Name: 발광 생물 세균 이미징 생체 내 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: 배우세요 생체 내 발광 생물 세균 이미징 기술을 사용하여 종양 이종이식에서 세균 성장을 실시간으로 추적하는 방법을 알아보세요. 이 비침습적 기법은 암 치료를 위한 세균 벡터 연구에 활용됩니다.

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저자는 유럽위원회 (European Commission) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (PIOF-GA-2009-255466)와 아일랜드 보건 연구위원회 (HRA_POR/2010/138)에서이 원고에 관련된 지원을 인정하고 싶습니다. 럭스 태그 E. 대장균 박사 코르 막 Gahan, 대학 대학 코르크에서 일종의 선물이었다.

1. 종양 유도 <ol><li> 일상적인 종양 유도를 들어, 혈청이없는 배지 200 μl에 떠있는 셀의 최소 tumorigenic 선량은 무료로 감염의 측면 6~8주 세 여성 Balb / C 또는 athymic MF1-nu/nu 마우스로 (SC) 피하 주입 된 N 21 게이지 주사기 바늘을 사용하여 = 6 (할렌, 옥스퍼드 셔, 영국) (1 X 10 6 4T1 세포). 혈구와 Trypan 파랑 염료 제외 (Gibco)를 사용 시각적 개수에 의해 결정으로 접종에 사용되는 세포의 생존 능력은보다 큰 95%했다. </li><li> 종양 설립 후, 종양은 성장하고 발전 할 수 있었고, 2 회 모니터링했다. 종양 볼륨이 종양의 가장 긴 직경이며, B는 직경을에 가장 긴 직경 수직 공식 V = (AB 2) Π / 6에 따라 계산되었습니다. </li></ol> 2. 세균 준비 <ol><li> 이 protoco에 사용 된 세균의 변형난 E.했다 대장균 K-12 MG1655, 비 단백질 독소 표현 세균에 의해 감지 할 수 있도록 그 luxABCDE 인코딩 플라스미드을 품고, 스트레인을 BLI. E. 통합 luxABCDE를 포함하는 대장균 MG1655은 37 aerobically 성장했습니다 ° LB 매체에서 C (시그마 - 알드리치, 아일랜드) 300 μg / ML 에리스로 마이신 (엠)와 보충. MG1655의 발광 생물 파생는 플라스미드 p16S 룩스 제정 P 도움말 luxABCDE 오페론 1 포함 된을 사용하여 만들어졌습니다. </li><li> 마우스로 관리를위한 준비, 문화는 중간 로그 단계 (600 nm의에서 광학 밀도)에 200 rpm으로 흔드는에서 37 ° C에서 LB 매체에 incubated되었습니다. 박테리아는 (6,000 × g로 5 분)을 원심 분리하여 수확 PBS (시그마)로 세척하고, PBS 1 희석 된 × 10 7 식민지 형성 단위 (CFU) / IV 관리를위한 ML, 또는 gavage 1 × 10 10. </li></ol> 3. 세균 Administra기 <ol><li> 종양 볼륨에서 약 100mm 3에 도달하면 마우스가 무작위로 실험 그룹으로 나누어되었다. 정맥 주사 관리를 들어, 절제된 마우스 각 28G 주사기 바늘을 사용하여 측면 꼬리 정맥에 직접 주입, 100 μl에 10 6 세포를 받았다. 각 inoculum의 가능한 개수는 회고 도금에 의해 결정되었다. </li><li> GIT의 식민지 연구를 들어, 10 9 박테리아 세포는 구두 세 번 일에 gavage에 마우스 당 100 μl으로 시행되었다. 기존의 공생 박테리아 수준은 이전의 구두 gavage 1 개시 7 일 동안 마우스 식수 5 MG / ML 스트렙토 마이신의 추가에 의해 공급 이전에 감소했다. </li></ol> 4. BioLuminescence 영상 <ol><li> 생체 BLI 영상의 2D는 IVIS100 (캘리퍼)를 사용하여 수행되었습니다. 