Name: 의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜 변형체 falciparum의 - 감염된 적혈구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 학습하세요 Plasmodium falciparum 감염 적혈구의 혈소판 매개 응집 분석법을 임상 격리주에서 사용하는 방법입니다. 이 표준화된 프로토콜은 말라리아 병리 연구와 저자원 환경 적용에 유용합니다.

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이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)의 자금 지원에 의해 가능하게되었다. JM (080964)와 SCW (080948)는 말라위 리버풀 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)에 재학 의해 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)의 장학금 및 DT에 의해 지원되었다.

1. 시료 채취 혈소판은 쉽게 온도, 교반 또는 스토리지를 통해 활성화 될 수 있으므로 그들은 조심스럽게 취급해야합니다. 혈소판 준비를위한 혈액을 수집 vacutainers의 사용은 대부분의 임상 상황에서 피할 수 있지만, 흡입 가능성이 혈소판 활성화를 일으킬 수 있으므로 신중하게 고려되어야한다. 우리의 연구 병원에서 사용하는 임상 프로토콜로 인해, 우리의 견본을주의 깊게 구연산 나트륨 vacutainers에 수집됩니다. 우리는이 또는 우리의 이전 연구 12 조기 혈소판 활성화에 대한 어떤 문제가 발생하지 않았습니다. 우리는 비특이적 혈액 그룹 항원 응집을 최소화하기 위해 혈액형 O + 개인의 혈소판 준비를위한 혈액을 수집합니다. 기증자는 또한 일부 약물은 혈소판 기능에 영향을 미치는 알려진대로 이전 7-10 일에서 약물을 촬영하지 않았습니다. 혈소판이 풍부한 혈장의 1.1 준비 (PRP) <ol><li> 약 5 mL를 수집CM 심한 말라리아 (SM) 구연산 나트륨 vacutainer 환자 (BD 제품 번호 36276)에서 말라리아 순진 호스트 또는 혈액의 2.5 ML에서 전혈. </li><li> 실온에서 10 분 250 XG에서 전체 혈액을 원심 분리기. 낮은 온도가 집계 혈소판의 원인이 될 수 있습니다 ° C로 4에서 원심 분리하지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 깨끗한 15 ML 튜브에 흐린 뜨는을 전송합니다. 혈소판은 쉽게 온도 변화 및 물리적 충격에 의해 활성화되어 있으므로 취급에주의해야한다. 동요 또는 관의 육포 움직임을 피하십시오. </li><li> &gt; 300 혈소판 현탁액을 계산하고 조정 네우 바우의 haematocytometer을 사용하여 X 10 3 혈소판 / 건강한 기증자에 대한 μL와 &lt;150 × 10 3 혈소판 / CM 및 1X 인산염 완충액 (pH가 7.2-7.4, PBS)를 사용하여 SM 환자에서 μL. 혈소판을 완화하고 정확성을 보장하기 위해 높은 희석 배수를 선택해야합니다. </li></ol> 참고 : 말라리아 퍼트의 ients는 건강한 개인 16,17,18에 비해 감소 된 혈소판 수 있습니다. CM 및 UM에 대한 그러므로 혈소판 농도는 각 말라리아 진단 그룹 내에서 환자의 평균 혈소판 수에 따라 조정됩니다. P. falciparum의 응집 표현형 CM 균주에서 흔히 혈소판 농도가 모든 CM의 경우 표준화되어 있기 때문에 덩어리의 크기 나 빈도에 영향을주지 않는 강한 결합력 때문에 감소 된 혈소판 농도를 표시합니다. 혈소판 가난한 플라즈마의 1.2 준비 (PPP) <ol><li> PPP를 얻으려면, 10 분 1,500 XG에서 위에서 얻은 PRP의 일부를 원심 분리기. 