Name: 체외에서 준비 Aplysia californica (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 학습하세요 Aplysia californica의 체외 신경 및 근육 기록 기술로 먹이 섭취 행동을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 행동 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH 보조금 NS047073 및 NSF 보조금 DMS1010434에 의해 지원되었다.

<ol><li>Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinematics+of+multifunctionality%3A+comparisons+of+biting+and+swallowing+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).</li>
<li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+patterns+of+the+B31%2FB32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).</li>
<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+fabrication+and+implantation+in+Aplysia+californica+for+multi-channel+neural+and+muscular+recordings+in+intact%2C+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals.</a> J. Vis. Exp. (40), e1791(2010).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).</li>
<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+diverse+neuropeptide+cotransmitters+by+identified+motor+neurons+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+multiple+identified+motor+neurons+recorded+intracellularly+during+evoked+feedinglike+motor+programs+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia.</a> J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).</li>
<li>Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contingent-dependent+enhancement+of+rhythmic+motor+patterns%3A+an+in+vitro+analog+of+operant+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning.</a> J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).</li>
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<li>Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+organization+of+the+buccal+system+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica.</a> J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).</li>
<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).</li>
<li>Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+behavior+in+Aplysia%3A+A+simple+system+for+the+study+of+motivation%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation.</a> Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+activity+in+motor+neurons+that+produce+radula+movements+distinguishes+ingestion+from+rejection+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).</li>
<li>Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+an+identified+histaminergic+neuron%2C+and+its+possible+role+in+arousal+of+feeding+behavior+in+semi-intact+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia.</a> J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+variants+of+a+motor+act+in+a+modular+and+hierarchical+motor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network.</a> Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+motor+program+switching+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia.</a> J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).</li>
<li>Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuronal+and+peptidergic+control+of+motor+pattern+switching+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).</li>
<li>Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+movement+with+behavior-specific+and+behavior-independent+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules.</a> J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이전 작업은 그대로 동물과 같은 고립 된 신경절 등의 감소 준비에서 Aplysia 모터 프로그램을 특징으로하고 있습니다. 개별 뉴런의 녹음은 5를 획득 한하지만 그대로 동물에서 같은 실험은 매우 어려운이며, 전극은 먹이를하는 동안 신경 세포로 신경 세포에서 이동할 수 없습니다. 절연 신경절에서 신경 활동에 의해 유도 먹이 움직임이 관찰 할 수 없습니다. 정지 구강 대량 준비는이 두 극단 사이의 간격을 다리. 다른 반 그대로 준비가 이전 연구에서 사용하지만, 정지 구강 대량 준비 상당한 장점이있다. 한 반 그대로 준비에서 입술과 구강 질량은 여전히 첨부되었지만, 준비도 14 관찰 할 전체 먹이의 움직임에 감소했다. 체외의 움직임을 먹이의 먹이 헤드 준비 15,16 허용 관찰. 그러나, 일머리 준비를 공급하는 것은 중지 구강 대량 여기서 설명한 것보다 설치가 더 복잡했고, 만 구강 신경절에...

