에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용

이 절차의 전반적인 목표는 고성능 현미경의 가스 흐름 시스템을 사용하여 무산소 상태에 노출된 sea elegance 배아의 세포 내 역동성을 영상화하는 in vivo 기술을 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 어린 성체 형질전환 동물의 샘플을 준비하여 영상화에 적합한 어린 배아 집단을 생성합니다. 그다음, 미세 배양 챔버에서 사용할 얇은 agros 패드 슬라이드를 준비합니다.

그 다음, 해양 무척추동물을 적절히 마취시키고 가스 흐름에 노출되었을 때 건조되는 것을 방지하기 위해 할로카본 오일로 덮어줍니다. 마지막으로, 마취된 동물이 놓인 원형 커버 글라스를 마이크로 배양 챔버 안에 넣습니다. 이후 챔버를 현미경 스테이지 위에 올리고, 마이크로 배양 챔버를 통한 가스 흐름을 이용하여 이미징을 수행하는 동안 무산소 환경을 조성하기 위해 질소 가스를 채웁니다.

in vivo 형광 현미경법을 병행하면 무산소 상태에 반응하여 일어나는 세포 주기 정지의 고해상도 상세 영상과 이미지를 얻을 수 있습니다. 간접 면역형광법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 동물이 특정 조건에 노출된 상태에서 세포 내 변화를 in vivo로 기록할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법은 elegans 배아에서 무산소 상태로 유도된 가사 상태에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

또한 효모, 세포 배양 또는 기타 소형 무척추 또는 척추 동물 배아와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 고산소 온도, 스트레스 또는 저분자 화합물 처리와 같은 추가 조건 또한 적용 가능합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Anastacia Garcia와 Mary Latt입니다. 본 연구에서는 염색체와 중심체를 세포 분열 마커로 시각화하기 위해 적절한 형질전환 C. elegans 균주인 TH 32 형질전환 균주를 사용하여 시작합니다.

차아염소산염 용액으로 성체 유충의 중력을 분해하여 동기화된 개체군을 생성하고, 남은 배아를 씨앗 플레이트에 성체 유충과 함께 옮겨 1~2시간 동안 알을 낳게 하거나, 혼합 개체군에서 L4 유충을 선택하여 새로운 씨앗 플레이트로 옮깁니다. 선충을 20 °C에서 GR 청년기 성체까지 배양하며, 이는 부화 후 약 96시간, L1 유충부터 72시간, 또는 L4 탈피 후 24시간이 소요됩니다. 이 방법론은 세포 내 및 핵 내 변화를 이미징하기에 최적인 크고 뚜렷한 세포질과 핵을 가진 초기 배아를 다량 포함하는 청년기 성체 개체군을 생성하는 수단을 제공합니다.

준비된 슬라이드를 보관할 습윤 챔버를 설정하려면, 뚜껑이 있는 충분한 크기의 대형 페트리 접시나 보관 용기 안에 젖은 페이퍼 타월을 넣습니다. 탈이온수 기반의 2% aros 용액을 유리 기구에 담아 마이크로파 가열기나 항온수조로 가열하여 용해시킵니다. 그다음, 깨끗한 유리 현미경 슬라이드 위에 따뜻한 aros 용액을 1~3방울 떨어뜨리고, 즉시 두 번째 슬라이드를 그 위에 수직으로 뒤집어 올린 후, 결과물인 패드가 얇게 형성되고 기포가 생기지 않도록 살짝 누릅니다.

aros가 천천히 식은 후, 두 개의 현미경 슬라이드를 분리하여 한쪽 슬라이드에 aros 패드가 그대로 남아 있게 합니다. 현미경의 초점 조절 능력을 방해하지 않도록 aros 패드가 충분히 얇은지 확인하는 것이 중요합니다. 이후, 깨끗한 면도날을 사용하여 Aros 패드를 작은 정사각형 모양으로 다듬습니다.