혈소판의 대부분은 튜브의 바닥에 침전이다. </li><li> PRP와 PPP 모두 최대 2 주에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이상적으로, 응집 분석을 위해 신선한 혈소판을 사용합니다. 8-10일 후 혈소판의 대부분은 비활성 아마 집계 될 가능성이 있습니다. </li></ol> 2. 항ITE 문화 <ol><li> 5 분 370 XG에서 원심 분리하여 5-10 ML RPMI 1640 펠렛 pRBC 세 번 씻으십시오. 참고 :이 프로토콜의 모든 문화가 약​​ 1 ML 포장 세포 볼륨 (PCV)에서 시작하고 5 %의 용적률로 유지. 문화는 pRBC의 PCV 시작하고 원하는 혈소판에 도달하는 감염되지 않은 RBC와 미디어를 적절하게 조정할 수 있습니다. </li><li> 25 MM의 HEPES, 5 % Albumax II 또는 10 %의 혈청 및 40 ㎍ / 5 % 용적률을 달성하기 위해 ML의 젠타 마이신과 보충 RPMI 1640 표준 말라리아 배지와 배양 플라스크 보충 pRBC를 놓습니다. </li><li> 씰링 및 배양하기 전에 92.5 %의 질소, 2.5 % 산소와 5 % 이산화탄소의 혼합과 문화 플라스크를 침투. 또한, Trager-젠슨의 빵빵한 촛불 항아리 방법을 사용할 수 있습니다. </li><li> pRBC 환자로부터 직접 획득을 위해, 성숙한 기생충을 얻기 위해 5 % CO 2에서 37 ° C 배양기에서 24-36 시간 동안 그들의 문화 플라스크를 품어. 참고 : MOST 실험실과 문화 적응 라인은 표준 조건 하에서 문화를 유지하는 것은 매우 쉽습니다. 성장률을 유지하기 위해 다른 기생충 단계를 동기화하는 데 사용할 수있는 아래에 설명 된 간단한 기술이 있습니다. </li><li> 아래에 설명 된대로가는 혈액 얼룩을 준비하고 광학 현미경으로 기생충 성숙을 검사합니다. </li></ol> 3. 얇은 피 필름 슬라이드 준비 <ol><li> 평평한 표면에 쉬고 젖빛 유리 슬라이드의 한쪽 끝에서 혈액의 약 10 ~ 15 μl를 놓습니다. </li><li> 혈액이 균등하게 두 번째 슬라이드의 가장자리에 분산 될 때까지 두 번째 슬라이드의 가장자리 혈액의 드롭을 누릅니다. </li><li> 첫 번째 슬라이드에 너무 많은 압력을 발휘하지 않고, 신속하게 조심스럽게, 각도 45 °에서 두 번째 슬라이드를 누른 상태에서 균일하게 분산되어 혈액의 박막을 만드는 첫 번째 슬라이드에 걸쳐 혈액을 밀어 넣습니다. 건조한 공기. </li><li> 10 초 동안 메탄올에 슬라이드를 찍어. 건조한 공기. </li><li> 2 % Giemsa 성에서 슬라이드를 찍어적어도 10 분 동안 아인. 물이 나올 때까지 광범위하게 씻어 낸다. 건조한 공기. </li><li> 가벼운 현미경 90 100X 오일 에멀젼 렌즈를 사용하여 슬라이드를 검사 </li></ol> 4. 성별이 단계의 정제 및 동기화 성숙한 P.의 정화 falciparum의 pRBC는 응집 분석에 필요한 단계입니다. 실제로, 단지 성숙 기생충은 해당 리간드가 표현 감염된 적혈구의 표면에서 돌출되는이 수명주기 단계에로 혈소판 수용체에 결합 할 수있다. P.의 무성 단계를 정화하고 동기화하는 방법은 여러 가지가 있습니다 원충 : 늦은 무성 단계가 Percoll 기울기 19을 충실 할 수 있으며, 20 정렬 또는 젤라틴 침전 21 프로토콜을 사용하여 자기 세포는 여기에 설명.. 소르비톨 동기화는 (아무 N에 고리가 성숙 단계를 얻기 위해 24 ~ 26 시간 동안 배양 한 후, 링 단계 22으로 선택) 젤라틴 부양을 수행 할 EED. 4.1 Plasmagel의 부상 Plasmagel 부양은 밀도가 링 형태와 근엽이 바닥으로 가라 동안 낮은 무게 용액에 남아있는 적혈구를 혹 모양은 선택할 수있는 젤라틴과 같은 솔루션을 사용합니다. 이 기술은 성숙 단계에 감염된 적혈구의 90 % 순도를 포기하고 필드와 실험실 균주 모두에 사용할 수 있습니다. 