본 절차의 전체적인 목표는 섭식 운동 프로그램 동안 신경, 근육 및 뉴런의 전기적 활동과 그에 따른 섭식 장치의 움직임을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 plegia에서 구강 덩어리(buccal mass)를 제거하고 주요 신경과 근육에 훅 전극(hook electrodes)을 부착합니다. 두 번째 단계는 구강 덩어리를 기록용 접시에 넣고 세포외 기록을 위해 신경절을 준비하는 것입니다.

다음으로, 세포외 전극을 사용하여 표적 뉴런의 위치를 찾습니다. 마지막 단계는 씹기, 삼키기 및 거부와 같은 섭식 운동 프로그램을 유도하고 기록하는 것입니다. 최종적으로, 현수된 구강 질량 표본은 구강 질량의 다양한 섭식 유사 움직임 동안 신경, 근육 및 개별 뉴런의 활동을 보여주는 데 사용됩니다.

고립 신경절 연구와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 신경, 근육 및 개별 뉴런의 기록을 섭식 기관의 움직임과 직접적으로 연관 지을 수 있다는 점입니다. 실험 절차 시연을 돕기 위해 저희 실험실의 대학원생인 huu가 참여할 것입니다. 절차를 시작하려면 해부 트레이에 200~300g의 건강한 plegia를 놓고 체중의 약 50%에 해당하는 등장성 염화마그네슘을 주입하여 마취시키십시오. 동물의 꼬리 근처에 첫 번째 주입을 마친 후, 동물의 표면을 부드럽게 마사지하여 염화마그네슘이 퍼지게 하십시오.

필요에 따라 동물의 머리 근처에 추가 주사를 실시합니다. 동물이 가벼운 촉각 자극에 반응하지 않게 되면, 등 쪽이 위로 향하게 하여 트레이에 핀으로 고정합니다. 꼬리에 핀 하나를 꽂고, 각 전방 촉수에 핀을 하나씩 꽂습니다.

그런 다음 포셉을 사용하여 머리 중앙 부분의 동물의 피부를 집어 들어 올립니다. rhino fours 뒤쪽에서, 잡고 있는 지점 바로 뒤로 동물의 머리를 가로지르는 관상 절개를 실시합니다. 그 후, 구강 질량(buccal mass)을 노출시키기 위해 rhino fours 사이에서 입 방향으로 정중 시상 절개를 실시합니다.

다음으로, 피부 플랩을 구강 질량(buccal mass)에서 떼어내고 체벽에 부착된 신경과 결합 조직을 절단합니다. 이 피부 플랩을 구강 질량에서 완전히 분리하기 위해, 구강 질량 자체에 고유한 신경이나 조직을 절단하지 않도록 주의하십시오. 그 후, 식도를 잡고 고정합니다.

잡고 있는 지점의 뒤쪽에서 식도를 절단합니다. 식도를 위로 당기고 구강 덩어리 뒤에 있는 구강 덩어리를 들어 올립니다. 뇌신경절, 흉신경절 및 족신경절은 고리를 형성하며, 뇌신경절은 뇌-구강 연결관을 통해 구강신경절과 연결되어 있습니다.

이 환상 신경절들은 구강 덩어리에 부착된 상태로 두고, 이 신경절에서 신체 다른 부위로 뻗어 나가는 모든 신경을 절단하십시오. 그런 다음 구강 덩어리 주변의 결합 조직을 절단하고, 신체와의 연결이 느슨해짐에 따라 구강 덩어리를 계속해서 들어 올리십시오. 구강 덩어리가 입에만 부착된 상태가 되면, 식도와 구강 덩어리를 잡으십시오.

수직으로 절개합니다. 턱 바로 앞부분을 최종적으로 절단하여 구강 덩어리를 몸체에서 분리합니다. 전극을 부착하는 동안 부분 마취 상태를 유지하기 위해 구강 덩어리를 50% 등장성 염화마그네슘 용액과 50% SIA 식염수 혼합 용액에 넣습니다.