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671</td><td>Biological, Certified</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td>Certified ACS</td></tr><tr><td>염화마그네슘 6수화물</td><td>Acros Organics</td><td>19753</td><td>99% </td></tr><tr><td>황산마그네슘 7수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td>Certified ACS </td></tr><tr><td>염화칼슘 2수화물</td><td>Fisher Scientifc</td><td>C79</td><td>Certified ACS </td></tr><tr><td>포도당 (덱스트로스)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>MOPS 완충액</td><td>Acros Organics</td><td>17263</td><td>99%</td></tr><tr><td>카바콜</td><td>Acros Organics</td><td>10824</td><td>99%</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255</td><td>Certified</td></tr><tr><td>염산</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Certified</td></tr><tr><td>단일 관 모세관 유리</td><td>A-M Systems</td><td>6150</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown 마이크로피펫 풀러 모델 P-80/PC</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>사용 필라멘트: FT345B</td></tr><tr><td>에나멜 코팅 스테인리스강 와이어</td><td>California Fine Wire</td><td></td><td>0.001D, 코팅 h </td></tr><tr><td>가정용 Silicone II 글루 </td><td>GE</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Duro Quick-Gel 순간접착제 </td><td>Henkel corp.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>A-M Systems 모델 1700 증폭기 </td><td>A-M Systems</td><td></td><td>필터 설정: 신경 300-500 Hz, I2 근육 10-500 Hz</td></tr><tr><td>Pulsemaster 다채널 자극기</td><td>World Precision Instruments</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>자극 절연기</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>AxoGraph X</td><td>AxoGraph Scientific</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Veeder-Root 합산 카운터</td><td>Danaher</td><td>C342-0562</td><td></td></tr><tr><td>금도금 커넥터 핀</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>금도금 커넥터 소켓</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 x 50 mm 결정화 접시</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>미세 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>모델링 클레이</td><td>Sargent Art</td><td>22-4400</td><td></td></tr><tr><td>실크 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>K89OH</td><td></td></tr><tr><td>Whisper 공기 펌프</td><td>Tetra</td><td>77849</td><td></td></tr><tr><td>수조용 튜빙</td><td>Eheim</td><td>7783</td><td>12/16 mm</td></tr><tr><td>Elite 에어스톤</td><td>Hagen</td><td>A962</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 정밀 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>구운 초밥용 김</td><td>Rhee Bros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; 체외에서</em의 생리적 운동과 수유 모터 프로그램을 도출하도록 의도하고 녹음&gt; 준비<em&gt; aplysia californica</em

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, 여러, 독특한 행동 하나를 생성 한 주변 구조의 기능은 동물이 빠르게 환경을 변화하는 자신의 행동을 적응 할 수 있습니다. 해양 연체 동물 Aplysia californica는 multifunctionality 연구를위한 다루기 쉬운 시스템을 제공합니다. 수유하는 동안, Aplysia 같은 먹이 장치, 구강 대량를 사용하여 행동의 여러 독특한 종류를 생성합니다. 이러한 행동을 제어하는​​ 신경절은 electrophysiological 연구 액세스 할 수 있습니다 대형 식별 뉴런의 번호가 포함되어 있습니다. 이러한 뉴런의 활동은 신경 활동에 음식 움켜 잡 기사의 친척을 종료하는 신경 활동의 타이밍에 따라 두 가지 종류, ingestive 및 egestive 프로그램으로 나눌 수 있습니다 모터 프로그램에 설명 된 해당 protracts 또는 retracts 움켜 잡 기사 2. 그러나, 절연 신경절에서 이러한 행동을 생산 것입니다 근육 운동은하는, 결석 아르더 생체, 신경과 근육 레코딩의 프로그램에게 2,3,4를 공급하는 해당 획득했습니다. 관찰 모터 프로그램은 실제 행동의 상관 관계 여부를 확신 할 수 있지만, 직접 5 개의 개별 뉴런에서 기록하는 것은 매우 어렵습니다 수 있습니다. 또한, 생체에 ingestive 프로그램은 더 물린 상처와 제비의 1,2, 대부분의 이전에 체외 준비에 설명에 할 어려운 차이로 나눌 수 있습니다. 정지 구강 대량 준비 (그림 1) 절연 신경절과 그대로 동물 사이의 간격을 다리. 이 준비에는 ingestive 행동 - 물고과 삼키는 모두 포함 - 개별 뉴런이에서 녹화 및 세포 전극에게 6을 사용하여 자극 할 수 있으므로 및 egestive 행동 (거부)가 동시에 elicited 수 있습니다. 서로 다른 행동과 관련된 먹이 움직임이 recor 할 수 있습니다ded, 정량화 및 모터 프로그램에 직접 관련된. 중지 된 구강 대량 준비의 모터 프로그램은 모터 프로그램이 분리 된 신경절에 elicited하는 것보다 생체에서 관찰 것과 더 유사하게 나타납니다. 따라서이 준비 모터 프로그램은보다 직접적으로 생체 행동에 관한 할 수 있습니다, 같은 시간에, 개별 뉴런은 그대로 동물에 비해 녹음 및 자극에 더 액세스 할 수 있습니다. 또한,로 분리 신경절과 그대로 동​​물 사이의 중간 단계, 정지 구강 대량의 연구 결과는 더 감소 등 그대로 두 설정에서 얻은 데이터의 해석에 도움이 수 있습니다. 정지 구강 대량 준비 Aplysia의 multifunctionality의 신경 제어를 특징위한 유용한 도구입니다.