그러나, 앞서 언급 plasmagel 부양은 rosetting pRBC뿐만 아니라 높은 rosetting 주파수와 그 샘플에서 감소 응집 주파수에서 발생할 수 미성숙 단​​계를 제거합니다. 응집은 혈소판에 의해 pRBCs 바인딩 매개하는 동안 rosetting이 pRBC과 감염되지 않은 적혈구의 상호 작용이기 때문에, plasmagel 부양 후 rosetting pRBC의 부재는 응집 분석에 영향을주지 않습니다. 이러한 두 가지 특성에 관련된 리간드는 다른, 주로 rosetting을 매개 감염되지 않은 적혈구의 수용체 CR-1을 보완와 함께.<ol><li> ° C의 물을 욕조에 37 Prewarm Gelofusine 솔루션 및 혈청 / Albumax II - 무료 매체. </li><li> 5 분 370 XG에 실온에서 원심 분리하여 깨끗하고 멸균 15 ML 튜브 및 펠렛 세포에 문화를 전송할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 대기음하는만큼 Gelofusine과 단백질이없는 매체의 동일한 볼륨 펠렛과를 Resuspend 세포를 방해하지. </li><li> 멸균 15 ML 튜브에 혼합물을 전송하고 명확한 경계가 상부와 하부 레벨 사이에 볼 수있을 때까지 37 ° C 배양기에서 15 ~ 20 분 동안이나 방치. </li><li> 조심스럽게 신선한 멸균 15 ML 튜브에 상위 레이어를 전송하고 신선한 RPMI의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 5 분 370 XG에 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li><li> 얇은 혈액 얼룩에 의해 parasitaemia 및 발달 단계를 평가하고 4 장에서 설명한대로 빛을 현미경으로 검사합니다. </li></ol> 참고 : 감염된 적혈구 dependi 60-90 % 범위 성숙한 pRBC 범위문화의 초기 parasitaemia에 NG. 성숙 기생충의 높은 비율을 위해, ≥ 10 %의 초기 parasitaemia와 문화를 사용합니다. 5. 분석을 응집 <ol><li> 1 plasmagel 부상 후 얻은 pRBC 현탁액을 계산하고 조정 네우 바우의 haematocytometer을 사용하여 X 10 8 μL / pRBC. </li><li> 신선한 1.5 ML 튜브에 20 ㎍ / 총 부피의 10 %에 ML 최종 농도와 PRP 5 %의 용적률, 아 크리 딘 오렌지에서를 Resuspend pRBC. 대신 크리 딘 오렌지, 기생충 문화는 사용하기 전에 5 분 동안 25 ㎍ / ㎖ ethidium의 브로마이드 물들 일 수 있습니다. 200 μL 반응 혼합을 위해 예를 들면, 10 μL 성숙한 pRBC, 300 X 10 3 혈소판 / 건강한 기증자 또는 150 × 10 3 혈소판 / SM 환자에서 μL 단백질이없는 배지 170 μL에서 PRP에 대한 μL의 20 μL를 추가합니다. 참고 : 혈소판의 비율 : pRBC 최종 반응에 20:1입니다. 격언이 허용되는이 중요합니다음 시료의 응집 주파수를 결정합니다. 적은 수의 혈소판이 컨트롤에 추가하는 경우 다음 모든 응집 pRBCs는 덩어리로 기회를 가질 수 없습니다. </li><li> pRBCs의 응집에서 혈소판의 역할을 확인하기 위해 감염되지 않은 적혈구 세포와 PRP와 PPP와 pRBC, 같은 방법으로 다음 컨트롤을 준비합니다. </li><li> 1.5-2.0 ML 원뿔 스크류 캡 병에 현탁액을 전송합니다. </li><li> 실온에서 10 ~ 12 rpm으로 회전에 의해 교반에 따라 병을 놓습니다. </li><li> 유리 미끄러 형광의 밑에 검사와 커버 pRBC의 10 μl를 피펫으로 제조 젖은 슬라이드 ± 유리 슬라이드에 혈소판 믹스 덩어리 형성을 확인합니다. </li><li> 샘플링은 120 분의 총 15 ~ 20 분 간격으로 수행 할 수 있습니다. 덩어리가 세 개 이상의 감염된 적혈구의 집계로 간주됩니다. </li></ol>

