Name: 에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용 C. elegans 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 배우세요 C. elegans 태아에서 산소 결핍으로 유도된 세포 주기 정지를 실시간 현미경으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 미세 배양 챔버와 질소 가스 흐름을 사용하여 아녹시아 환경에서 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

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우리는 입력 및 빠 디야 연구소 회원의 의견을 우리의 감사를 전달하고 싶습니다. 이 작품에서 선충류의 긴장은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)의 지원을 받고 있습니다 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었다. 우리는 공 촛점 현미경과 기술 지원을 위해 박사 론 턴벌을 인정하고 감사합니다. 이 작품은 PAP에 대한 국립 과학 재단 (NSF-IOS, 직업)에서 교부금에 의해 지원되었습니다

1. 샘플 준비 <ol><li> 해당 유전자 변형 C.를 생성하거나 획득 elegans는 유전자 변형 방법을 사용하여 관심이나 Caenorhabditis 유전학 증권 센터 (CGC) 또는 동료의 변형. 세포 분열에 대한 마커로 염색체와 중심체를 시각적으로 5,이 경우에서 우리는 (파이-1 :: GFP :: H2B 파이-1 :: tbg-1 :: GFP) 부담 TH32를 사용하고 있습니다. </li><li> 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 동기화 된 인구를 생성 : 1) 차아 염소산염 솔루션의 gravid 성인 분해 및 시드 판에 gravid 성인을 선택하고 1-2 시간에 배아를 덮어두고 나머지 배아에게 6 2)를 사용하거나, 3) L4를 선택 새로운 시드 판에 혼합 인구 이동의 애벌레. </li><li> 20 nematodes를 성장 ° C L1의 유충 또는 24 시간 후 L4의 털을 갈다에서 부화에서 72 시간을 약 96 시간를 취할 것입니다 gravid 젊은 성인에. 자궁에서 태아 (2-20 셀) imag에 대한 최적의 크고 blastomeres와 핵을 포함ING 하위 세포와 하위 핵 변화, 각각. 이 방법론은 초기 배아의 풍부한 숫자를 포함 젊은 성인의 인구를 생성 할 수있는 방법을 제공합니다. </li></ol> 2. 슬라이드 준비 및 산소 결핍 상공 회의소는 설정 <ol><li> 충분한 크기의 뚜껑으로 덮여 큰 페트리 접시 또는 빈 내부에 습기가 종이 타월을 배치하여 준비된 슬라이드를 개최 할 수있는 습윤 챔버를 확인합니다. </li><li> 전자 레인지 나 물 목욕을 통해 유리의 혼합물을 가열하여 deionized H 2 O에서 용융 2퍼센트 아가로 오스를 준비합니다. </li><li> 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 따뜻한 아가로 오스 1-3 방울을 넣으십시오. 바로 아가로 오스 드롭 (들)의 상단에 수직 반전 두 번째 슬라이드를 배치, 결과 패드가 얇고 기포 무료로 될 것이라고 약간 있도록 키를 누릅니다. </li><li> 시원하고 천천히 슬라이드 중 하나에 아가로 오스 패드를 그대로두고 두 현미경 슬라이드를 갈라 놓을로 시간을 허용합니다. 이 아가로 오스 패드 interfe하지 할 수있을만큼 얇고을 보장하는 것이 중요합니다나중에 현미경 초점을 맞출 수있는 능력을 다시. 샘플을 시각화하는 능력은 현미경 사이에 다를 수 있습니다 사용 목적의 특정 광학 거리,에 따라 달라집니다. </li><li> 작은 광장으로 아가로 오스 패드를 형성하기 위해 깨끗한 면도날을 사용합니다. 사용할 준비가 될 때까지 준비한 습기 챔버에 저장합니다. </li><li> 주의 깊게 같은 깨끗한 면도날 사용하여 아가로 오스 패드의 가장자리를 타고 원형 25mm 마이크로 coverglass로 슬라이드에서 전송, 패드 아래에 기포의 축적을 피하고. 사용하도록 선택 둥근 coverglass은 microincubator에 적절하게 맞출 수 있습니다. </li><li> 마취 용으로 사용 아가로 오스 패드로 마취 (0.5 % tricaine, M9 버퍼에 0.05 % tetramisole)의 방울을 추가합니다. 