에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용 C. elegans 태아
December 3rd, 2012
는 여기에 설명 생체 내 기술. 이 방법은 간단하고 실험 매개 변수 및 모델 시스템의 다양한 맞게 할 수있을만큼 유연하다.
이 절차의 전반적인 목표는 고성능 현미경의 가스 흐름 스루 설정을 사용하여 무산소증에 노출된 바다의 우아한 배아에서 세포 내 역학을 이미지화하는 생체 내 기술을 설명하는 것입니다. 이는 이미징에 적합한 어린 배아 집단을 생성하기 위해 먼저 젊은 성인 형질전환 동물의 샘플을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 마이크로 인큐베이션 챔버에서 사용할 얇은 아그로스 패드 슬라이드를 준비합니다.
다음 바다 우아함은 가스 교류에 드러낼 때 건조를 피하기 위하여 제대로 마취되고 후광 탄소 기름으로 덮습니다. 마지막으로, 마취된 동물이 있는 원형 덮개 유리를 마이크로 배양 챔버에 넣습니다. 그런 다음 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 질소 가스로 채워 무산소 환경을 생성하는 동시에 궁극적으로 마이크로 인큐베이션 챔버를 통한 가스 흐름의 사용을 이미징합니다.
in vivo 형광 현미경과 함께 사용하면 무산소증에 대한 반응으로 세포주기 정지에 대한 고해상도의 상세한 비디오 및 이미지를 얻을 수 있습니다. 간접 면역형광과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 동물이 특정 조건에 노출되는 동안 세포 내 변화를 생체 내에서 문서화할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 예쁜꼬마선충 배아에서 무산소증으로 유도된 정지 애니메이션에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
또한 효모, 세포 배양 또는 기타 작은 무척추 동물 또는 척추 동물 배아와 같은 다른 시스템에 적용할 수 있습니다. 고산소증 온도, 스트레스 또는 저분자 치료와 같은 추가 조건도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 두 대학원생인 Anastacia Garcia와 Mary Latt입니다.이 연구에서 관심을 갖는 적절한 형질전환 C Elgan 균주로 시작하여 TH 32 형질전환 균주를 사용하여 염색체와 중심체를 세포 분열을 위한 마커로 시각화할 것입니다.
차아염소산염 용액에서 중력 성충을 분해하여 동기화된 개체군을 생성하고 남은 배아를 사용하여 중력 성체를 파종된 플레이트와 알에 올려 1-2시간 동안 낳거나 혼합 개체군에서 L 4마리의 유충을 선택하여 새로운 파종된 플레이트에 넣습니다. 섭씨 20도에서 GR 성체까지 선충을 성장시키며, 부화한 후 약 96시간, L 유충 1마리로부터 72시간, L 4마리의 털갈이 후 24시간이 소요됩니다. 이 방법론은 세포 내 및 핵 하 변화를 이미징하는 데 최적화된 큰 신성모독자와 핵을 포함하는 풍부한 수의 어린 배아를 포함하는 젊은 성인 집단을 생성하는 수단을 제공합니다.
준비된 슬라이드를 담을 수 있는 습한 챔버를 설정하려면 젖은 종이 타월을 큰 페트리 접시나 충분한 크기의 뚜껑으로 덮인 쓰레기통 안에 넣으십시오. 탈이온수에 용융된 2%aros를 전자레인지나 수조를 통해 유리 제품에 혼합물을 가열하여 준비합니다. 다음으로 깨끗한 유리 현미경에 따뜻한 아로스 1-3방울 슬라이드를 즉시 아로스 방울 위에 수직으로 거꾸로 한 두 번째 슬라이드를 놓고 결과 패드가 얇고 기포가 없도록 약간 누릅니다.
아로스가 천천히 냉각된 후 두 개의 현미경 슬라이드를 분해하고 슬라이드 중 하나에 아로스 패드를 그대로 둡니다. aros 패드가 현미경의 초점을 맞추는 기능을 방해하지 않을 만큼 충분히 얇은지 확인하는 것이 중요합니다. 나중에. 깨끗한 면도날을 사용하여 Aros 패드를 작은 정사각형 상점으로 만드십시오.
