의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜 변형체 falciparum의 - 감염된 적혈구
May 16th, 2013
이 메소드는 혈소판 응집 매개 표현형을 조사 변형체 falciparum의에 감염된 적혈구 (pRBC). 이 혈소판이 풍부한 혈장과 pRBC의 현탁액을 분리하고 공동 배양에 의해 수행됩니다.
이 절차는 임상 또는 실험실 plasmodium false parem 분리물의 혈소판 매개 응집 분석을 수행하기 위한 몇 가지 표준화된 지침을 제공합니다. 먼저 감염된 환자의 혈액을 채취하여 원심분리로 기생충 적혈구를 채취한 다음, 무성 성숙기를 배양하고 정제합니다. 다음으로, 원심분리를 통해 혈소판이 풍부한 혈장을 준비하고 표준화하기 위해 건강한 헌혈자로부터 혈액을 수집합니다.
응집된 분석을 위해 혈소판과 기생된 적혈구를 모두 결합합니다. 면역형광 현미경 검사 결과에서 혈소판에 의해 매개되는 P Fal 정자 덩어리를 보여줄 수 있다고 말합니다. 이 기술은 자원이 부족한 환경에서 plasmodium sra.Clinical isolates의 응집형 표현형을 측정하기 위해 특별히 고안되었습니다
. 절차의 최소한의 변화는 현장에서 산성 응집의 결과에 영향을 증가시키는 것으로 보고되었습니다. 따라서 말라리아 풍토병 현장 전반에 걸쳐 표준화하기 위해 낮은 자원 설정에 맞게 조정된 명확하고 따르기 쉬운 프로토콜이 필요했습니다: 구연산나트륨에서 바큐테이너는 말라리아 미인 숙주로부터 약 5ml의 전혈 또는 CM 또는 SM 말라리아 환자로부터 2.5ml의 혈액을 수집합니다.
전혈을 실온에서 250G으로 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 탁한 상층액을 깨끗한 15ml 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 혈소판은 온도, 변화 및 물리적 충격에 의해 쉽게 활성화된다는 것을 기억하십시오.
성가신 bower's, hemo cytometer를 사용하여 PRP 현탁액을 열거하고 PBS로 원하는 농도로 조정하여 1500GS에서 10분 동안 원심분리하여 PRP 분획의 일부에서 대부분의 혈소판인 혈소판 불량 혈장 펠릿을 얻습니다. PRP 및 PPP 분획을 섭씨 4도에서 최대 8일에서 10일 동안 보관하십시오. 응집 분석을 위해 새로운 혈소판을 사용하는 것이 이상적입니다.
펠릿화된 말초 적혈구를 5-10ml의 RPMI 1640으로 3회 세척하고 표준 말라리아 배양액, 중간 및 신선한 감염되지 않은 적혈구를 배양 플라스크 보충제 PRBC에 넣어 5%의 헤마토크릿을 달성합니다. 질소 92.5%, 산소 2.5%, 이산화탄소 5%의 혼합물로 배양 플라스크를 투과합니다. 그런 다음 환자 pbcs의 성숙한 기생충을 밀봉하고 배양합니다.
배양 플라스크를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 24-36시간 동안 5%이산화탄소로 배양합니다. 평평한 표면에 놓인 젖빛 유리 슬라이드의 한쪽 끝에 약 10-15 마이크로 리터의 혈액을 놓습니다. 두 번째 슬라이드를 45도 각도로 유지하면서 혈액이 두 번째 슬라이드의 가장자리에 고르게 퍼질 때까지 두 번째 슬라이드의 가장자리로 혈액 방울을 만집니다.
첫 번째 슬라이드에 너무 많은 압력을 가하지 않고 빠르지만 부드럽게 첫 번째 슬라이드에 혈액을 고르게 펴 바릅니다. 그런 다음 혈액의 박막을 자연 건조하고 10 초 동안 메탄올로 표본 영역을 탈수합니다. 그런 다음 공기 건조하고 표본을 2% keem으로 담그십시오.
