Name: 도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: 배우세요 당뇨 쥐의 간에서 도우미에 의존 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 전송으로 네오-작은섬을 형성하는 방법입니다. 이 기법은 고혈당을 역전시키고 인슐린 생성 세포를 유도하여 당뇨병 치료에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NIH에서 교부금에 의해 지원되었습니다 R03 DK089061-01 (VKY), NIH : K08 DK068391 (VKY), 당뇨병과 내분비학 연구 센터 - (DERC - P30DK079638) 의학 베일러 대학에서 파일럿 및 타당성 부여 DERC (VKY), 아동 당뇨병 연구 재단 : JDRF 상 # 5-2006-134 (VKY).

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
<li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li>
<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

HDAds는 초기 세대 광고의 약점을 극복하고 유전자 치료 응용 프로그램에 대한 활용하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 기술적 인 문제가 남아 있습니다. 예를 들어, HDAd는 HDAd의 포장 및 벡터 증폭을위한 HV는 초기 세대 광고만큼 효율적이지 않습니다 필요합니다. HV는 1 세대 광고 및 HV 타협 HDAd의 효과의 오염입니다. 따라서, 고효율 transfection 각 직렬 통과에 대한 최적의 조건 중요합니다. 벡터 생산을위한 또 다른 중요한 매개 변수는 직접 정지 전지 inoculum로 사용됩니다 이후의 통로 5 사용되어야하는 통로 (P1-P4)입니다. 우리의 경험으로, 가장 좋은 결과는 HDAd 벡터 비율은 크게 다음과 같은 통로 (그림 2의 P3)에 증가되는이 통로를 사용하여 얻을 수 있습니다. HDAd 벡터의 수율은 transgene 카세트에 따라 달라집니다. 두 유전자가 아래에 있기 때문에 벡터 생산하는 동안 두 transgenes이 표현됩니다유비쿼터스 발기인. Ngn3는 전사 인자이며, Btc는 표현 성장 호르몬은 벡터 복제 및 포장에 도움이 동안 세포 계보 (Lineage)는 벡터 증폭을 억제 영향을 미칠 수 있다는 HDAd 벡터 표현 전사 인자를 제안 성장 인자입니다. 당뇨병은 전염병 비율을 가정으로, B-세포 질량을 복원 할 수있는 새로운 접근 방법이 필요합니다. 이 보고서에서, 우리는 작은 섬 성장 인자와 함께 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 전사 인자, Ngn3의 유전자 전달에 영향을 미치도록 HDAd 벡터의 장점을 활용하는 방법을 설명, betacellulin은 간 periportal 지역에서 작은 섬의 neogenesis를 유도합니다. 이 효능을 평가하기 위해, 그것은 안정 고혈당증있는 마우스를 선택하고 적절한 컨트롤이 항상 포함되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자 전송 실험 빈 벡터는 당뇨병 마우스는 항상 활용해야 처리. 또한, HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 사용하여 개별적으로 당뇨병 MI에게 치료를CE는 작은 섬 neogenesis에서이 두 유전자의 개별 기여를 테스트하는 역할을한다. 우리의 데이터는 혼자 Ngn3이 작은 섬 neogenesis를 유도하기에 충분하지만, 성장 인자, Btc의 추가는 작은 섬 neogenesis의 강력한 유도로 이어지는 응답을 증가하는 역할을 증명 있습니다. 이 벡터 표현은 실제로 대상 조직, 간에서 달성하고 있으며, 치료를 생쥐의 플라즈마에서 assayed 인슐린은 췌장의 부재를 보여주는하여 췌장의 잔류 섬에서 오는되지 않습니다 있다는 것을 입증하는 것을 테스트하는 것도 중요합니다 당뇨병 쥐 섬. 요약하면, 유전자 전송에 대한 HDAd - 벡터 시스템의 장점은 호스트에 최소 만성 독성뿐만 아니라 벡터 게놈의 비 통합의 자연과 간에서 높은 복제 능력, 효율적인 전달과 긴 지속적인 유전자 발현에 있습니다 염색체. 기본 제한은 세대와 관련된 복잡한 단계의생체 응용 프로그램에서 주로 가장 인기있는 광고 혈청 형 5 간으로 제한됩니다. 작은 섬 neogenesis 완전히 작은 섬 성장 인자, betacellulin과 함께 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 전사 인자, Ngn3의 유전자 전달에 의해 간에서 췌장의 neogenesis을 유도하여 플라즈마 인슐린과 당뇨병 쥐에서 포도당 내성을 복원하도록 유도 할 수 있습니다. 이 보고서에서, 우리는 고품질 HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 생성하는 최적의 프로토콜을 표시하고, 고혈당증을 반대로 당뇨병 생쥐의 간에서 작은 섬 neogenesis를 유도하고 평가하는 기술을 보여줍니다. 각주 : 바이러스 성 벡터와 세포 라인이 여기서 설명은 벡터 생산 핵심 연구소, 당뇨병 연구 센터, 의학 베일러 대학 (에서 구입하실 수 있습니다 <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). 일부 상용 키트 HDAd 바이러스 (예를 들면 Microbix biosyst 생성하기 위해 또한 이용 가능합니다EMS 주식회사).