정의 시간 포인트 후 세균 관리에서, 쥐 캘리퍼스의 XGI-8 가스 마취를 사용하여 anesthetized했다3 % Isofluorane, 그리고 전체 - 신체 이미지 분석 시스템은 고감도에서 2-5 분 동안 IVIS 100 시스템에 수행되었다. </li><li> 3D 영상의 경우, anesthetized 마우스는 등쪽의 이미징을위한 광학 이미징 시스템 (IVIS 스펙트럼, 캘리퍼스)의 내부에 마우스 이미징 셔틀에 배치되었습니다. 3D 광학 재건을위한 세균 루시 페라 신호의 이미지를 취득하려면 500-580 nm의에 이르기까지 방출 필터 파장은 소음 비율에 신호를 극대화 할 수 필터 당 3-4 분 빈 16 수집 시간으로 사용되었습니다. 이 이미지 수집 과정의 일환으로, 구조화 된 빛이 이미지는 높이 맵을 정의하기 위해 얻은 것입니다. 이지도는 입력 확산 광 단층 촬영 영상 (DLIT) 음수가 아닌 최소 제곱 최적화 2를 사용 3D 광학 이미지를 형성하는 데 사용 된 reconstructions 알고리즘했다. </li><li> 이미지 분석 : 관심 지역을 파악하고 생활 이미지 소프트웨어 (캘리퍼)를 사용하여 정량 하였다. </li></ol> 5. 대표하는결과 본 연구에서는 비 병원성 세균 공생 E.coli K-12 MG1655 luxABCDE 오페론을 표현하는 IV는 SC 4T1의 이종 이식 종양을 간직한 생쥐에 투여했다. 세균 룩스 신호는 마우스의 종양에 구체적으로 발견 된 후 IV-행정 (그림 2). 샘플 마우스에서 박테리아의 문화 복구 가능한 박테리아 숫자와 감지 빛의 양 (그림 3) 사이의 선형 관계의 존재를 확인합니다. GIT에 구두 - 관리 공생 박테리아의 생체 이미징에서 또한 3D BLI를 사용하여 달성된다. <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1highres.jpg"/> 1 그림. 프로토콜 타임 라인. 피하 종양은 마우스에서 유도하고, 박테리아는 종양 개발 (100mm 3)에 따라 관리됩니다. 라이브 쥐 BLI 인스턴트 메신저 아르여러 시간 지점 게시물 세균 관리 (화살표가 일반적인 시간을 표시)에 세. <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. E.의 관리 종양 베어링 마우스에 대장균 MG1655 luxABCDE. 피하 4T1 종양은 MF1 뉴 / 뉴 마우스와 E.에서 유도 된 대장균 MG1655 luxABCDE는 종양 개발에 실시. 각 동물은 측면 꼬리 정맥에 직접 주사 10 6 세포를 받았습니다. 마우스는 샘플 희생 마우스 종양에서 가능한 박테리아의 후속 복구 (CFU)로 연구 기간 동안 4 개의 시간대 포인트 (검은 점 Z-축 및 이미지) (막대 그래프)에서 이미징되었다. 세균 번호와 특히 종양에 시간 (대표 마우스 시점에 따라 그림)을 통해 관찰 된 플라스미드 유전자 발현에 향상시킬 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4318/4318fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. Intratumoral 세균 번호와 Bioluminescence 관계. 가능한 박테리아는 종양의는 다양한 시간 포인트 이후 IV 관리에서 BLI에 다음 종양에서 예 생체 박테리아 문화가 열거되었다. 생체 bioluminesce 단위를 기준으로 세균의 숫자 값 (CFU)를 로그하는 것은 그래프로 나타납니다. 세균 수와 세균 bioluminescence 신호 사이의 강력한 상관 관계가 관찰 R 2 = 0.9717 1. <img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 손쥐 위장관의 3D IVIS 이미지 E.하여 식민지 대장균 MG1655은. 마우스의 GIT는 E.의 10 9 CFU의 구두 행정부에 의해 개척했고 세 번 일 대장균. 식민지 마우스의 3D 단층 촬영에서 샘플 격리 된 이미지가 표시됩니다.3D 이미지는 해부학 등록을 제공하는 해골의 디지털 마우스 아틀라스를 보여줍니다. E.는 대장균 MG1655 bioluminescence는 낮은에서 녹색으로 표시하고, 높은 수준의 보라색입니다.