그 후, 구강 질량(buccal mass)을 용액과 함께 시가형 바닥(cigar bottom)이 있는 페트리 접시에 넣고, 구강 질량의 복측 표면에 있는 구강 동맥(buccal artery)을 절단합니다. 그런 다음 흉강 및 발 신경절(pleural and pedal ganglia)과 뇌신경절(cerebral ganglion) 사이의 연결 부위를 절단하여 제거합니다. 뇌신경절은 CBC를 통해 구강 신경절 및 구강 질량에 부착된 상태로 두고, 뇌신경절과 구강 질량 사이의 다른 연결 부위들은 절단합니다.

식도와 침샘을 짧은 길이로 다듬습니다. 이 단계에서는 훅 전극을 율라 신경(ular nerve)의 안구 부위, 두 개의 근육 협신경(buccal nerves) 2번과 3번, 그리고 협신경 2번의 A 분지에 부착합니다. 이 과정은 Collins와 Shield의 JoVE 출판물에서 시연되었으며 여기에서 간략히 요약된 절차와 유사한 방식으로 진행합니다.

각 전극 분리 시, 전극을 신경 또는 근육 근처에 배치하고, 대상 신경을 훅(hook)에 걸어 매니퓰레이터(manipulator)를 사용하여 조심스럽게 들어 올립니다. 그다음 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 신경 부위를 건조시킵니다. 훅에 걸린 신경에 퀵겔(quick gel) 순간접착제를 한 방울 도포하고, 훅은 접착제로 완전히 덮이되 기준 전극(reference wire)의 팁은 접착제가 묻지 않도록 주의합니다.

다음으로 폴리에틸렌 튜빙이 연결된 시린지를 사용하여 디쉬의 용액을 접착제에 도포하며, 이를 통해 접착제 표면을 경화시킵니다. 다음 단계는 기록 챔버로 사용할 직경 100mm, 높이 50mm의 Pyrex 기록 디쉬를 준비하는 것입니다. 누출을 최소화하기 위해 피펫 팁을 사용하여 뇌실 및 굴곡 챔버 사이의 홈에 진공 그리스를 얇게 도포합니다. 그런 다음 전방 챔버를 plescia 식염수로 채웁니다.

페트리 접시에서 구강 덩어리를 둥근 Pyrex 접시의 앞쪽 챔버로 조심스럽게 옮기십시오. 이때 전극이 너무 팽팽하게 당겨져 신경이 손상되지 않도록 주의하십시오. 접시를 다른 실체 현미경으로 옮겨야 하는 경우, 갈고리 전극을 매우 주의해서 다루십시오. 이는 초(sheath)를 얇게 만들기 위함입니다.

구강 질량(buccal mass) 양측의 전극들을 각각 하나로 묶습니다. 커넥터 핀을 덮고 있는 랩 테이프를 잡아 전극을 조심스럽게 잡고, 이때 전극 중 어느 것도 팽팽하게 당겨지지 않도록 주의하십시오. 배양 접시를 현미경 아래에 배치했을 때, 실험 중간 휴식 시간이나 단계 사이에 전극들이 접시 측면에 부드럽게 걸쳐져 플랫폼 위에 놓여 있어야 하며, 수족관용 기포 발생기(airstone)를 사용하여 구강 질량 챔버 내의 식염수를 폭기하십시오.

다음으로, CBC가 홈을 통해 통과하도록 하여 뒷방에 있는 뇌신경절을 핀으로 고정합니다. CBC 위에 진공 그리스를 더 도포합니다. 그 다음 접시의 양쪽 부분에 SIA 식염수를 더 추가하여 신경절이 완전히 잠기게 합니다.

염수 수위가 뇌 챔버와 구강 챔버 사이의 진공 그리스 높이보다 낮아 챔버 간 누출이 발생하지 않도록 하십시오. 이 단계에서 구강 질량체는 전면 챔버 바닥에 놓여 있어야 합니다. 다음으로, 구강 질량체에 여전히 연결되어 있는 신경이 손상되지 않도록 중간 플랫폼의 구강 신경절을 핀으로 고정하십시오.

두 신경 사이의 신경초에만 핀을 고정하십시오. 그 다음 CBC 측면에 핀 두 개를 더 추가하여 이를 신장시키고 고정하십시오. 관심 뉴런의 위치에 따라 구강 신경절을 평평하게 유지하거나 회전시키십시오.