최소 10분 동안 지속합니다. 물이 맑아지고 자연 건조될 때까지 광범위하게 헹굽니다. 광학 현미경의 100 x 오일 에멀젼 렌즈 아래에서 샘플을 검사합니다.
다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 성숙한 PFS parum, PRBC를 정제하고 동기화합니다. 모두 배양물을 깨끗하고 멸균된 15ml 튜브로 옮깁니다. 실온에서 370GS에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛
화합니다.이제 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡입하십시오. 그런 다음 전체 부피의 절반이 젤로 융합이 되도록 세포를 재현탁합니다. 후반부의 1/3은 단백질이 없는 배지이고 후반부의 2/3는 pbcs입니다.
현탁액을 멸균 15ml 튜브로 옮기고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 상위층과 하층 사이에 명확한 경계가 형성될 때까지 15-20분 동안 배양합니다. 상층을 새 멸균 15ml 튜브로 조심스럽게 옮기고 370-430GS에서 5분 동안 10ml의 새 RPMI 원심분리기를 추가합니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
이제 얇은 혈액 도말로 parsit 및 발달 단계를 평가하고 앞에서 설명한 대로 광학 현미경으로 검사합니다. 플라즈마 겔 부유 선광 후 얻은 P RBC 현탁액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에서 마이크로리터당 8번째 P RBC의 1배로 조정합니다. 우리는 5%의 헤마토크리트, 아인 오렌지 또는 아테륨 브로마이드에서 PBC를 밀리리터당 20마이크로그램, 최종 농도 및 PRP를 총 부피의 10%로 현탁합니다.
마찬가지로, 감염되지 않은 적혈구와 PRP 및 PRBC를 PPP로 조절하여 PBC의 응집에서 혈소판의 역할을 확인합니다. 이제 서스펜션을 2ml 스크류 캡 바이알로 옮깁니다. 실온에서 10-12 RRP로 굴려 바이알을 부드럽게 교반하고 총 15-20분 간격으로 샘플링하여 총 120분 동안 덩어리 형성을 확인합니다.
유리 슬라이드에 시료 10 마이크로 리터를 피펫팅하고 형광 하에서 검사하기 위해 유리 슬립으로 덮고, 덩어리는 3 개 이상의 감염된 적혈구 세포의 집합체로 간주됩니다. 이 실험은 플라즈마 겔 부유 선광에 의한 농축 후 p FALs parem의 약 70% 성숙 단계를 분석했으며, 덩어리는 일반 광선에서와 같이 현미경으로 쉽게 발견됩니다. 그들은 세포 응집체로 나타나고 형광 아래에서는 녹색 또는 빨간색 반점으로 나타납니다.
아크로와 오렌지 또는 아테륨으로 염색하면 브로마이드가 각각 죽습니다. 덩어리 크기는 120분 동안 배양한 후 덩어리당 평균 15pbs 이상으로 크게 증가하며, 일부 덩어리에는 육안으로 계산할 수 없는 덩어리당 많은 pbc가 포함되어 있습니다. 응집 표현형의 빈도는 중복 분석에서 계산된 1,000개의 감염된 세포당 덩어리에 존재하는 감염된 세포의 수로 계산됩니다.
이 비디오를 시청한 후에는 이제 plasmodium falciparum, 혈소판 매개 응집 분석을 수행하는 방법을 명확하게 이해하게 되었을 것입니다. 급격한 움직임과 온도 변화로 혈소판이 활성화되지 않도록 주의하십시오. 이 분석은 중증 말라리아에서 혈소판 매개 응집 분석을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다.
개요
이 방법은 임상 분리주에서 팔시파룸 말라리아 감염 적혈구의 혈소판 매개 응집 표현형을 조사합니다. 이 절차는 혈소판 농도가 높은 혈장과 기생충에 감염된 적혈구 현탁액을 분리하여 공동 배양하는 것을 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 미생물학
- 임상 연구
배경
- 혈소판 매개 응집은 말라리아 병리학에서 중요한 현상입니다.