<ol><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

유전자 치료의 맥락에서 환자에게 치료 유전자 전달을위한 생화학 제제의 사용은 큰 약속 3-5 나타났습니다. 바이러스처럼, 박테리아의 본래 생물학적 특성은 특히 암의 맥락에서, 셀이나 조직에 효율적으로 DNA 전달을 허용합니다. 그것은 박테리아가의 자연스럽게 할 수있는 것으로 표시되었습니다 체계적으로 중 외부 로컬 복제 높은 수준의 (비 침습적 종) 또는 종양 세포 (병원균)에 발생하는 종양으로 관리 들어가고. 암 특정 박테리아 복제는 초기 혐기성 및 facultatively 혐기성 균의 성장을 촉진 종양 내에서 hypoxic / 괴사 영역의 혐기성 자연과, 고체 종양의 hypoxic 성격 (낮은 O 2 층)로 표시되었습니다. 최근에는 불규칙, 새는 혈액 공급 및 종양의 현지 면역 억제 등의 요인이 역할을 제안했습니다. 대부분의 잠복기 연구 xenogr를 활용 한고물 종양 모델은 박테리아 벡터 종양의 식민지를 조사합니다. 자발적으로 발생하는 종양의 손쥐 모델은 밀접하게 vasculature...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 4T1 세포 라인 </td><td> ATCC </td><td> CRL-2539 </td><td> 자발적으로 발생하는 BALB / C 유방 종양에서 파생 Syngeneic 유방암 모델 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D6429 </td><td> Dulbecco의 수정 된 이글의 매체 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D8537 </td><td> 인산염은 식염 버퍼 </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td> 2D 이미지에 대한 IVIS 100, 3D에 대한 IVIS 스펙트럼. </td></tr><tr><td> Luria 국물 밀러 (LB) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> L2542 </td><td> E.의 성장 매체 대장균 </td></TR&gt; <tr><td> 에리스로 마이신 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E5389 </td><td> 항생 물질 </td></tr><tr><td> 스트렙토 마이신 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S9137 </td><td> 항생 물질 </td></tr><tr><td> MF1nu/nu 마우스 </td><td> 할렌 (UK) </td><td> 069 (뉴) / 070 (뉴 / +) </td><td> Hsd : Athymic 누드 - Foxn1nu </td></tr><tr><td> Balb / C 마우스 </td><td> 할렌 (UK) </td><td> 066 </td><td> Haplotype : H-2 D </td></tr><tr><td> Gavage 바늘 </td><td> 수의사 기술 솔루션 (UK) </td><td> DE009 </td><td> 22G X 38mm 바로 gavage 바늘 </td></tr><tr><td> IV 주입 주사기 </td><td> BD BioSciences </td><td> 309309-1 ML </td><td> 28 G X ½ 인치 마이크로 미세 IV 바늘과 인슐린 주사기. </td></tr><tr><td> 종양 접종에 대한 주사기 </td><td> 브라운 </td><td> 9161376V </td><td> Omnifix 26 G X &amp;frac12; 인치 바늘 </td></tr></tbody></table>

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

이 동영상은 암 유전자 및 세포 치료 박테리아의 사용에 중점을두고, 라이브 쥐 세균 매매의 연구 전신 bioluminesce 이미징 (BLI)의 사용에 대해 설명합니다. 박테리아가 조직 관리에 따라 종양 내에 우선적으로 성장하는 자연 능력을 보유하고 암 치료를위한 벡터의 매력적인 클래스를 제시한다. 박테리아는 박테리아와 동시에 종양 사이트의 럭스 유전자 카세트 허가 BLI 검색을 표현하는 설계. 시간이 지남에 따라 종양 내에 위치와 박테리아의 수준은 쉽게 검토 할 수 있습니다, 2, 3 차원 시각화. 방법은 박테리아 종과 종양 이종 이식 유형의 다양한 적용됩니다. 이 문서는 피하 종양 베어링 마우스에서 발광 생물 박테리아의 분석을위한 프로토콜을 설명합니다. BLI하여 위장관 (GIT)의 공생 박테리아의 시각화도 설명되어 있습니다. 이 강력하고 저렴한, 실시간 이미징 전략 represenTS 암 특정 유전자 치료의 연구, 그리고 전염성 질병의 맥락에서 생체 내 박테리아의 연구를위한 이상적인 방법입니다. 이 동영상은 럭스 태그 E.을 공부에 대한 절차를 설명 IVIS 시스템 공간과 측두엽 판독 달성 활용 BLI을 보여주는 라이브 쥐 대장균.