세포외 전극을 뉴런의 세포체 위에 배치하여 뉴런을 자극하면, 세포체 채널의 스파이크와 해당 뉴런이 투사되는 신경의 스파이크 사이에 일대일 대응 관계가 관찰됩니다(그림 6, 왼쪽 패널, 확인된 뉴런 B9의 자극). 전류가 인가될 때(그림의 시간 1) 세포체 채널(상단 채널)을 자극 모드로 설정한 후, 빠르게 기록 모드(시간 2)로 전환합니다. 전극의 위치를 유지함으로써, I2 근육, 치설신경, 그리고 양측 구강신경 2 및 3의 활동과 함께 운동 프로그램 동안의 뉴런 활동을 기록할 수 있습니다(그림 6, 오른쪽 패널).
그림 7은 뇌신경절에 carbachol을 투여하여 유도된 일련의 연하 패턴과, carbachol로 유도된 물기 동작 중에 해초 조각을 집게에 배치했을 때 촬영한 비디오 이미지들을 보여줍니다. 7A에서 치설은 해초를 잡기 위해 돌출되며, <stron...

우리는 extracellularly 기록하고 신경, 근육, 및 개인 식별 뉴런에서 자극 할 수있는 기술을 설명<em&gt; 체외에서</em&gt; 도출하도록 의도 및 공급 장치에서 동작을 공급 다른 종류의 관찰<em&gt; Aplysia</em&gt;.

<em&gt; 체외에서</em의 생리적 운동과 수유 모터 프로그램을 도출하도록 의도하고 녹음&gt; 준비<em&gt; Aplysia californica</em

다기능성, 즉 하나의 말단 구조가 여러 개의 뚜렷한 행동을 생성할 수 있는 능력은 동물이 자신의 행동을 빠르게 적응시킬 수 있게 하며...