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</ol>

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우리가 직접 현장에서 임상 균주에 pRBC을 공부하는 데 사용되는 혈소판 응집 매개 분석을 설명했습니다. 혈소판 매개 응집, P.의 특성 행동 의 falciparum 균주는 CD36 바인딩을 분리 12,23-24에서 자주 별개의 접착제 표현형으로 확인되었습니다. 1) P.의 체외 응집 표현형에 강한 우리는 세 가지 주요 포인트를 확인하기 위해이 분석을 사용했습니다 falciparum의 질병의 심각도 및 진단 2) CD36, 3과 함께 혈소판의 응집 새로운 수용체 P-셀렉틴의 mediaties) CM 환자에 존재하는 혈소판 감소증의 정도와 연관되어 말라위 어린이의 고립은에 pRBC 덩어리의 더 형성을 제한하기에 충분 관내 12. 덩어리 형성 혈소판의 참여는 6 장에 설명 된대로 젖은 슬라이드 준비 검사에 의해 입증된다. 혈소판은 빠른 속도로 원심 분리하여 PRP에서 분리 될 수혈액 그룹 항원 반응을 최소화하기 위해, 그러나, 우리는 무리한에서와 고속 원심 분리에서 조기 혈소판 활성화를 최소화하기 위해 전체 PRP를 사용했습니다. 혈소판 활성이 약한 혈소판 작용제, 에피네프린 또는 26에 설명 된 아데노신이 인산염 (ADP) 25를 사용하여 혈소판 응집 검사로 측정 할 수 있습니다. 이전 저조한 특징 된 분석의 여러 측면, PRP 소스와 분석의 결과에 혈액 항원 그룹의 효과를 선택의 중요성되고 그 중 하나가 있습니다. 우리는 혈액형 O 있었다 개인의 PRP를 준비 + 약간의 제약이 혈소판의 동작에 영향을 미칠 수있는 혈액이 그려지기 전에 지난 7-10 일에서 어떤 약물을 촬영하지 않았다. 성공을 응집에 영향을 줄 수있는 다른 요인 pRBC 헤마토크릿, parasitaemia 수준 및 응집 분석의 길이 있습니다. 높은 적혈구 및 혈소판 공동 사용이 클러스터가 정말 덩어리거나 그들이 밀도 15 포장 때문에 있는지 너무 많은 세포가 단순히 함께 앉아 있는지 여부를 말할 어려울 것 UNT. 응집은 일반적으로 더 긴 배양 시간에 따라 증가한다. 이러한 응집 연구를 설계 할 때 고려해야 할 모든 유용한 지침입니다. 우리는 다른 임상 그룹의 샘플은 그렇게 할 수있는 경우 병렬 같은 기증자로부터 PRP를 사용하여 분석 할 수 있지만, 이러한 필드 사이트와 같은 제한된 리소스 설정에서 수혈 풀은 일반적으로 제한됩니다 찾을 수 있습니다. 그것은 분석을 표준화하는 단일 입출력 + 기증자를 가지고하는 것이 어렵습니다. 따라서 우리는 가능한 혈액형의 호환성을 보장하기 위해 몇 가지 O + 기증자를 발견. 헌혈의 부담은 한 개인에 빠지지 않도록 여러 기증자를 사용하면 큰 샘플 크기의 경우에 도움이됩니다. 단일 PE 경우 15 ~ 20 분의 샘플링 포인트는 훨씬 더 실현 가능rson 젖은 슬라이드 준비를 허용하고 중복 샘플링 시간없이 분석 속도론을 수행 분석을 진행하고 있습니다. 현미경 데이터의 대부분은 시각과 다소 객관적이며, 따라서 세포 계수는 한 사람 이상으로 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우, 한 번에 하나의 샘플을 처리하는 것은 개인의 효율에 따라 3-4 샘플 하루의 완전한 분석을 할 수 있습니다. 혈소판 응집 매개 임상 및 실험 균주 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험실 라인을 위해, 그것은 CD36 바인딩 기생충이 응집 주파수를 극대화하는 데 사용하는 것이 좋습니다. 분석은 이러한 rosetting 또는 pRBC 바인딩이 표현형 제대로 이해하고 검토 측면을 중재 할 수 혈소판 수용체의 연구를 가능하게 할 저해 분석을 응집에 사용되는 다른 응집 분석과 결합 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870-092</td><td> </td></tr><tr><td>Acridine orange</td><td>Invitrogen</td><td>A3568</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelofusine</td><td>B Braun</td><td>Gelofusine</td><td> </td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td> </td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Invitrogen</td><td>15750045</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Albumax</td><td>GIBCO</td><td>1102-037</td><td> </td></tr><tr><td>Sodium citrate vacutainer</td><td>BD</td><td>362760</td><td>4 ml 용량</td></tr><tr><td>도립현미경</td><td>Leica</td><td>MD16000 B</td><td> </td></tr><tr><td>형광현미경</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>acridine orange 및 ethidium bromide용 청색 및 녹색광 형광 필터 포함</td></tr></tbody></table>

의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜<em&gt; 변형체 falciparum의</em자원별로 설정에서&gt; - 감염된 적혈구

