 처리 과정에서도 사용됩니다.이는 세포의 두께에 따라 40~60장의 이미지 스택으로 생성됩니다. 30분 간격으로 Zacks의 명시야(bright field) 이미지를 수집하고, 10~60분 간격으로 형광 이미지를 수집하는 시계열 실험을 설정하십시오. 실험 중에는 DIC 이미징을 사용하지 마십시오. DIC 이미징은 표준 명시야 이미징보다 더 많은 빛을 필요로 하며, 이는 장기 실험 과정에서 세포를 불필요한 광독성에 노출시킬 수 있습니다.소프트웨어 제어 실험을 시작합니다. 실험 중에 시스템이 방해받지 않도록 주의하십시오. 실험에 필요한 모든 이미지를 획득한 후, 각 Zack 및 시점별 이미지를 검토하고 컴퓨터 처리 시간을 단축하기 위해 이미지에서 불필요한 영역을 잘라냅니다.다음 단계에서는 각 Z 스택의 픽셀에 신호 강도를 다시 할당합니다. 이미징 시스템의 측정된 점 확산 함수(point spread function)를 기반으로 Axio vision 소프트웨어의 디콘볼루션 알고리즘을 사용하십시오. 디콘볼루션의 결과가 여기에 표시되어 있습니다.이미지를 검토하여 세포 주기 동안 플라스미드의 강도 변화와 이동, 그리고 딸세포로의 플라스미드 분배를 추적하십시오. 서로 다른 신호가 존재하는 여러 Z-평면을 포함하도록 계산적으로 생성된 이 이미지들은, 융합 단백질의 핵 국소화 신호로 인해 LAC eye TD tomato를 발현하는 HELOC 세포의 핵이 형광을 띠며 핵에 국소화되어 있음을 보여줍니다. I-P-T-G-K-S-H-V가 없는 상태에서 LAC O 서열을 인코딩하는 게놈은 많은 수의 형광 단백질을 모집하며, 핵의 배경 강도보다 밝은 신호로 나타납니다.반면, IPTG가 존재할 때 LAC eye 형광 단백질은 인식 대상인 lack O 서열에 결합하는 것이 억제됩니다. 대표적인 실험에서 다섯 번의 시간 지점에서 획득한 HeLa 세포 주기의 최대 강도 투영(maximum intensity projections)이 이 그림에 나타나 있습니다. 패널 A의 세포에서 보이는 형광 표지된 바이러스 게놈은 패널 B에 표시된 대로 합성됩니다. 이후 바이러스 게놈은 패널 C, D 및 E에서 관찰되는 것처럼 세포 분열 동안 딸세포로 분배됩니다. 건강한 HeLa 세포의 세포 주기는 약 24시간이 소요되며, 딸세포는 일반적으로 서로 가까이 부착되어 다음 세포 주기에서 동시에 분열합니다.본 프로토콜을 사용하여 세포 내 바이러스 게놈을 여러 세대에 걸쳐 추적할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 실험 전 과정 동안 세포가 건강한 상태를 유지하는지 확인하기 위해 세대 시간 동안 세포 형태를 관찰하는 것이 중요합니다.

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연구

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