마취의 드롭에 5-10 웜 및 장소를 선택합니다. 운동을 중단 할 수 웜에 대해 1-3 분 소요됩니다. </li><li> , 성인 자궁 내에서 태아를 관찰하는 대신 해부하는 배아의에 대한 근거는 배아 desicca의 가능성을 최소화하는 것입니다기 및 배아에서 질소 가스의 흐름에 따라 이동. </li><li> 즉시 가스 챔버를 통해 흘러되기 때문에 탈수에서 웜을 방지하기 위해 웜의 상단에 할로 카본 오일 한 방울을 추가합니다. 할로 카본 오일은 점성 때문에 하나는 웜에 오일 앤 드롭를 수집하는 선택 웜의 pipet 팁 또는 팁을 사용할 수 있습니다. </li><li> 웜을 포함하는 원형 coverglass가 준비되면, 라이덴의 두 절반은 microincubator이 분리되어 재관류를 폐쇄하고, coverglass는 조심스럽게 아래쪽 링에 수직으로 배치합니다. 챔버의 양면 그런 다음 긴밀하게 함께 종료되었습니다. </li><li> 챔버 그런 다음 유연한 플라스틱 튜브를 통해 질소 가스 탱크에 연결 현미경 단계 (그림 1C)에서 원하는 지점에 위치합니다. 이 때 튜브와 microincubator는 조심스럽게 튜브와 챔버의 측면을 따라 포트 플러그의 안전한 첨부 파일을 확보하여 누수를 확인한다. 하나는 알 수그렇게 쉽게 누설가있는 경우 형성 거품,을 찾을 수있는 튜브 위에 비누 물을 소량의 확산. </li></ol> 3. 산소 결핍에 현미경 <ol><li> 낮은 배율에서 동물을 찾은 다음, 이미지 조직 또는 성인 배아 blastomeres 또는 oocytes과 같은 관심 셀에 적절한 높은 배율 (이 응용 프로그램에 대한 64x)로 이동합니다. GFP 신호를 확인하고 관심있는 셀 (들)에 GFP 융합 단백질을 찾습니다 488 nm의 레이저를 사용합니다. </li><li> 세포주기 체포의 특정 단계에서 체포을 시각화하기 위해 (예를 들면 말 prophase) 세포 분열의 이전 단계 (예 : 말 계면 또는 초기 prophase)에 blastomere를 확인합니다. 이러한 centriole 위치, 염색체 응축의 개시, 염색체 위치와 핵 봉투의 유무 등의 세포 마커는 세포주기 단계 (그림 2A)을 확인하는 데 도움이됩니다. </li><li> 챔버 그런 다음 질소 가스 (99.999 %로 perfused 수 있습니다N 2, &lt;2 ppm으로 O 2). 우리는 6 psi의 압력을 사용하여이 경우에, 그러나 압력은 조정 각 microincubator의 크기와 사용 튜브의 직경에 따라 최적화해야 할 수 있습니다. 질소는 필요에 따라 초점 평면을 조정, 방을 가득로 blastomere (들)을 모니터링하고 있습니다. </li><li> 이 시점에서, 시간 경과 영상이 시작되었습니다. 영상은 내부 핵 막에 염색체의 경우 prophase의 체포와 도킹에 관심 현상을 캡처 할 수있는 한 필요에 따라에 진행됩니다. 이미지는 30 분 이상 더 이상마다 10 초에 한 번 촬영​​하고 있습니다. 이미지 캡처 및 이득과 레이저 전원과 같은 설정 주파수는 필요에 따라 조정해야합니다. </li><li> 배아는 anoxic 환경에 대응하는 시간은 산소 결핍에 노출시 세포주기 단계에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 산소 결핍 유도 prophase의 체포는 질소 가스의 흐름을 시작으로 20-30 분 이내에 발생합니다. 우리는 산소 결핍 유발 세포주기 체포 occu을 관찰 한&lt;20 분에 rring. 이미지는이 기간 동안 얻을 수 또는 특정 이미지는 나중에 시간이 경과 시리즈에서 격리 할 수​​ 있습니다. 추가 옵션은 배아에서 하위 세포 구조를 시각화하는 비디오 현미경을 사용하는 것입니다. </li><li> 산소 결핍 유도 체포 상태에서 복구를 문서화하려면, 가스는 꺼져 있고 챔버는 시간 경과 시리즈를 녹음하면서 확산에 의해 normoxia로 돌아갑니다 허용됩니다. 염색체의 세포주기의 진행과 undocking의 재개는 일반적으로 질소 가스를 사용하지 않도록 설정의 5-20 분 이내에 발생합니다. </li><li> 별도의 실험에서 산소 결핍 표시기, resazurin가 흐름을 통해 microchamber에 배치 된 있습니다, 그것은 질소 가스의 흐름이 시작 후 챔버은 약 19 분의 평균 anoxic 될 것으로 판단되었다. </li><li> 이미지와 동영상은 Imaris, 이미지 J 또는 포토샵을 사용하여 처리 및 표시를 위해 퀵타임으로 가져옵니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