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum의 심각한 말라리아 감염의 대부분을 발생합니다. 대뇌 말라리아 (CM)를 기본 병태 생리 학적 메커니즘은 완전히 이해되지 않고 여러 가설 P.에 의해 미세 혈관의 기계적 폐색 등, 앞으로 넣어왔다 열대열 - 기생 적혈구 (pRBC). 실제로, 수명주기의 내부 erythrocytic 단계에서, P. 의 falciparum은 적혈구 막에 접착 특성 변화와 표면 항원을 수출하여 감염된 적혈구의 표면을 수정하는 독특한 능력이있다. 이 포스트 모세 혈관 소정맥 1의 미세 혈관을 안감 내피 세포에 부착하여 여러 조직과 장기에 pRBC의 격리를 할 수 있습니다. 이렇게함으로써, 기생충의 성숙한 형태의 변형 감염된 적혈구의 비장의 허가를 피하기 2 더 유리한 낮은 산소 압력이 3 자신의 환경을 제한합니다. 이 SEQUEST의 결과로배급은, 그것은 단지 미숙 무성 기생충 및 말초 혈액에서 검출 될 수 생식 모세포이다. 미세 혈관 침대에 표현 된 여러 호스트 수용체 성숙 pRBC의 Cytoadherence과 격리는 심각하고 복잡 질환에서 발생합니다. 그러나 여러 가지 증거가 특정 접착제 표현형은 말라리아의 심각한 병리 결과와 연관 될 가능성이하는 것이 좋습니다. 이러한 특정 호스트 - 기생충 상호 작용의 한 예는 특정 접착 특성을 가진 pRBC의 바인딩을 지원하는 세포 간 접착 분자 1의 능력은 4,5 대뇌 말라리아의 발전에 연결되어 있습니다 체외에서 입증되었습니다. 태반은 또한 chondrotin 염, 말라리아에 감염된 임신 여성 우대 pRBC 축적의 사이트로 인식되어왔다 syncytiotrophoblasts에 표현 그 라인의 주요 수용체로 6 태반 intervillous 공간. pRBC t의 Rosetting보완 수용체 1 (CD35) 7,8를 통해 O 감염되지 않은 적혈구는 심각한 질병에 9와 연결되었습니다. 가장 최근에 설명 P. 중 하나 열대열 cytoadherence의 표현형은 체외에서 혈소판 매개 대단히 짧은 시간을 형성하는 pRBC의 능력입니다. 이러한 pRBC 덩어리의 형성은 CD36, 혈소판의 표면에 표현 된 당 단백질을 필요로합니다. 내피 세포 및 혈소판 등 다양한 세포 유형에 표현하는 또 다른 인간의 수용체 gC1qR/HABP1/p32는 또한 수풀이 10을 형성하는 혈소판에 pRBC 접착을 용이하게하기 위해 표시되었습니다. 생체 내에서 발생 응집은 불분명 남아 있지만, CM 11 일부터 사망 말라위 어린이의 뇌 미세 혈관에 설명 된 혈소판의 상당한 축적을 설명 할 수 있는지. 또한, 임상의 능력은 체외에서 덩어리에 문화를 격리 직접 말라위 12 질병의 심각도에 연결되었습니다 </sup&gt;와 모잠비크 환자 13 (아니지만 말리 14). 가난 특징 pRBC 응집 표현형의 여러 측면과 함께,이 주제에 대한 현재의 연구는 표준화 된 절차를 준수하지 않았습니다. 이 때문에 분석 15 고유 알려진 높은 변동성 중요한 문제입니다. 여기, 우리는 P.의 체외 혈소판 매개 응집에 대한 방법을 제시 그것은 다른 그룹에 대한 일관된 방법을위한 플랫폼을 제공하고 미래의 연구에서이 표현형을 조사에 한계에 대한 인식을 제고 할 것으로 기대를 가진 원충. 말라위에 기반이기 때문에, 우리는 새롭게 수집 된 균주는 냉동 보존을위한 필요없이 표현형 검사 할 수 있다는 장점과 함께, 특별히 제한된 리소스 설정을 위해 설계된 프로토콜을 제공합니다.