이 문서의 관리에 대해 설명합니다<em&gt; 룩스 태그</em&gt; 마우스에 세균 및 이후<em&gt; 생체 내</emIVIS의 bioluminescence 이미징을 사용하여&gt; 분석.

이 비디오에서는 ...의 사용에 중점을 두어, 살아있는 마우스 내 세균 이동 연구를 위한 전신 생체 발광 이미징(BLI)의 활용 방법을 설명합니다.

본 영상에서는 생쥐 모델 내 박테리아 이동 연구를 위한 전신 생물발광 이미징 기술의 활용법을 설명하며, 특히 종양 이종이식편 내 박테리아 증식 검출에 중점을 둡니다. 박테리아는 정맥 투여 후 종양 세포 외부 또는 내부에서 선택적으로 증식하는 천연 능력을 갖추고 있어 암 치료를 위한 매력적인 벡터군으로 꼽힙니다. lux 유전자 카세트를 발현하도록 조작된 박테리아 균주는 박테리아와 종양을 동시에 검출할 수 있게 합니다. 생체 내 박테리아 균주에 대한 비침습적 종단 모니터링의 가치는 잘 알려져 있으며, 이는 동물 사용량을 줄이고 종점 분석보다 통계적으로 더 유의미한 데이터를 생성합니다.이 절차는 마우스의 피하 종양 유도를 포함합니다. 종양이 성장하도록 두고 일정 기간 모니터링합니다. 본 실험에서 설명하는 절차에 따라 정해진 시점에 박테리아를 투여하고 마우스의 생체 발광 이미징을 수행합니다.면역 능력이 있거나 흉선 배경을 가진 마우스에 피하 종양을 유도합니다. 제노그라프트(xenograft)의 선택에 따라, e coli와 같이 원하는 종의 Lux 유형 박테리아를 하룻밤 동안 배양합니다. 박테리아 세포를 세척한 후, 정맥 투여를 위해 원하는 농도로 재현탁합니다.10⁶개의 세균 세포가 포함된 100 µL의 주입 부피가 통상적으로 사용됩니다. 통상적으로 100 mm³ 부피의 피하 종양을 가진 마우스를 준비하여 치료를 진행합니다.29 gauge 주사 바늘을 사용하여 박테리아 현탁액을 외측 미정맥에 주입합니다. 시간이 지남에 따라 박테리아는 종양 덩어리 내에서 우선적으로 증식합니다. 종양 내 박테리아는 수주 동안 계속 증식하며, 3일에서 6일 사이에 IVUS 영상을 통해 검출할 수 있습니다.투여 후, 생물발광 이미징을 위해 마취된 살아있는 마우스들을 IVIS의 37°C 챔버 안에 배치합니다. 필요한 경우, 여러 마리의 마우스를 동시에 이미징할 수 있습니다. 적절한 소프트웨어 설정 하에 냉각 CCD 카메라를 사용하여 사진 및 발광 이미지를 수집합니다.사용하는 영상 장치에 따라 2차원 또는 3차원 분석을 수행할 수 있습니다. 종양 내 박테리아 수와 생성된 빛의 강도 사이에 강력하고 선형적인 관계가 형성되어, 생체 내 박테리아 수를 신뢰성 있게 추정할 수 있습니다. LX를 발현하는 박테리아는 체내 깊은 곳에서도 검출될 수 있습니다.Lux를 발현하는 장내 정착 공생 세균을 수주 동안 시각화하였습니다. 세척 후 투여를 통해 연구 동물 내 lux 발현 세균 분석을 위한 생체 발광 이미징의 유용성을 추가적으로 입증하였습니다.