본 절차의 전체적인 목표는 섭식 운동 프로그램 동안 신경, 근육 및 뉴런의 전기적 활동과 그에 따른 섭식 장치의 움직임을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 plegia에서 구강 덩어리(buccal mass)를 제거하고 주요 신경과 근육에 훅 전극(hook electrodes)을 부착합니다. 두 번째 단계는 구강 덩어리를 기록용 접시에 넣고 세포외 기록을 위해 신경절을 준비하는 것입니다.다음으로, 세포외 전극을 사용하여 표적 뉴런의 위치를 찾습니다. 마지막 단계는 씹기, 삼키기 및 거부와 같은 섭식 운동 프로그램을 유도하고 기록하는 것입니다. 최종적으로, 현수된 구강 질량 표본은 구강 질량의 다양한 섭식 유사 움직임 동안 신경, 근육 및 개별 뉴런의 활동을 보여주는 데 사용됩니다.고립 신경절 연구와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 신경, 근육 및 개별 뉴런의 기록을 섭식 기관의 움직임과 직접적으로 연관 지을 수 있다는 점입니다. 실험 절차 시연을 돕기 위해 저희 실험실의 대학원생인 huu가 참여할 것입니다. 절차를 시작하려면 해부 트레이에 200~300g의 건강한 plegia를 놓고 체중의 약 50%에 해당하는 등장성 염화마그네슘을 주입하여 마취시키십시오. 동물의 꼬리 근처에 첫 번째 주입을 마친 후, 동물의 표면을 부드럽게 마사지하여 염화마그네슘이 퍼지게 하십시오.필요에 따라 동물의 머리 근처에 추가 주사를 실시합니다. 동물이 가벼운 촉각 자극에 반응하지 않게 되면, 등 쪽이 위로 향하게 하여 트레이에 핀으로 고정합니다. 꼬리에 핀 하나를 꽂고, 각 전방 촉수에 핀을 하나씩 꽂습니다.그런 다음 포셉을 사용하여 머리 중앙 부분의 동물의 피부를 집어 들어 올립니다. rhino fours 뒤쪽에서, 잡고 있는 지점 바로 뒤로 동물의 머리를 가로지르는 관상 절개를 실시합니다. 그 후, 구강 질량(buccal mass)을 노출시키기 위해 rhino fours 사이에서 입 방향으로 정중 시상 절개를 실시합니다.다음으로, 피부 플랩을 구강 질량(buccal mass)에서 떼어내고 체벽에 부착된 신경과 결합 조직을 절단합니다. 이 피부 플랩을 구강 질량에서 완전히 분리하기 위해, 구강 질량 자체에 고유한 신경이나 조직을 절단하지 않도록 주의하십시오. 그 후, 식도를 잡고 고정합니다.잡고 있는 지점의 뒤쪽에서 식도를 절단합니다. 식도를 위로 당기고 구강 덩어리 뒤에 있는 구강 덩어리를 들어 올립니다. 뇌신경절, 흉신경절 및 족신경절은 고리를 형성하며, 뇌신경절은 뇌-구강 연결관을 통해 구강신경절과 연결되어 있습니다.이 환상 신경절들은 구강 덩어리에 부착된 상태로 두고, 이 신경절에서 신체 다른 부위로 뻗어 나가는 모든 신경을 절단하십시오. 그런 다음 구강 덩어리 주변의 결합 조직을 절단하고, 신체와의 연결이 느슨해짐에 따라 구강 덩어리를 계속해서 들어 올리십시오. 구강 덩어리가 입에만 부착된 상태가 되면, 식도와 구강 덩어리를 잡으십시오.수직으로 절개합니다. 턱 바로 앞부분을 최종적으로 절단하여 구강 덩어리를 몸체에서 분리합니다. 전극을 부착하는 동안 부분 마취 상태를 유지하기 위해 구강 덩어리를 50% 등장성 염화마그네슘 용액과 50% SIA 식염수 혼합 용액에 넣습니다.그 후, 구강 질량(buccal mass)을 용액과 함께 시가형 바닥(cigar bottom)이 있는 페트리 접시에 넣고, 구강 질량의 복측 표면에 있는 구강 동맥(buccal artery)을 절단합니다. 그런 다음 흉강 및 발 신경절(pleural and pedal ganglia)과 뇌신경절(cerebral ganglion) 사이의 연결 부위를 절단하여 제거합니다. 뇌신경절은 CBC를 통해 구강 신경절 및 구강 질량에 부착된 상태로 두고, 뇌신경절과 구강 질량 사이의 다른 연결 부위들은 절단합니다.식도와 침샘을 짧은 길이로 다듬습니다. 이 단계에서는 훅 전극을 율라 신경(ular nerve)의 안구 부위, 두 개의 근육 협신경(buccal nerves) 2번과 3번, 그리고 협신경 2번의 A 분지에 부착합니다. 이 과정은 Collins와 Shield의 JoVE 출판물에서 시연되었으며 여기에서 간략히 요약된 절차와 유사한 방식으로 진행합니다.각 전극 분리 시, 전극을 신경 또는 근육 근처에 배치하고, 대상 신경을 훅(hook)에 걸어 매니퓰레이터(manipulator)를 사용하여 조심스럽게 들어 올립니다. 그다음 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 신경 부위를 건조시킵니다. 훅에 걸린 신경에 퀵겔(quick gel) 순간접착제를 한 방울 도포하고, 훅은 접착제로 완전히 덮이되 기준 전극(reference wire)의 팁은 접착제가 묻지 않도록 주의합니다.다음으로 폴리에틸렌 튜빙이 연결된 시린지를 사용하여 디쉬의 용액을 접착제에 도포하며, 이를 통해 접착제 표면을 경화시킵니다. 다음 단계는 기록 챔버로 사용할 직경 100mm, 높이 50mm의 Pyrex 기록 디쉬를 준비하는 것입니다. 누출을 최소화하기 위해 피펫 팁을 사용하여 뇌실 및 굴곡 챔버 사이의 홈에 진공 그리스를 얇게 도포합니다. 그런 다음 전방 챔버를 plescia 식염수로 채웁니다.