- 이 응집을 이해하면 말라리아 중증도를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 표준화된 방법은 연구의 재현성을 위해 필수적입니다.
- 이 연구는 자원이 부족한 환경에서 임상 분리주에 초점을 맞추고 있습니다.
연구 목적
- 혈소판 매개 응집 분석을 위한 표준화된 프로토콜을 개발합니다.
- 팔시파룸 말라리아의 응집 표현형을 측정합니다.
- 말라리아 만성 지역에서의 연구를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 감염된 환자 및 건강한 기증자로부터의 혈액 수집.
- 기생충에 감염된 적혈구를 분리하고 혈소판 농도가 높은 혈장을 준비하기 위한 원심분리.
- 혈소판과 기생충에 감염된 적혈구의 공동 배양.
- 면역형광 현미경을 사용한 응집 평가.
주요 결과
- 임상 분리주에서 응집 표현형이 성공적으로 측정되었습니다.
- 변동성을 최소화하기 위한 혈소판 활성화 조건이 식별되었습니다.
- 결과는 배양 후 중요한 응집 형성을 나타냈습니다.
- 응집 크기는 시간에 따라 유의하게 증가하여 활성 응집을 나타냅니다.
결론
- 이 분석은 말라리아 병리를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 일관된 결과를 위해 표준화가 매우 중요합니다.
- 이 방법은 저자원 환경에서 사용하도록 적응될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes provides a measurable phenotype linked to malaria severity in endemic populations. Standardizing this assay enables consistent evaluation of parasite adhesion mechanisms across resource-limited field sites. This supports target validation and mechanistic de-risking in antimalarial therapeutic development by linking in vitro phenotypes to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-parasite adhesion pathways involving CD36 and gC1qR/HABP1/p32 receptors.
- Operational Value: Provides a standardized method to assess clumping phenotype in clinical isolates without cryopreservation.
- Predictive Value: Links in vitro clumping frequency to disease severity in patient populations, supporting biomarker association studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses platelet-rich plasma and purified parasitized erythrocytes to generate quantitative clumping readouts.
- Reproducibility: Defines centrifugation, incubation, and sampling intervals to minimize variability in low-resource settings.
- Scalability: Requires minimal equipment (centrifuge, microscope) enabling deployment across malaria-endemic field sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects platelet-mediated clumping to severe malaria phenotypes observed in pediatric cerebral malaria cases.
- Translational Continuity: Allows progression from field isolate testing to mechanistic studies of adhesion receptor inhibition.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of compounds or antibodies that disrupt platelet-mediated clumping in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the malaria discovery continuum from early target validation to preclinical evaluation of adhesion-blocking interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of parasite ligand-receptor interactions involved in sequestration and microvascular pathology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (clump frequency and size) for evaluating compound effects on platelet-mediated aggregation.
- Analytics: Generates measurable endpoints—clump frequency per 1000 infected cells and average clump size—enabling comparison across isolates and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro phenotyping with ex vivo clinical correlations from severe malaria patient cohorts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing adhesion phenotypes across diverse Plasmodium falciparum strains and geographic isolates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in parasite sequestration by quantifying a receptor-mediated adhesion phenotype.
- Operational Value: Ensures standardization through defined platelet preparation, parasite enrichment, and timed incubation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in antimalarial programs by identifying compounds that inhibit pathogenic adhesion mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro clumping inhibition to potential reduction in severe malaria outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in parasitology, blood handling, and microscopy for accurate isolate preparation and clump detection.
- Dependent on centrifuge access for platelet-rich plasma preparation and parasitized erythrocyte purification.
- Necessitates standardization of agitation speed (10–12 rpm) and sampling intervals (15–20 min) across sites to ensure reproducibility.
- Must account for platelet sensitivity to temperature shifts and mechanical stress during isolation and assay setup.
- Limited to qualitative and semi-quantitative readouts unless paired with automated imaging or flow cytometry for high-throughput adaptation.