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

여기 우리는 그들의 성장과 전이 동안 전이성 유방암 세포에 표현 반딧불과 renilla 루시 페라 제 효소 모두의 발광 생물 반응을 구축 시각화 및 정량화 할 수있는 방법을...

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

출처: Valentine, M. E. 외, Pseudomonas aeruginosa 에서 인프레임 유전자 결실 돌연변이 생성과 감염 단순 마우스 모델에서의 병원성 감감 검사. J. Vis. Exp. (2020)이 영상은 생체 쥐 모델에서 박테리아 감염을 모니터링하기 위해 생물발광 기반 영상 기법을 시연합니다. 순차적 생물발광 및 X선 영상은 숙주 전역에 퍼진 감염을 실시간으로 시각화하고 해부학적 위치를 파악할 수 있게 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 박테리아 감염의 실시간 영상

출처: 왕, Y. 외. 생체 내 생물발광 영상을 이용한 다약물 내성 아시네토박터 바우만니 화상 감염에 대한 항균 청색광 치료 연구. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 생물발광 오페론을 가진 아시네토박터 바우만니 에 접종된 쥐에서 화상 상처 감염을 영상화하는 절차를 시연합니다. 루시퍼레이스 촉매 기질 산화가 박테리아 부하에 비례하는 빛을 생성하여, 생물발광 영상 시스템을 이용해 감염 진행을 실시간으로 모니터링할 수 있음을 보여줍니다.

쥐의 아시네토박터 바우만니 감염 화상 상처의 생물발광 영상

황색 포도상 구균의 발광 생물 공학적 변형을 이용하여, 정형 외과 임플란트 감염 마우스 모델에서 광과 μCT 화상을 결합하여, 비 침습적으로 및 종 방향에서의 세균 감염의 역학뿐만 아니라 대응하는 염증 반응 및 해부학 적 변화를 모니터 할 수있는 기능을 구비 뼈.

결합<em&gt; 생체</em&gt; 광학 및 μCT 이미징 마우스의 정형 외과 임플란트 감염에 감염, 염증 및 뼈 해부학을 모니터링

다제내성(MDR) 박테리아 균주에 의한 감염은 공중 보건에 대한 심각한 위협으로 부상하여 대체 치료제의 개발을 필요로 하고 있습니다. 생물발광 영상을 사용하여 마우스 화상에서 MDR Acinetobacter baumannii 감염에 대한 항균 블루라이트(aBL) 요법의 효과를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

다제 내성 항 감염 블루 라이트 치료의 생체 조사에서 아시네 토 박터 바우 마니는 생물 발광 영상을 사용하여 감염을 굽기

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

발광 박테리아 메커니즘, 쿼럼 센 싱 등의 다양 한 통해 빛 생산을 통제 한다. 이 새로운 메서드는 생물 발광의 현장에서 조사와 발광 셀 밀도 상관 관계를 수 있습니다. 인공 발광 대장균 시스템 럭 스 operons, 럭 스 단백질, 그리고 그들의 상호 작용의 특성을 수 있습니다.

제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

이 프로토콜은 이중 생물 발광 이미징에 의해 종양 진행 및 혈관신생을 실시간으로 모니터링하는 종양 베어링 마우스 모델의 확립을 설명합니다.

종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징

여기에 제공된 프로토콜은 데이터 수집, 분석 및 해석에 중점을 두고 트리파노소마 크루지 감염의 생물 발광 모델에서 약물 효능 연구를 수행하기 위한 자세한 단계를 설명합니다. 기술적 문제를 최소화하기 위한 문제 해결 및 품질 관리 절차도 제공됩니다.

약물 효능 연구를 위한 샤가스병 마우스 모델의 In Vivo Bioluminescence 이미징 Demystifying In Vivo Bioluminescence Coaching

배우세요 생체 내 발광 생물 세균 이미징 기술을 사용하여 종양 이종이식에서 세균 성장을 실시간으로 추적하는 방법을 알아보세요. 이 비침습적 기법은 암 치료를 위한 세균 벡터 연구에 활용됩니다.

발광 생물 세균 이미징

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