사용할 준비가 될 때까지 준비된 습한 챔버에서 미끄러집니다. 동일한 깨끗한 면도날을 사용하여 aros 패드의 가장자리를 조심스럽게 잡고 슬라이드에서 둥근 25mm 마이크로 커버 유리로 옮깁니다. 원형 덮개 아래에 기포가 쌓이지 않도록 유리가 마이크로 인큐베이터에 적절하게 맞아야 합니다.
아로스 패드에 마취제 한 방울을 떨어뜨립니다. 5-10마리의 벌레를 골라 마취제에 넣으십시오. 지렁이가 움직임을 멈출 때까지 1-3분 정도 기다립니다.
피펫 팁을 사용하여 가스가 챔버를 통해 흐를 때 벌레가 탈수되는 것을 방지하기 위해 벌레 위에 할로우 탄소 오일 한 방울을 추가합니다. 다음으로, 유연한 플라스틱 튜브의 한쪽 끝을 챔버에 연결합니다. 밀폐된 관류 마이크로 인큐베이터의 두 반쪽을 분리하고 덮개 유리를 하단 링에 똑바로 세웁니다.
챔버의 양쪽을 단단히 닫습니다. 그런 다음 유연한 플라스틱 튜브를 통해 챔버를 질소 가스 탱크에 연결하고 현미경 스테이지에 놓습니다. 배아를 이미지화하기 위해 챔버 측면을 따라 튜브와 포트 플러그를 단단히 부착하여 누출이 있는지 확인합니다.
먼저 더 낮은 배율에서 동물을 찾습니다. 그런 다음 적절한 더 높은 배율로 이동합니다. 성인의 배아 신성 모독자를 이미지화하려면 488 나노미터 레이저를 사용하여 관심 세포에서 GFP 융합 단백질을 찾습니다.
세포주기 정지의 특정 단계(예: 후기 전구기)를 시각화하려면 후기 계기 또는 초기 전구기와 같은 세포 분열의 이전 단계에서 신성모독자를 식별합니다. 챔버를 질소 가스로 관류시키고 질소가 챔버를 채울 때 신성 모독자를 계속 모니터링하여 필요에 따라 초점면을 조정합니다. 이 경우 원하는 관심 현상을 캡처하기 위해 타임 랩스 이미징을 수행합니다.
Prophase arrest and docking of the chromosomes to the inner nuclear membrane(내부 핵막에 염색체의 전구 정지 및 도킹). 최대 30분 동안 10초마다 한 번씩 이미지를 촬영합니다. 일반적으로 무산소증에 의한 전구기 정지는 질소 가스 흐름이 시작된 후 20-30분 이내에 발생합니다.
무산소증으로 인한 정지 상태로부터의 회복을 문서화하려면 가스를 끄고 챔버가 정상 산소포화 상태로 돌아가도록 하는 동시에 타임랩스 시리즈를 기록합니다. 세포 주기의 재개와 염색체의 취소는 일반적으로 5분에서 20분 이내에 발생합니다. erris image J 또는 Photoshop을 사용하여 이미지 및 비디오를 처리하고 표시를 위해 QuickTime으로 가져옵니다.
무산소증에 노출된 배아 내에서, 전위상(prophase)의 염색체(chromosomes). 신성모독자들은 응축되어 내부 핵 주변부와 정렬될 것이다. 재산소화 시 염색체 도킹이라고 하는 현상은 세포주기 진행이 재개되고 전구기의 염색체가 재개됩니다.
신성모독은 핵 주변부에서 적도판으로 이동하여 중기로의 진행을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 무대에 오른 동물을 사용하여 3-4시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 실험을 완료할 수 있는 충분한 시간을 할애하기 위해 건강한 어린 성인 동물만 사용해야 한다는 것을 기억하고, 적절하게 연출된 신성모독자를 선택하는 방법을 배울 때 인내심을 가져야 한다는 것을 기억하는 것이 중요하다.
이 비디오를 시청한 후에는 고출력 현미경에서 GaN 배아와 챔버를 통한 가스 흐름을 사용하여 생체 내에서 무산소증으로 인한 세포 내 이벤트를 캡처하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 무산소 상태에 노출된 바다 선인장 배아의 세포 내 동태를 영상화하는 생체 내 기술을 설명합니다. 이 방법은 고출력 스피닝 디스크 공초점 현미경과 결합된 미세 배양 챔버를 통한 가스 흐름을 활용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 영상 기술
배경
- 세포 내 영상화는 환경 스트레스에 대한 세포 반응을 이해하는 데 중요합니다.