산소가 결핍되어서 및 일시 중지 애니메이션 심각한 산소가 결핍되어서에 노출 어떤 생물에 치명적일 수 있지만, 일부 생물은 산소 결핍에 노출 생존 할 수 있습니다. C.의 경우 elegans는 산소 결핍 노출의 생존은 발달 단계 및 산소 결핍에 대한 응답에 따라 달라집니다 항목은 관찰 할 수있는 생물학적 과정의 번호가 체포되는 정지 애니메이션의 치료 상태로 있습니다. 산소 환경 7,9에 다시 제출 될 때까지 세포 분열, 개발, 운동, 식사, 생식 과정은 중단. 산소 결핍 노출 배아의 세포주기의 진행, 계면에서 가역적으로 체포, 늦은 prophase 또는 metaphase. 이러한 고정 샘플과 산소 박탈 환경에서 특정 하위 세포 구조를 이미징 할 수 있습니다 생체 GFP 융합 단백질 assays에 immunostaining와 같은 세포 생물학 기술의 사용은, 식별 및 특성화에 역할을되었습니다C....

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td></td><td></td><td> 구성 </td></tr><tr><td> 차아 염소산염 솔루션 </td><td></td><td></td><td> 0.7 g 코, 12 ML 5 % NaOCl은 ddH 2 0과 50 ML에 가져 </td></tr><tr><td> M9 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 3g KH 2 PO 4, 11g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 L ddH 2 O 당 1 ML (1 M) MgSO 4 </td></tr><tr><td> 유리 현미경 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;개&quot;x1.0의 mm </td></tr><tr><td> 라운드 마이크로 coverglass </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 72223-01 </td><td> 25mm의 직경 </td></tr><tr><td> 할로 카본 오일 700 </td><td> 시그마 </td><td> H8898-100ml </td><td></td></tr><tr><td> 마취제 </td><td></td><td></td><td> 0.5 % tricaine, 0.05 % tetramisole </td></tr><tr><td> 라이덴 휴일 재관류 Microincubator </td><td> 하버드 장치 </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> UHP 질소 </td><td> Calgaz (에어 Liquide) </td><td></td><td> &gt; 99.9990 % N 2 &lt;2 ppm으로 O 2 </td></tr><tr><td> 플라스틱 튜브 </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0.062 &quot;ID X 0.125&quot;OD </td></tr><tr><td> 디스크 공 촛점 현미경을 스피닝 </td><td> McBain 시스템 </td><td></td><td> Zeiss 광학 현미경, epifluorescence 조명 시스템, CSU-10 요코 공 촛점 스캐너, 하마 마츠 전자 배율 CCD 카메라를 거꾸로. </td></tr></tbody></table>

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; c. elegans</em&gt; 태아

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans는 성인과 배아 단계의 투명성에 의해뿐만 아니라 융합 단백질 1-4의 무수한을 표현 유전자 돌연변이 유전자 변형 종자의 가용성에 의해 촉진되어 스트레스 저항의 연구에서 널리 사용되었습니다. 또한, 이러한 세포 분열과 같은 동적 프로세스는 휘황 표시 기자 단백질을 사용하여 볼 수 있습니다. 유사 분열의 연구가 손상 생물 등 다양한 시스템에서 시간 경과 실험의 사용을 통해 촉진 될 수있다; 따라서 초기 C. elegans의 배아가 잘 본 연구에 적합합니다. 고성능 현미경에 설치를 통해 간단한 가스의 흐름을 이용하여 스트레스가 가능합니다, 여기에 제시된 것은 anoxic에 대한 응답 (&lt;2 ppm으로 O 2 99.999 % N 2) 하위 세포 구조를 생체 이미징에있는이 기술입니다. microincubation 챔버는을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 사용됩니다동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들 수 있습니다. 사용 GFP를 태그 감마 tubulin과 히스톤은 역학과 세포 분열의 체포는 동안과 산소 박탈 환경에 노출 후, 전에 모니터 할 수 있습니다. 이 기법의 결과는 산소가 결핍되어서에 노출 배아의 blastomeres에서 높은 해상도, 자세한 동영상 및 세포 구조의 이미지입니다.

심각한 산소가 결핍되어서 (산소 결핍)에 노출 C. elegans의 배아는 개발 및 세포 분열 7 등의 생물학적 과정을 체포하여 생존 할 수 있습니다. 세포 분열의 산소 결핍 유발 체포 동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 microincubation 챔버를 사용하여, 하위 세포 수준에서 모니터 할 수 (그림 1). 관심 세포 구조는 다양한 가스 환경에 노출 배아에서 모니터링 할 수 있으며이 경우에는 우리는 산소 결핍에 노출 배아의 염색체 구조를 모니터링 할 수 GFP 태그 감마 tubulin과 히스톤 H2B를 사용했습니다. 산소 결핍에 노출 배아 내에서 prophase blastomeres의 염색체는 압축되고 내부 핵 주변으로 정렬, 현상은 &quot;염색체 도킹&quot;(그림 2, 영화 1)이라고도합니...