페트리 접시에서 구강 덩어리를 둥근 Pyrex 접시의 앞쪽 챔버로 조심스럽게 옮기십시오. 이때 전극이 너무 팽팽하게 당겨져 신경이 손상되지 않도록 주의하십시오. 접시를 다른 실체 현미경으로 옮겨야 하는 경우, 갈고리 전극을 매우 주의해서 다루십시오. 이는 초(sheath)를 얇게 만들기 위함입니다.구강 질량(buccal mass) 양측의 전극들을 각각 하나로 묶습니다. 커넥터 핀을 덮고 있는 랩 테이프를 잡아 전극을 조심스럽게 잡고, 이때 전극 중 어느 것도 팽팽하게 당겨지지 않도록 주의하십시오. 배양 접시를 현미경 아래에 배치했을 때, 실험 중간 휴식 시간이나 단계 사이에 전극들이 접시 측면에 부드럽게 걸쳐져 플랫폼 위에 놓여 있어야 하며, 수족관용 기포 발생기(airstone)를 사용하여 구강 질량 챔버 내의 식염수를 폭기하십시오.다음으로, CBC가 홈을 통해 통과하도록 하여 뒷방에 있는 뇌신경절을 핀으로 고정합니다. CBC 위에 진공 그리스를 더 도포합니다. 그 다음 접시의 양쪽 부분에 SIA 식염수를 더 추가하여 신경절이 완전히 잠기게 합니다.염수 수위가 뇌 챔버와 구강 챔버 사이의 진공 그리스 높이보다 낮아 챔버 간 누출이 발생하지 않도록 하십시오. 이 단계에서 구강 질량체는 전면 챔버 바닥에 놓여 있어야 합니다. 다음으로, 구강 질량체에 여전히 연결되어 있는 신경이 손상되지 않도록 중간 플랫폼의 구강 신경절을 핀으로 고정하십시오.두 신경 사이의 신경초에만 핀을 고정하십시오. 그 다음 CBC 측면에 핀 두 개를 더 추가하여 이를 신장시키고 고정하십시오. 관심 뉴런의 위치에 따라 구강 신경절을 평평하게 유지하거나 회전시키십시오.구강 신경절(buccal ganglion)을 회전시키려면, 미세 핀셋을 사용하여 CBC의 여분의 초(sheath)를 잡고 제2 구강 신경(buccal nerve two)과 제3 구강 신경(buccal nerve three) 사이에 고정합니다. 이렇게 하면 후방 챔버(back chamber)에 인접하여 구강 신경절 상단에서 쉽게 접근할 수 없었던 대부분의 세포체가 보이게 됩니다. 마지막으로, 구강질(buccal mass) 쪽에 인접한 구강 신경절의 초에 핀 두 개를 추가로 꽂습니다.구강 신경절(buccal ganglion)의 움직임을 최소화하기 위해, 후방 챔버에 인접한 구강 신경절의 초(sheath)를 잡고 세포체가 노출되지 않도록 미세 가위로 과도한 초 부분을 잘라냅니다. 손상을 최소화하기 위해, 초를 얇게 만드는 과정이 끝난 후 세포체를 확인하는 데 필요한 만큼의 초만 제거하십시오. 모든 전극 핀을 증폭기와 연결된 케이블의 소켓에 연결합니다.전극이 너무 팽팽하게 당겨지지 않았는지, 해당 케이블에 올바르게 연결되었는지, 그리고 극성이 정확한지 확인하여 남아 있는 염화마그네슘을 모두 씻어냅니다. 협부 덩어리 챔버 내의 SIA 식염수를 신선한 SIA 식염수로 교체합니다. 다음으로, 협부 덩어리 앞쪽의 연조직과 턱 연골의 배측을 통과하도록 실크 봉합사를 꿰맵니다.두 개의 모델링 클레이를 사용하여 봉합사를 디쉬 가장자리에 고정함으로써, 구강 질량(buccal mass)이 전단 위치에서 매달려 있도록 합니다. 조작기를 사용하여 유리 세포외 전극의 팁이 구강 신경절(buccal ganglion) 근처에 오도록 유지합니다. 뉴런의 위치를 찾고 식별하려면, 세포외 전극의 팁을 초(sheath) 위로 부드럽게 내립니다.뉴런 세포체 위에 위치시킵니다. 자극 전류를 인가한 다음, 세포체를 흥분시키기 위해 사용 중인 채널을 기록 모드로 전환하여 세포외 전극에서의 활성과 그에 상응하는 신경 활성을 기록함으로써 거부 반응을 유도합니다. 운동 프로그램과 마찬가지로, buccal nerve 2A에 2 Hz, 1 ms 펄스의 긴 트레인을 가하여 ees 패턴을 생성합니다.패턴은 자극 기간 동안 계속되며 자극이 종료된 후 잠시 동안 지속될 수 있습니다. 물어뜯기와 같은 운동 프로그램을 유도하려면, 고체 caracol 결정 몇 개를 뇌신경절(cerebral ganglion) 위에 직접 놓으십시오.반복적인 패턴은 일반적으로 5분 이내에 시작되며, 연하 작용을 유도하며 서서히 잦아들기 전까지 약 10분에서 15분 동안 지속됩니다. 운동 프로그램과 마찬가지로, caracol을 적용하고 구강 질량(buccal mass)이 강한 물림 동작을 생성할 때까지 기다립니다. 그 후, 동물이 해조류를 움켜쥘 수 있도록 물림 동작 중에 입안에 해조류 조각을 배치합니다.여기 식별된 운동 신경세포 B9의 자극 및 기록과, 섭식 운동 프로그램 동안 동일한 신경세포, I2 근육 및 여러 신경에서 측정된 기록이 있습니다. 여기 동일한 일련의 운동 프로그램에서 촬영한 비디오 영상이 있습니다. 삼킴 패턴은 뇌신경절에 carbahol을 처리하고, carbahol로 유도된 물기 동작 중에 파래 조각을 파지기에 배치함으로써 유도되었습니다.이 이미지에서는 해조류를 잡기 위해 치설(radula)이 돌출되어 있으며, 이 이미지에서는 치설이 수축하면서 해조류를 입 안으로 끌어당기고 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 현수식 구강 덩어리(suspended buccal mass) 표본을 준비하는 방법과 인 비트로(in vitro) 섭식 운동 프로그램을 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