사용 준비가 될 때까지 준비된 습윤 챔버에 슬라이드를 보관하십시오. 동일한 깨끗한 면도날을 사용하여 aros 패드의 가장자리를 조심스럽게 집어 슬라이드에서 25 millimeter 원형 마이크로 커버 글라스 위로 옮깁니다. 원형 커버 글라스 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하며, 마이크로 인큐베이터에 적절하게 맞도록 배치해야 합니다.

aros 패드 위에 마취제 한 방울을 떨어뜨립니다. 5~10마리의 벌레를 선택하여 마취제 방울 속에 넣습니다. 벌레들이 움직임을 멈출 때까지 1~3분 동안 기다립니다.

피펫 팁을 사용하여 웜 위에 할로우 카본 오일(hallow carbon oil) 한 방울을 떨어뜨려, 챔버에 가스가 흐르는 동안 웜이 건조해지는 것을 방지합니다. 다음으로, 유연한 플라스틱 튜브의 한쪽 끝을 챔버에 연결합니다. 밀폐형 관류 마이크로 인큐베이터의 두 부분을 분리하고, 커버 글라스를 바닥 링 위에 조심스럽게 세워 놓습니다.

챔버의 양측면을 단단히 닫으십시오. 그런 다음 유연한 플라스틱 튜브를 통해 챔버를 질소 가스 탱크에 연결하고 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 배아를 이미지화하기 전, 튜브와 챔버 측면의 포트 플러그가 잘 부착되었는지 확인하여 누출 여부를 점검하십시오.

먼저, 저배율에서 개체를 찾습니다. 그런 다음 적절한 고배율로 전환합니다. 성체 내의 배아 blasphemers를 이미징하려면, 488 nanometer 레이저를 사용하여 표적 세포 내의 GFP 융합 단백질을 찾으십시오.

세포 주기 정지의 특정 단계(예: 후기 전기)를 시각화하려면, 후기 간기 또는 초기 전기와 같은 세포 분열의 이전 단계에 있는 세포를 식별하십시오. 챔버에 질소 가스를 주입하고, 질소가 챔버를 채우는 동안 필요에 따라 초점 평면을 조정하며 세포를 계속 모니터링하십시오. 타임랩스 이미징을 수행하여 이 경우 관심 대상인 원하는 현상을 포착하십시오.

전기 정지와 염색체의 핵 내막 부착. 최대 30분 동안 10초마다 이미지를 촬영하십시오. 일반적으로 무산소 상태로 유도된 전기 정지는 질소 가스 유입 시작 후 20~30분 이내에 발생합니다.

무산소 상태로 유도된 정지 상태로부터의 회복을 기록하려면, 가스를 차단하고 타임랩스 시리즈를 녹화하면서 챔버가 정상 산소 상태로 돌아오게 합니다. 세포 주기 재개와 염색체 응축 해제는 일반적으로 5분에서 20분 이내에 일어납니다. 이미지와 비디오를 처리하려면 Image J 또는 Photoshop을 사용하고, 이를 QuickTime으로 가져와 재생합니다.

무산소 상태에 노출된 배아 내에서, 전기의 염색체들은 응축되어 핵의 내측 주변부로 정렬됩니다. 이러한 현상을 염색체 도킹(chromosome docking)이라고 하며, 재산소화 시 세포 주기 진행이 재개되어 전기의 염색체들이 이동하게 됩니다.

Blasphemy가 핵 주변부에서 적도판으로 이동하며 중기(metaphase)로의 진행을 나타낼 것입니다. 이 기술을 숙달하면 적절한 단계의 동물을 사용하여 3~4시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 실험을 완료할 충분한 시간을 확보하기 위해 건강한 젊은 성체 동물만을 사용해야 하며, 적절한 단계의 blasphemer를 선택하는 법을 배울 때 인내심을 갖는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 고해상도 현미경과 가스 흐름 챔버를 이용하여 GaN 배아 내에서 무산소증으로 유도된 세포 내 사건을 in vivo로 포착하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.