형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

이 절차의 전반적인 목표는 분열하는 세포에서 바이러스 게놈의 분할을 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 형광 현미경으로 시각화할 수 있는 플라스미드를 만들어 수행됩니다. 여기서 플라스미드는 유당 오퍼레이터 서열 또는 LAC O의 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었습니다.두 번째 단계는 플라스미드를 분열하는 세포에 도입한 다음 유당 억제제 또는 형광 단백질에 융합된 lac eye를 암호화하는 레트로바이러스로 세포를 감염

유당 억제 융합 단백질은 플라스미드 하위(plasmid sub)에서 유당 연산자 서열(lactose operator sequence)에 특이적으로 결합할 것입니다. 세포는 형광 현미경으로 모니터링되어 여러 세포 주기를 통해 개별 플라스미드를 추적합니다. 궁극적으로 획득한 이미지는 바이러스 게놈이 분열하는 세포에서 어떻게 유지되는지 결정하기 위해 처리됩니다.

정량적 PCR 서던 블로팅(Southern blotting) 또는 형광 현장 유(in situ you) 혼성화와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 여러 시점에서 개별 플라스미드를 관찰할 수 있다는 것입니다. 형광 현미경 검사로 플라스미드를 시각화할 수 있도록 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 약 250개의 유당 오퍼레이터 서열 또는 LAC O를 포함하는 A DNA 단편을 플라스미드에 도입합니다. 이 예에서 플라스미드는 캡의 육종 관련 헤르페스 바이러스 또는 KSHV의 전체 게놈을 포함하고 하이그로마이신에 대한 내성을 암호화하는 약 170킬로염기쌍의 백미드입니다.

transfection을 통해 플라스미드 DNA를 함유한 LAC O를 hela 및 SLK 포유류 세포에 도입 60mm 접시에서 10마이크로그램의 정제된 플라스미드, DNA 25마이크로리터, 지방 절제술, 2000 0.5 밀리리터, Optum 및 3.5 밀리리터로 세포를 배양합니다. DMEM을 4시간 동안 사용합니다. 배지를 10% 소 태아 혈청이 함유된 DMEM으로 변경하고 세포가 48시간 동안 회복되도록 합니다.

그런 다음 형질주입된 세포를 대형 접시에서 저밀도로 플레이트화하고 DMEM에서 3주 동안 10% 소 태아 혈청 및 밀리리터당 300마이크로그램의 하이그로마이신으로 배양하여 도입된 플라스미드를 선택하고, 멸균 트립 조각과 불린 여과지를 사용하여 하이그로마이신 내성 콜로니를 새로운 배양 접시로 옮깁니다. transfection된 클론이 접시를 채우기 위해 성장하면 1-2주 후에 접시를 incubator에 넣고, 제한, 분해 및 서던 블로팅을 위해 DNA를 분리하여 LAC O 플라스미드의 중합체가 균질하고 예상되는 크기인지 확인합니다. 이 예시 블롯은 클론 1의 LAC O 폴리머가 균질하고 양성 대조군의 폴리머와 동일함을 보여줍니다.

7번째 열에서, 플라스미드가 유당 억제제인 락 아이(lactose repressor)의 융합을 발현하도록 조작되지 않은 경우, 락 아이(lac eye), TD 토마토와 같은 적색 형광 단백질에 융합된 락 아이(lac eye)를 인코딩하는 레트로바이러스로 적절한 클론을 감염시키며, 장시간에 걸친 다중 노출로 인해 발생할 수 있는 광독성을 최소화하기 위해 녹색에 더 가깝게 형광하는 단백질 대신 TD 토마토를 선택합니다. LAC 눈 융합 단백질이 도입되면 IPTG 밀리리터당 200마이크로그램의 존재 하에 세포를 배양하여 융합 단백질이 DNA에 결합하는 것을 차단합니다. 이 절차의 가장 중요한 측면 중 하나는 적절한 형광 강도를 가진 클론을 얻는 것입니다.

최적의 형광 배양을 가진 클론을 식별하기 위해 많은 수의 클론을 스크리닝해야 합니다. 세포를 최소 3일 동안 LAC eye TD 토마토 단백질 스크리닝 클론의 발현을 허용하고, 최적의 수준의 lac eye, unbound fusion protein의 최소 배경 수준으로 뚜렷한 신호를 나타내는 TD 토마토를 이미징하기 24-48시간 전에 LAC I TD 토마토 발현 세포를 10% 미만의 밀도로 35mm 유리 바닥 접시에 도금합니다. 이를 통해 세포 쌍은 이미징 시작 1-3시간 전에 겹치지 않고 8-16개의 세포 군체로 분열할 수 있습니다.

선택적 약물과 IPTG가 모두 없는 배양 배지로 플레이트를 세 번 헹굽니다. 이것은 생존할 수 없는 세포를 씻어내고 lac eye fusion 단백질이 플라스미드의 LAC cyte와 결합할 수 있도록 합니다. 배양 배지를 2ml로 교체하고, DMEM을 10% 소 태아 혈청으로 교체하고, 이미징 직전에 25밀리몰 히피를 1-3시간 동안 배양하고, 이미징 직전에 배양 접시의 상단을 35mm 접시용 마운팅 링에 늘어진 컬트 호일로 교체합니다.