는 여기에 설명<em&gt; 생체 내</em회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 microincubation 챔버를 통해 가스의 흐름을 이용하여 산소 결핍에 노출 동물의 이미지를 하위 세포 구조에&gt; 기술. 이 방법은 간단하고 실험 매개 변수 및 모델 시스템의 다양한 맞게 할 수있을만큼 유연하다.

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

Caenorhabditis elegans는 성체 및 배아 단계의 투명성 덕분에 스트레스 내성 연구에 광범위하게 이용되어 왔습니다...

이 절차의 전반적인 목표는 고성능 현미경의 가스 흐름 시스템을 사용하여 무산소 상태에 노출된 sea elegance 배아의 세포 내 역동성을 영상화하는 in vivo 기술을 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 어린 성체 형질전환 동물의 샘플을 준비하여 영상화에 적합한 어린 배아 집단을 생성합니다. 그다음, 미세 배양 챔버에서 사용할 얇은 agros 패드 슬라이드를 준비합니다.그 다음, 해양 무척추동물을 적절히 마취시키고 가스 흐름에 노출되었을 때 건조되는 것을 방지하기 위해 할로카본 오일로 덮어줍니다. 마지막으로, 마취된 동물이 놓인 원형 커버 글라스를 마이크로 배양 챔버 안에 넣습니다. 이후 챔버를 현미경 스테이지 위에 올리고, 마이크로 배양 챔버를 통한 가스 흐름을 이용하여 이미징을 수행하는 동안 무산소 환경을 조성하기 위해 질소 가스를 채웁니다.in vivo 형광 현미경법을 병행하면 무산소 상태에 반응하여 일어나는 세포 주기 정지의 고해상도 상세 영상과 이미지를 얻을 수 있습니다. 간접 면역형광법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 동물이 특정 조건에 노출된 상태에서 세포 내 변화를 in vivo로 기록할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법은 elegans 배아에서 무산소 상태로 유도된 가사 상태에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.또한 효모, 세포 배양 또는 기타 소형 무척추 또는 척추 동물 배아와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 고산소 온도, 스트레스 또는 저분자 화합물 처리와 같은 추가 조건 또한 적용 가능합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Anastacia Garcia와 Mary Latt입니다. 본 연구에서는 염색체와 중심체를 세포 분열 마커로 시각화하기 위해 적절한 형질전환 C. elegans 균주인 TH 32 형질전환 균주를 사용하여 시작합니다.차아염소산염 용액으로 성체 유충의 중력을 분해하여 동기화된 개체군을 생성하고, 남은 배아를 씨앗 플레이트에 성체 유충과 함께 옮겨 1~2시간 동안 알을 낳게 하거나, 혼합 개체군에서 L4 유충을 선택하여 새로운 씨앗 플레이트로 옮깁니다. 선충을 20 °C에서 GR 청년기 성체까지 배양하며, 이는 부화 후 약 96시간, L1 유충부터 72시간, 또는 L4 탈피 후 24시간이 소요됩니다. 이 방법론은 세포 내 및 핵 내 변화를 이미징하기에 최적인 크고 뚜렷한 세포질과 핵을 가진 초기 배아를 다량 포함하는 청년

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연구

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생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을...

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해...

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

프로토콜은 C에서 산소 결핍 / 기아를 사용하는 설명 허혈 / 재관류를 모델로 엘레. 기능적 결과는 사망률 증가, GFP - 라벨의 연결 과정에서 볼 수 이상 및 신경 세포의 기능을 필요로 장애 행동 반응 (가) 있습니다.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

여기에서, 우리는 Caenorhabditis elegans embryos 를 준비하고 장착하고, 4D 현미경으로 개발을 기록하고 세포 계보를 추적하기위한 프로토콜을 제시합니다.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

여기에서는 모델 선충 C. elegans의 생식계에서 발현되는 유전적으로 암호화된 칼슘 리포터를 사용하여 수정 및 초기 배발생 중 칼슘을 시각화하기 위한 프로토콜과 도구를 제시합니다.

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

배우세요 C. elegans 태아에서 산소 결핍으로 유도된 세포 주기 정지를 실시간 현미경으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 미세 배양 챔버와 질소 가스 흐름을 사용하여 아녹시아 환경에서 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용

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