an-vitro-preparation-for-eliciting-recording-feeding-motor-programs

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을...

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

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해양 달팽이 Aplysia californica 널리 행동의 세포와 분자 기초에 연구에 대 한 신경 생물학 모델로 사용 되었습니다. 여기서 방법론은 확인된 신경 회로의 단일 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia의 신경계를 탐구하기 위해 설명된다.

아피시아 단일 뉴런의 전기 생리 및 분자 분석을 위한 신경리아 준비

행동 분석은 뉴런 기능을 이해하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 여기에서는 모델 선충 Pristionchus pacificus와 그 친척에서 발견되는 포식적 섭식 행동을 정량화하기 위한 몇 가지 프로토콜을 제시합니다. 또한 입 구조와 치아를 포함한 포식적 섭식 적응을 분석하는 방법을 제공합니다.

에서 약탈 먹이 행동을 분석<em&gt; Pristionchus</em&gt; 및 기타 선충

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꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

여기에서 우리는 수유 행동 도중 이 근육의 역할을 이해하기 위하여 해양 연체 동물 Aplysia californica의 공급 장치에 내재된 근육의 최소침습 외과 병변을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Aplysia 칼리포르니카의 오돈토포어에 내재된 근육에 대한 최소 침습 병변 기술

이 프로토콜은 흡광도 전압에 민감한 염료 및 포토다이오드 어레이를 사용하여 비 형이상무척추동물 종의 단일 세포 분해와 신경 인구 활성을 이미징하는 방법을 제시한다. 이 접근 방식을 통해 하루 동안 이미징 및 분석을 추구할 수 있는 빠른 워크플로우가 가능합니다.

비 트랜스제닉 무척추 동물의 단일 신경 해상도를 가진 네트워크 역학을 기록하기위한 포토다이오드 기반 광학 이미징

이 프로토콜은 젊은 RAC1/CED-10 돌연변이 Caenorhabditis elegans에서의 정량적 배변 검사를 상세히 다루며, 전염성 파킨슨병 병기를 연구할 수 있는 간단한 모델을 제공합니다. 이 방법은 다른 동물 모델의 한계를 극복하고 초기 파킨슨병리를 표적으로 하는 치료 전략 시험을 용이하게 합니다.

초기 파킨슨병 연구 도구로서 Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 돌연변이의 위장 운동성 평가

학습하세요 Aplysia californica의 체외 신경 및 근육 기록 기술로 먹이 섭취 행동을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 행동 생물학 연구에 활용됩니다.

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