의 혈소판 응집 중재를위한 간단한 프로토콜 변형체 falciparum의 - 감염된 적혈구

본 절차는 임상 또는 실험실에서 분리한 Plasmodium falciparum 분리주의 혈소판 매개 응집 분석을 수행하기 위한 표준 지침을 제공합니다. 먼저, 감염된 환자로부터 혈액을 채취하고 원심분리를 통해 기생충에 감염된 적혈구를 수확한 다음, 무성 성숙 단계를 배양하고 정제합니다. 이어서, 원심분리를 통해 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma)을 준비하고 표준화하기 위해 건강한 공여자로부터 혈액을 채취합니다.

응집 분석을 위해 혈소판과 기생충 감염 적혈구를 모두 혼합합니다. 면역 형광 현미경 분석 결과는 혈소판에 의해 매개된 P. falciparum 응집체를 보여줄 수 있습니다. 이 기술은 특히 Plasmodium sp.의 응집 표현형을 측정하기 위해 설계되었습니다.

자원이 부족한 환경의 임상 분리주입니다. 절차상의 미세한 차이가 현장에서의 응집산(clumping acid) 결과에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다. 따라서 말라리아 풍토 지역 현장 간의 표준화를 위해 저자원 환경에 적합하고 명확하며 따라 하기 쉬운 프로토콜이 필요했습니다. 소듐 시트레이트(sodium citrate) 바큐테이너(vacutainer)에 말라리아 미감염 숙주로부터 약 5 mL의 전혈을 채취하거나, 중증 말라리아(CM) 또는 단순 말라리아(SM) 환자로부터 2.5 mL의 혈액을 채취합니다.

전혈을 상온에서 250 Gs로 10분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 혼탁한 상층액을 깨끗한 15 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 혈소판은 온도 변화와 물리적 충격에 의해 쉽게 활성화된다는 점에 유의하십시오.

Annoy bower의 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 PRP 현탁액의 수를 세고, PBS로 원하는 농도로 조절합니다. 이후 PRP 분획의 일부를 1500 GS에서 10분 동안 원심분리하여 대부분의 혈소판을 제거함으로써 혈소판 감소 혈장(PPP) 펠렛을 얻습니다. PRP와 PPP 분획은 4 °C에서 최대 8~10일 동안 보관하십시오. 응집 분석(clumping assay)에는 가급적 신선한 혈소판을 사용하는 것이 이상적입니다.

배양 플라스크에서 펠렛화된 말초 적혈구를 5~10 mL의 RPMI 1640으로 3회 세척합니다. 표준 말라리아 배양 배지와 신선한 비감염 적혈구를 보충하여 PRBC의 헤마토크릿 수치를 5%로 맞춥니다. 배양 플라스크 내부를 92.5% 질소, 2.5% 산소, 5% 이산화탄소 혼합 가스로 충전합니다. 그런 다음 밀봉하여 환자 pbcs의 성숙 기생충을 배양합니다.

배양 플라스크를 37°C, 5% 이산화탄소 배양기에서 24~36시간 동안 배양합니다. 평평한 표면에 놓인 프로스트 글라스 슬라이드 한쪽 끝에 혈액 약 10~15 µL를 떨어뜨립니다. 두 번째 슬라이드를 45도 각도로 유지한 채, 혈액 방울에 슬라이드 가장자리를 접촉시켜 혈액이 두 번째 슬라이드 가장자리를 따라 고르게 펴지도록 합니다.

첫 번째 슬라이드에 너무 많은 압력을 가하지 않으면서 빠르고 부드럽게 혈액을 고르게 펴 바릅니다. 그런 다음 혈액의 얇은 막을 공기 중에서 건조시키고, 검체 부위를 메탄올로 10초 동안 탈수시킵니다. 다시 공기 중에서 건조시킨 후, 검체를 2% keem에 침지합니다.

최소 10분 동안 유지합니다. 물이 맑아질 때까지 충분히 헹군 후 공기 중에서 건조합니다. 광학 현미경의 100 x 오일 침강 렌즈로 시료를 관찰합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 성숙한 PFS parum, PRBC를 정제하고 동기화합니다. 배양물을 깨끗하고 멸균된 15 milliliter 튜브로 모두 옮깁니다. 상온에서 370 GS로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.

이제 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 그런 다음, 전체 부피의 절반은 jello fusing으로, 나머지 절반의 1/3은 단백질 제거 배지(protein free medium)로, 나머지 절반의 2/3는 pbcs로 구성하여 세포를 재부유시킵니다.

현탁액을 멸균된 15 milliliter 튜브로 옮기고, 상층과 하층 사이에 명확한 경계가 형성될 때까지 37 degrees Celsius 인큐베이터에서 15~20분 동안 배양합니다. 상층액을 새로운 멸균 15 milliliter 튜브로 조심스럽게 옮긴 후, 신선한 RPMI 10 milliliters를 첨가하고 370~430 GS에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

이제 앞서 설명한 대로 박막 혈액 도말법을 통해 기생충 및 발달 단계를 평가하고 광학 현미경으로 관찰하십시오. 혈장 젤 부상법(plasma gel flotation) 이후 얻은 P RBC 현탁액을 새로운 1.5 milliliter 튜브에 담아 1 × 10⁸ P RBCs/µL 농도로 조정합니다. P RBC를 5% hematocrit로 현탁하고, 최종 농도가 20 µg/mL가 되도록 acridine orange 또는 ethidium bromide를 첨가하며, 전체 부피의 10%에 해당하는 PRP를 추가합니다.

마찬가지로, PBC 응집에서 혈소판의 역할을 확인하기 위해 감염되지 않은 적혈구, PRP, 그리고 PPP가 포함된 PRBC와 같은 대조군을 준비합니다. 이제 현탁액을 2mL 스크류 캡 바이알로 옮깁니다. 바이알을 실온에서 10~12 RRP로 회전시켜 부드럽게 교반하며, 총 120분 동안 15~20분 간격으로 샘플링하여 응집 형성 여부를 확인합니다.

슬라이드 글라스에 시료 10 µL를 분주하고 커버 글라스를 덮어 형광 현미경으로 관찰합니다. 감염된 적혈구가 3개 이상 모여 있는 경우를 응집체로 간주합니다. 본 실험에서는 혈장 겔 부상법으로 농축한 후 p FALs 파라사이트의 성숙 단계 중 약 70%를 분석하였습니다. 응집체는 일반 광학 현미경으로도 쉽게 식별할 수 있습니다. 이들은 세포 응집체로 나타나며, 형광 현미경 하에서는 녹색 또는 적색 점으로 보입니다.

각각 acridine orange 또는 ethidium bromide 염색 시, 120분 배양 후 응집체 크기가 응집체당 평균 15 pbc 이상으로 유의미하게 증가하며, 일부 응집체에는 시각적으로 계수가 불가능할 정도로 수많은 pbc가 포함되어 있습니다. 응집 표현형의 빈도는 이중 측정 분석(duplicate assays)에서 계수된 감염 세포 1,000개당 응집체 내에 존재하는 감염 세포의 수로 계산합니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 Plasmodium falciparum의 혈소판 매개 응집 분석법을 수행하는 방법에 대해 명확히 이해하게 될 것입니다. 급격한 움직임이나 온도 변화로 인해 혈소판이 활성화되지 않도록 주의하십시오. 이 분석법은 중증 말라리아의 혈소판 매개 응집 분석 측정에도 적용될 수 있습니다.