약 70 %에게 P.의 성숙 단계를 사용하여 혈소판 응집 매개 분석의 예 plasmagel 부양하여 농축 한 후 원충는 그림 2에 표시됩니다. 덩어리 세 개 이상의 감염된 적혈구의 집합입니다. 아 크리 딘 오렌지 또는 ethidium의 브로마이드 염색하는 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. ethidium의 브로마이드가 적색 493 nm에서 여기 최대 및 로다 민 염료와 유사한 620 nm에서 방출 최대 (가지고있는 동안 크리 딘 오렌지, 502 nm에서 여기 최대 525 nm의 (녹색)에서 방출, 최대 형광을 스펙트럼과 유사합니다 ). 그들은의 관광 명소로 세포 집합체로 형광 아래에 나타납니다 정상적인 빛 아래로 덩어리는 쉽게 현미경으로 발견되는 그림 2와 같이 (각각 크리 딘 오렌지 또는 ethidium의 브로마이드 염료로 염색 할 때 녹색 또는 빨간색 크리 딘 오렌지를 사용하여 30 분 시점 ). 수풀 클수록 세포 집계 유엔이 나타납니다데르 일반 빛과 녹색 또는 빨간색 아래의 반점 크게는 해당 염료 형광. 염료 대상 DNA 따라서 얼룩 핵, 혈소판 및 감염되지 않은 RBC는 핵 자신의 부족으로 인해 형광 현미경에서 검출되지 않기 때문에. 4.7의 작은 pRBC 덩어리의 임의의 형성 ± 1.6 pRBCs / 덩어리 30 분 후에 발생합니다. 덩어리의 크기는 상당히 많은 pRBC / 시각적으로 간주 할 수없는 덩어리를 포함하는 어떤 덩어리 120 분 동안 배양 한 후&gt; 15 pRBC / 덩어리의 평균 증가합니다. 감염된 세포의 수가 중복 분석의 계산, 수풀 / 1,000 감염된 세포에 선물로 응집 표현형의 빈도가 계산됩니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> 그림 1. 실험을 응집에 대한 흐름을 작동합니다. 혈소판 RICH와 가난한 플라즈마 (A)와 P. 원충에 감염된 적혈구 문화 (B) 응집 분석 (C)를 ​​준비하고 결합됩니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> 그림 2. P.에 의해 감염된 적혈구의 응집 falciparum의 실험실 격리합니다. 시간 0에서 HB3에 의해 형성된 수풀, 30, 120 혈소판이 풍부한 혈장 분 (A)와 혈소판 빈약 한 플라스마 (B)의 빈약 한 덩어리 형성합니다. 분석 제한 특히 혈소판 기능 또는 영향을 미치는 결과에 영향을 미칠 이들의 대부분은 이미 아르 멘과 로우 (15)에 의해 강조되고 한계가 있습니다. 여기에서 우리는 differe에에서 발생할 수있는 잠재적 인 문제 중 일부를 언급분석의 NT 단계 : <ol><li> 체외 문화에 균주를 적응하는 것은 때로는 더 긴 배양 기간이 덩어리를 형성 할 수 있도록 충분한 parasitaemia을 달성하기 위해 필요한 도전이 될 수 있습니다. P. 높은 항원의 변화 속도로 falciparum의, 문화 적응 기생충의 접착 표현형 문화의 연장 시간 후 원래의 감염 기생충 인구를 반영하지 않을 수 있습니다. </li><li> 혈액 그룹 항원에 의한 비특이적 인 응집을 방지하기 위해, 혈소판 기증자는 같은 분석에 사용 된 균주, 또는 보편적 인 기증자의 혈액 항원 그룹 O-사용과 혈액 그룹 항원 일치해야한다. 그러나 혈액형을 가진 사람들은 말라위 등 아프리카 사이트에서 드문 O-이고 따라서 일반적으로 사용되는 혈소판은 혈액형 O + 기증자로부터 얻은 혈액 그룹과 일치해야합니다. </li><li> 젖은 슬라이드 준비에 대단히 짧은 시간을 계산하면 C와 같은 이미지 캡처에 대한 복잡하고 도전ELL 학생은 지속적인 운동에 있습니다. 보통, pRBC은 커버 슬립의 가장자리에 축적되거나 쉽게 실제 덩어리와 혼동 할 수 있습니다 &quot;false&quot;로 덩어리를 형성 단결하는 경향이있다. 세포의 움직임을 줄이기 위해, 분석하기 전에 상온에서 15 분 동안 침전에 셀 수 있습니다. </li><li> 응집 분석은 시간에 민감하기 때문에 하나의 샘플이 최적의 정확성에 대해 한 번에 사람이별로 분석 할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 샘플 시점 샘플링 쉽게 동시에 하나 이상의 샘플을 처리하는 경우 샘플간에 일치하지 않는 샘플링 시점을 결과 겹칠 수 있습니다. 이러한 상황에서 정교한 양적 소프트웨어 덩어리의 크기를 계산할 수 또는 양자 택일 세포 특정 항체는 덩어리의 구성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석이 사용될 가능성이 곳에 이러한 기술은 크게 자원이 부족한 설정에서, 데이터의 중요성을 향상시킬 수 있지만, 이러한 기술과 장비를 쉽게 사용할 수 없습니다. </li></ol>

이 메소드는 혈소판 응집 매개 표현형을 조사<em&gt; 변형체 falciparum의</em균주&gt;에 감염된 적혈구 (pRBC). 이 혈소판이 풍부한 혈장과 pRBC의 현탁액을 분리하고 공동 배양에 의해 수행됩니다.