구강 신경절(buccal ganglion)을 회전시키려면, 미세 핀셋을 사용하여 CBC의 여분의 초(sheath)를 잡고 제2 구강 신경(buccal nerve two)과 제3 구강 신경(buccal nerve three) 사이에 고정합니다. 이렇게 하면 후방 챔버(back chamber)에 인접하여 구강 신경절 상단에서 쉽게 접근할 수 없었던 대부분의 세포체가 보이게 됩니다. 마지막으로, 구강질(buccal mass) 쪽에 인접한 구강 신경절의 초에 핀 두 개를 추가로 꽂습니다.

구강 신경절(buccal ganglion)의 움직임을 최소화하기 위해, 후방 챔버에 인접한 구강 신경절의 초(sheath)를 잡고 세포체가 노출되지 않도록 미세 가위로 과도한 초 부분을 잘라냅니다. 손상을 최소화하기 위해, 초를 얇게 만드는 과정이 끝난 후 세포체를 확인하는 데 필요한 만큼의 초만 제거하십시오. 모든 전극 핀을 증폭기와 연결된 케이블의 소켓에 연결합니다.

전극이 너무 팽팽하게 당겨지지 않았는지, 해당 케이블에 올바르게 연결되었는지, 그리고 극성이 정확한지 확인하여 남아 있는 염화마그네슘을 모두 씻어냅니다. 협부 덩어리 챔버 내의 SIA 식염수를 신선한 SIA 식염수로 교체합니다. 다음으로, 협부 덩어리 앞쪽의 연조직과 턱 연골의 배측을 통과하도록 실크 봉합사를 꿰맵니다.

두 개의 모델링 클레이를 사용하여 봉합사를 디쉬 가장자리에 고정함으로써, 구강 질량(buccal mass)이 전단 위치에서 매달려 있도록 합니다. 조작기를 사용하여 유리 세포외 전극의 팁이 구강 신경절(buccal ganglion) 근처에 오도록 유지합니다. 뉴런의 위치를 찾고 식별하려면, 세포외 전극의 팁을 초(sheath) 위로 부드럽게 내립니다.

뉴런 세포체 위에 위치시킵니다. 자극 전류를 인가한 다음, 세포체를 흥분시키기 위해 사용 중인 채널을 기록 모드로 전환하여 세포외 전극에서의 활성과 그에 상응하는 신경 활성을 기록함으로써 거부 반응을 유도합니다. 운동 프로그램과 마찬가지로, buccal nerve 2A에 2 Hz, 1 ms 펄스의 긴 트레인을 가하여 ees 패턴을 생성합니다.

패턴은 자극 기간 동안 계속되며 자극이 종료된 후 잠시 동안 지속될 수 있습니다. 물어뜯기와 같은 운동 프로그램을 유도하려면, 고체 caracol 결정 몇 개를 뇌신경절(cerebral ganglion) 위에 직접 놓으십시오.

반복적인 패턴은 일반적으로 5분 이내에 시작되며, 연하 작용을 유도하며 서서히 잦아들기 전까지 약 10분에서 15분 동안 지속됩니다. 운동 프로그램과 마찬가지로, caracol을 적용하고 구강 질량(buccal mass)이 강한 물림 동작을 생성할 때까지 기다립니다. 그 후, 동물이 해조류를 움켜쥘 수 있도록 물림 동작 중에 입안에 해조류 조각을 배치합니다.

여기 식별된 운동 신경세포 B9의 자극 및 기록과, 섭식 운동 프로그램 동안 동일한 신경세포, I2 근육 및 여러 신경에서 측정된 기록이 있습니다. 여기 동일한 일련의 운동 프로그램에서 촬영한 비디오 영상이 있습니다. 삼킴 패턴은 뇌신경절에 carbahol을 처리하고, carbahol로 유도된 물기 동작 중에 파래 조각을 파지기에 배치함으로써 유도되었습니다.

이 이미지에서는 해조류를 잡기 위해 치설(radula)이 돌출되어 있으며, 이 이미지에서는 치설이 수축하면서 해조류를 입 안으로 끌어당기고 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 현수식 구강 덩어리(suspended buccal mass) 표본을 준비하는 방법과 인 비트로(in vitro) 섭식 운동 프로그램을 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.