이 덮개는 배양 배지의 증발을 억제하여 시간이 지남에 따라 염 농도를 증가시키고 세포를 죽입니다. 이 실험에 사용된 이미징 시스템은 Zeiss Axio 200 M 도립 현미경으로 구성되며, 여기에는 전동 스테이지와 민감한 신호 감지를 위한 EM CCD 카메라가 장착되어 있습니다. 형광 여기등은 Collibra 시스템의 중성 백색 LED에 의해 제공됩니다.

이미징 시스템은 여러 Z 스택을 사용하여 장시간 간격에 걸쳐 이미지를 자동으로 획득하기 위한 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 스테이지 탑 인큐베이터는 가습 챔버에서 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5-10%로 유지하는 데 사용됩니다. 오일 대물렌즈에 가열된 칼라를 사용하여 대물렌즈가 사이펀되는 것을 방지하십시오.

샘플의 열은 시스템이 안정적인 온도에 도달할 수 있는 충분한 시간을 허용합니다. 실험 중 움직임 아티팩트를 최소화하기 위해 이미징 시스템은 진동으로부터 격리된 에어 테이블에 위치해야 합니다. 레테르를 붙인 DNA를 가시화하기를 위한 절차를 시작하기 위하여는, 세포를 전망하기 위하여 DIC 화상 진찰을 이용하고 각 분야에 있는 다수 화각에 있는 세포의 정상 그리고 바닥의 초점 평면을 결정하고, 세포의 정상에서 방법의 대략 1/3 아래로 초점 평면으로 이동하고, x를 저장하십시오, y, Z 저장된 스테이지 위치 목록의 좌표입니다.

이러한 저장된 각 위치는 현미경 제어 소프트웨어에서 셀을 캡처하고, 저장된 각 스테이지 위치에서 수행할 Zack의 이미지를 정의하고, 셀이 위치한 평면 위와 아래의 추가 슬라이스와 함께 전체 셀이 캡처될 수 있도록 충분한 슬라이스를 정의하기 위한 이미지 Zack의 중심이 됩니다. Z 차원에서 대략적인 나이퀴스트 샘플링을 허용하려면 0.35 - 0.50미크론의 Z 단계 크기를 선택합니다. 이러한 슬라이스를 사용하면 세포 주기 동안 세포의 움직임을 따라 검출할 수 있으며 이미지 스택의 획득 후 처리에도 사용됩니다.

이렇게 하면 셀의 두께에 따라 40-60개의 이미지가 쌓이게 됩니다. 시계열 실험을 정의하여 30분 간격으로 Zacks의 명시야 이미지를 수집하고 10분에서 60분 간격으로 형광 이미지를 수집합니다. DIC 이미징은 표준 명시야 이미징보다 더 많은 빛이 필요하므로 장시간 실험 과정에서 세포를 광독성에 불필요하게 노출시킬 수 있으므로 실험 중에는 사용하지 마십시오.

소프트웨어 제어 실험을 시작합니다. 실험하는 동안 시스템이 방해받지 않는지 확인하십시오. 실험을 위한 모든 이미지를 획득한 후 각 Zack과 시점에 대한 이미지를 검토하고 이미지에서 불필요한 영역을 잘라내어 컴퓨터 처리 시간을 줄입니다.

다음 단계에서는 신호 강도를 각 Z 스택의 원점 픽셀에 재할당합니다. 이미징 시스템의 측정된 포인트 스프레드 함수를 기반으로 Axio 비전 소프트웨어에서 디콘볼루션 알고리즘을 사용합니다. 디콘볼루션의 결과는 다음과 같습니다.

이미지를 검사하여 세포주기 동안 플라스미드의 강도 변화와 움직임을 추적하고 플라스미드가 딸 세포로 분할되는 과정을 추적합니다. 서로 다른 신호가 존재하는 여러 Z 평면을 포함하도록 계산적으로 만들어진 이러한 이미지는 LAC eye TD tomato를 발현하는 HELOC 세포의 핵이 융합 단백질의 핵 국소화 신호로 인해 형광을 띠어 핵으로 국소화됨을 보여줍니다. LAC O 염기서열을 암호화하는 I-P-T-G-K-S-H-V 게놈이 없는 경우 형광 단백질의 많은 사본을 모집하고 핵의 배경 강도에서 밝은 신호로 두드러집니다.

대조적으로, IPTG의 존재 하에서, LAC 눈 형광 단백질은 인식 부족 O 서열, 5 시간에 세포 주기의 획득 Zack의 최대 강도 투영에 결합하는 것을 방지합니다. 대표 실험의 점들이 이 그림에 표시되어 있습니다. 패널 A에서 볼 수 있는 세포에서 형광 표지된 바이러스 게놈은 패널 B.The 바이러스 게놈은 패널 C, D 및 E.The 패널 C, D 및 E.The 세포 주기에서 관찰된 바와 같이 세포 분열 중에 딸 세포로 분할됩니다.건강한 HELOC 세포를 위한 세포 주기는 약 24시간이 소요되며 딸 세포는 일반적으로 서로 가까이 부착되어 다음 세포 주기에서 동시에 분열합니다.

이 프로토콜을 사용하면 이 절차를 시도하는 동안 세포의 바이러스 게놈을 여러 세대에 걸쳐 추적할 수 있습니다. 실험 내내 세포가 건강한지 확인하기 위해 생성 시간에 세포 형태를 관찰하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.