P. falciparum은 중증 말라리아 감염의 대부분을 유발한다. 뇌성 말라리아(CM)의 기저에 있는 병태생리학적 기전은 아직 완전히...

본 절차는 임상 또는 실험실의 Plasmodium falciparum 분리주를 사용하여 혈소판 매개 응집 분석을 수행하기 위한 표준화된 가이드라인을 제공합니다. 먼저, 감염된 환자로부터 혈액을 채취하고 원심분리를 통해 기생충에 감염된 적혈구를 수확한 다음, 무성 성숙 단계를 배양 및 정제합니다. 다음으로, 건강한 공여자의 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma)을 준비하고 표준화합니다.응집 분석을 위해 혈소판과 기생충에 감염된 적혈구를 모두 혼합합니다. 면역형광 현미경 결과는 혈소판에 의해 매개된 P. falciparum 응집체를 보여줄 수 있습니다. 이 기술은 특히 Plasmodium species의 응집 표현형을 측정하기 위해 설계되었습니다.자원이 부족한 환경에서의 임상 분리주. 현장 실험에서 응집 산(clumping acid)의 결과에 영향을 미치는 요인으로 절차상의 최소한의 변동이 보고된 바 있다. 따라서 말라리아 풍토병 지역의 현장 사이트 전반에 걸쳐 표준화를 이룰 수 있도록, 저자원 환경에 맞게 조정된 명확하고 따라 하기 쉬운 프로토콜이 필요했다. 소듐 시트레이트 바큐테이너에 말라리아 비감염 숙주로부터 약 5 mL의 전혈을 채취하거나, CM 또는 SM 말라리아 환자로부터 2.5 mL의 혈액을 채취한다.전혈을 실온에서 250 Gs로 10분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 뿌연 상층액을 깨끗한 15 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 혈소판은 온도 변화와 물리적 충격에 의해 쉽게 활성화될 수 있음을 유의하십시오.Hemocytometer를 사용하여 PRP 현탁액의 세포 수를 측정하고, PBS로 조정하여 원하는 농도로 맞춥니다. PRP 분획의 일부를 1500 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 대부분의 혈소판을 제거함으로써 혈소판 결핍 혈장(PPP) 펠릿을 얻습니다. PRP 및 PPP 분획은 4 °C에서 최대 8~10일 동안 보관하십시오. 응집 분석에는 가급적 신선한 혈소판을 사용하는 것이 이상적입니다.배양 플라스크에서 펠렛화된 말초 적혈구를 5~10 mL의 RPMI 1640으로 3회 세척합니다. 표준 말라리아 배양 배지와 감염되지 않은 신선한 적혈구를 PRBC에 보충하여 헤마토크릿 5%를 맞춥니다. 배양 플라스크를 92.5% 질소, 2.5% 산소, 5% 이산화탄소 혼합 가스로 충전합니다. 그 후 밀봉하여 환자 pbcs로부터 성숙한 기생충을 배양합니다.배양 플라스크를 37 °C 인큐베이터에서 5% carbon dioxide 농도로 24~36시간 동안 배양합니다. 평평한 표면에 놓인 프로스티드 글라스 슬라이드의 한쪽 끝에 혈액 약 10~15 µL를 떨어뜨립니다. 두 번째 슬라이드를 45도 각도로 유지한 상태에서, 혈액 방울에 두 번째 슬라이드의 가장자리를 접촉시켜 혈액이 슬라이드 가장자리를 따라 고르게 퍼지도록 합니다.첫 번째 슬라이드에 너무 많은 압력을 가하지 않으면서 빠르고 부드럽게 혈액을 고르게 도포합니다. 그런 다음 혈액의 얇은 막을 공기 중에서 건조시키고, 메탄올로 시료 부위를 10초 동안 탈수합니다. 이어서 다시 공기 중에서 건조시킨 후, 시료를 2% keem에 침지합니다.최소 10분 동안 유지하십시오. 물이 맑게 나올 때까지 충분히 헹군 후 공기 중에서 건조시킵니다. 광학 현미경의 100 x 오일 침강 렌즈로 샘플을 관찰하십시오.다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 성숙한 PFS parum, PRBC를 정제하고 동기화합니다. 배양물을 깨끗하고 멸균된 15 milliliter 튜브로 모두 옮깁니다. 상온에서 370 GS로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.이제 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음, 전체 부피의 절반은 jello fusing으로, 나머지 절반의 3분의 1은 단백질 제거 배지로, 나머지 절반의 3분의 2는 pbcs로 구성하여 세포를 재부유시킵니다.현탁액을 멸균된 15 milliliter 튜브로 옮기고, 상층과 하층 사이에 명확한 경계가 형성될 때까지 37 degrees Celsius 인큐베이터에서 15~20분 동안 배양합니다. 상층액을 조심스럽게 새 멸균 15 milliliter 튜브로 옮긴 후, 신선한 RPMI 10 milliliters를 첨가하고 370 to 430 GS에서 5분간 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.이제 앞서 설명한 대로 박막 혈액 도말법으로 기생충 및 발달 단계를 평가하고 광학 현미경으로 관찰하십시오. 혈장 겔 부상법을 통해 얻은 P RBC 현탁액을 새 1.5 milliliter 튜브에 담아 microliter당 1 × 10⁸ P RBCs가 되도록 조정합니다. P RBC를 5% hematocrit, 최종 농도 20 µg/mL의 acridine orange 또는 ethidium bromide, 그리고 전체 부피의 10% PRP에 현탁합니다.마찬가지로, PBC 응집에서 혈소판의 역할을 확인하기 위해 감염되지 않은 적혈구와 PRP, 그리고 PPP를 포함한 PRBC 등의 대조군을 준비합니다. 이제 현탁액을 2 mL 스크류 캡 바이알로 옮깁니다. 바이알을 실온에서 10~12 RRP로 롤링하여 부드럽게 교반하며, 응집 형성 여부를 확인하기 위해 총 120분 동안 15~20분 간격으로 샘플링합니다.샘플 10 µL를 슬라이드 글라스 위에 피펫으로 분주하고 커버 글라스로 덮어 형광 현미경으로 관찰합니다. 3개 이상의 감염된 적혈구가 모여 있는 경우를 응집체로 간주합니다. 본 실험에서는 plasma gel 부유법으로 농축한 후 p FALs 파라사이트의 성숙 단계 중 약 70%를 분석하였습니다. 응집체는 일반 광학 현미경으로도 쉽게 식별할 수 있으며, 세포 응집체의 형태로 나타납니다. 형광 현미경 하에서는 녹색 또는 적색 점으로 관찰됩니다.각각 acridine orange 및 ethidium bromide 염색 시, 120분간 배양 후 덩어리 크기가 평균 덩어리당 15개 이상의 pbc로 유의하게 증가하며, 일부 덩어리는 시각적으로 계수할 수 없을 만큼 수많은 pbc를 포함하고 있습니다. 응집 표현형의 빈도는 중복 실험에서 계수된 감염 세포 1000개당 덩어리 내에 존재하는 감염 세포의 수로 계산합니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 Plasmodium falciparum의 혈소판 매개 응집 분석법을 수행하는 방법에 대해 명확히 이해하게 되었을 것입니다. 급격한 움직임이나 온도 변화로 인해 혈소판이 활성화되지 않도록 주의하십시오. 이 분석법은 중증 말라리아의 혈소판 매개 응집 분석을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