- 무산소 상태는 세포의 동태와 생존율에 중대한 영향을 미칠 수 있습니다.
- 바다 선인장은 발생 생물학 연구의 모델 유기체로 사용됩니다.
- 고해상도 영상 기술은 생체 시료에서 동적 과정을 관찰하는 데 필수적입니다.
연구 목적
- 무산소 조건에서 생체 배아의 세포 내 구조를 영상화하는 방법을 개발합니다.
- 산소 결핍에 대한 세포 반응에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 다양한 실험 설정에 적합한 유연한 영상 기술을 제공합니다.
사용된 방법
- 배아를 생성하기 위한 어린 성체 형질전환 바다 선인장의 준비.
- 미세 배양 챔버에서 얇은 아가르 패드 슬라이드의 사용.
- 건조를 방지하기 위해 할로 카본 오일로 바다 선인장을 마취합니다.
- 질소 가스 흐름 아래에서 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용하여 무산소 환경을 만드는 영상화.
주요 결과
- 이 기술은 배아의 세포 내 동태를 실시간으로 영상화할 수 있습니다.
- 영상화 중 무산소 조건의 성공적인 유지.
- 다양한 실험 매개변수에 대한 유연성을 입증했습니다.
- 무산소 상태가 세포 과정에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공했습니다.
결론
- 이 방법은 무산소에 대한 세포 반응을 연구하는 데 귀중한 도구입니다.
- 다른 모델 시스템 및 실험 조건에 적용할 수 있습니다.
- 연구 결과는 스트레스 조건에서 세포 내 동태를 이해하는 데 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This technique enables real-time visualization of subcellular dynamics in live embryos under controlled anoxic conditions, providing mechanistic insights into stress-induced cell cycle arrest. By capturing reversible prophase arrest and chromosome docking in C. elegans, it supports target validation in pathways governing suspended animation and metabolic dormancy. The approach offers a disease-relevant system for probing oxygen-sensing mechanisms with predictive confidence in preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing anoxia-induced cell cycle arrest in vivo, clarifying pathway dynamics in oxygen deprivation.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of subcellular changes without fixation artifacts.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking anoxia exposure to quantifiable cell cycle progression metrics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems using GFP-tagged reporters for standardized, reproducible imaging of cell division dynamics.
- Quantitative Outputs: Generates time-lapse data enabling measurement of arrest onset, duration, and recovery kinetics under defined oxygen gradients.
- Platform Scalability: Adapts to high-content screening workflows for small molecules or genetic modifiers affecting stress response pathways.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models ischemia-reperfusion injury and hypoxic stress in developmental contexts, aligning with translational biomarker discovery.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by monitoring conserved cellular responses to anoxia across model systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on reversible phenotypic arrest and recovery thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live-cell imaging data that informs target engagement and pathway modulation studies prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oxygen-sensing pathways through direct visualization of cell cycle arrest and recovery in embryos.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative readouts on mitotic progression, enabling compound screening for modulators of suspended animation.
- Analytics: Provides time-resolved measurements of prophase arrest duration and chromosome dynamics, facilitating comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by modeling hypoxic stress responses relevant to ischemia, stroke, and metabolic disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to yeast, vertebrate embryos, and cell culture systems under varied stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanistic links between anoxia and cell cycle regulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled gas flow and environmental chamber design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of cytotoxic or cytostatic effects in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds targeting hypoxia-inducible factor (HIF) pathways or mitochondrial stress responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic strain handling, embryo preparation, and live-cell fluorescence microscopy.
- Dependent on spinning disc confocal microscopy, gas flow control systems, and environmental chamber maintenance.
- Necessitates standardization of anoxia exposure timing, temperature control, and recovery protocols across teams.
- Involves adaptation considerations for different model systems, including embryo staging and reporter compatibility.
- Limited by the need for oxygen-tolerant fluorescent tags and potential phototoxicity during prolonged time-lapse acquisition.