유전자가 말라리아에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 이내 Plasmodium 감염을 예방의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 plasmodium 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. gametocyte 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액을 준비하고 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기와 감염 표현형 결정에서 Plasmodium falciparum 감염에 대한 프로토콜

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

이 동영상은 단핵구에 의해 표지되고 옵소니화된 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구를 포함하는 유세포 분석 기반 식세포작용 분석을 보여줍니다. 유세포 분석은 단핵구에서 형광을 식별하여 식세포작용을 통해 옵소니화된 적혈구의 성공적인 식별을 확인합니다.

기생충에 감염된 적혈구의 항체 매개 식세포작용(Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes)을 정량화하기 위한 분석

hemozoin의 상자성의 특성은 월말 단계를 분리하는 데...

의 분리<em&gt; Plasmodium falciparum</em자기 수단으로&gt; 늦은 단계에 감염된 적혈구

항체의 기능을 측정하는 것은 변형체 falciparum의 말라리아에 대한 내성을 이해하는 열쇠입니다. 이 방법은 가능한 merozoites의 정화 및 유동 세포 계측법에 의해 옵 소닌 의존 식균 작용의 측정에 대해 설명합니다.

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

셀 기반 시스템에서 말라리아 단백질의 발현은 도전 남아있다. 우리는 HeLa 세포에서 말라리아 재조합 rhoptry 단백질을 표현하는 두 단계 및 (체외 번역) 한 단계 IVT 세포 무료 발현 시스템을 보여줍니다. 우리 rhoptry 단백질을 정제하는 니켈 계 수지 친화 정제 시스템을 사용한다.

의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템<em&gt; 변형체</em&gt; Rhoptry 단백질

인간 microRNA는 숙주 적혈구에서 Plasmodium falciparum 기생충으로 전위합니다. 여기에서는 합성 microRNA를 숙주 적혈구로 transfection하고 P. falciparum에서 모든 RNA를 분리하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다.  또한 이 논문에서는 기생충 전사체의 리보솜 점유 및 번역 가능성을 결정하기 위해 P. falciparum에서 폴리솜 분리 방법을 자세히 설명합니다.

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

여기, 선물이 탐지 및 정량화의 변형 체 falciparum 감염 수성 적혈구 감쇠 총 반사 적외선 분석기 및 다변량 데이터 분석을 사용 하는 프로토콜.

검색 및 변형 체 falciparum 에 수성 적혈구 총 반사 적외선 분광학 감쇠 및 복수 데이터 분석의 정량화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Plasmodium falciparum 감염에 자연적으로 드러나는 개인의 혈장 또는 혈장에 존재하는 항체의 용량을 측정하는 방법에 대한 지침을 제공하여 기생충에 감염된 적혈구 (IEs)의 phagocytosis를 opsonize 및 유도하는 것입니다.

유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정

여기서 우리는 감염의 혈액 단계에서 Plasmodium 에 대한 세포 면역의 메커니즘을 밝히는 데 도움이되는 새로운 방법을 설명합니다. 이것은 세포 독성 림프구에 의한 감염된 적혈구 사멸을 측정하는 시험관 내 분석입니다.

체외 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸 분석

화학 유전학은 표적 유전자좌에서 다른 곁사슬을 포함하는 아미노산으로 게이트키퍼 잔기를 치환하는 것을 포함합니다. 여기에서 우리는 cdpk1 의 hypomorphic 대립 유전자를 포함하는 돌연변이 기생충을 생성하고 돌연변이 배경에서 기생충이 채택한 보상 경로를 확인했습니다.

식물 유사 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 돌연변이 말라리아 기생충의 보상 경로 개발 이해

학습하세요 Plasmodium falciparum 감염 적혈구의 혈소판 매개 응집 분석법을 임상 격리주에서 사용하는 방법입니다. 이 표준화된 프로토콜은 말라리아 병리 연구와 저자원 환경 적용에 유용합니다.

의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜

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