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> ProFectionR 포유류의 Transfection 키트 </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasy 혈액 및 조직 키트 (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69,504 </td></tr><tr><td> PerfeCTa SYBR 그린 SuperMix, ROX </td><td> 콴타 Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> 나트륨 deoxycholate </td><td> 시그마 </td><td> D6750-25g까지 </td></tr><tr><td> 가상 분말 </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> 페니실린의 스트렙토 마이신 </td><td> 시그마 </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> 시그마 </td><td> H0654-1G </td></tr><tR&gt; <td> 가상 EAGLE JOKLIK </td><td> 시그마 </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> 로슈 </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, 등급 II </td><td> 로슈 </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Streptozocin </td><td> 시그마 </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> 유리 스피너 플라스크 </td><td> 코닝 </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> 유리 스피너 플라스크 </td><td> 코닝 </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> A-lyzer casset 슬라이드 </td><td> 붙여 CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> 튜브 optiseal 폴리 allomer, 11.2 ML </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> 세슘 염화 1kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 최적의 LE-80K ultracentrifuge </td></tr><tr><td> 필터 </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> 관 500m를 원심 분리기리터 </td><td> 코닝 </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree 과학, INC </td><td> TV-150 </td></tr><tr><td> 인슐린, 마우스 엘리사 </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> 마우스 C-펩타이드 엘리사 키트 </td><td> 와코 순수 화학 산업 (주) </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> 기니 돼지 방지 인슐린 항체 </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> 염소 안티 - Pdx1 항체 </td><td> 박사 크리스토퍼 라이트 선물 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 방지 Ngn3 항체 </td><td> 베타 세포 생물학 컨소시엄, 대학. 펜실베니아 </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 Nkx6.1 항체 </td><td> 베타 세포 생물학 컨소시엄, 대학. Pennsy의lvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> 안티 betacellulin 항체 </td><td> 세포 과학 </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) 컬러 시약 SET. </td><td> Teco 진단 </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> 대서양 표준시 / (SGOT), 색상 엔드 포인트 시약 세트 </td><td> Teco 진단 </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약 및 장비.

도우미에 의존 adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

1 형 당뇨병은 췌장의 인슐린 생산 세포의 T 세포 매개 면역 파괴에 의해 발생합니다. 작은 섬 이식은 기증자의 가용성에 의해 및 장기 immunosuppression의 필요성에 의해 제한 되었기 때문에 지금까지 인슐린 대체 여전히 주요 치료입니다. Neuogenin3의 유전자 전송 (Ngn3), 작은 섬 계보 (Lineage) - 정의 특정 전사 인자와 Betacellulin (Btc)에 의해 유도 작은 섬 neogenesis는 작은 섬 성장 인자는 제 1 형 당뇨병을 치료 할 수있는 가능성이 있습니다. Adenoviral 벡터 (광고) 고효율 유전자 전달 벡터이다;하지만, 초기 세대 광고 생체 사용하는 몇 가지 단점이 있습니다. 도우미에 의존 광고 (HDAds) 광고의 조기 세대의 안전 프로필을 향상시키고 transgene 표현 한을 연장하기 위해 개발 된 가장 진보 된 광고입니다. 그들은 바이러스 코딩 시퀀스에게 2-5 부족하며 광고 CIS 엘을 유지하기 때문에 만성 독성이 부족벡터 복제 및 포장에 필요한 ements. 이 36 이하 유전자까지의 복제를 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 HDAd - Ngn3 및 HDAd-Btc를 생성하고 STZ 유발 당뇨병 마우스에이 벡터를 제공하는 방법을 설명합니다. 우리의 결과는 HDAd-Ngn3, 간에서 HDAd - Btc 유도 &#39;네오 섬&#39;의 공동 주입하고하면 당뇨병 생쥐에서 고혈당증을 반대로 것을 보여줍니다.

우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.

도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

제1형 당뇨병은 췌장 내 인슐린 생성 세포가 T세포 매개 자가면역 파괴로 인해 발생합니다. 지금까지는 인슐린 보충 요법이 여전히...

다음 실험의 전반적인 목표는 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터 매개 유전자 전달을 통해 당뇨 쥐의 간에서 신규 아이렛(neo eyelets)을 유도하는 것입니다. 이는 아이렛 전사 인자인 neuro 유전자와 아이렛 성장 인자인 betalin 유전자를 운반하는 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터를 생성함으로써 이루어지며, 간의 문맥 주변부(periportal)에 신규 아이렛 형성을 유도하기 위해 해당 벡터들을 당뇨 쥐에 주입합니다. 이후 처치된 당뇨 쥐를 대상으로 혈당 및 혈장 인슐린 수치의 정상화 여부와 간 내 인슐린 생성 베타 세포의 존재 여부를 테스트합니다.이러한 분석 결과는 간의 문맥 주변 영역에서 신생 소엽(neo eyelid)이 형성됨에 따라 벡터 처리된 마우스의 고혈당증이 반전되었음을 보여줍니다. herpa 의존성 avir 벡터의 장점은 광범위한 친화성과 높은 만성 수용 능력입니다. 또한, herpa 의존성 아데노바이러스 벡터는 avir 코딩 영역을 포함하지 않습니다.그렇기 때문에 만성 독성이 없습니다. 이 기술의 함의는 당뇨병 치료로까지 확장되는데, 이는 새로운 췌도(islets)의 유도가 공여 부족, 이식편 실패 및 동종 면역 반응으로 인해 제한적인 췌도 이식의 효과적인 대안이 되기 때문입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인들은 벡터 클래스의 크기가 커서 형질전환 과정이 어렵기 때문에 고전할 것입니다.또한 바이러스 오염을 최소화하기 위해 증폭 및 정제 과정은 주의 깊게 처리되어야 합니다. 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터 생산은 최적의 결과를 얻기 위해 반드시 정밀하게 따라야 하는 여러 단계로 이루어져 있습니다. 형질전환 준비를 위해 2개의 6cm 디시에 각각 800,001 16 cells를 분주합니다.37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 2일 후, 세포는 transfection을 위해 70~80%의 합쳐짐(confluency) 상태가 됩니다. transfection 당일에배양액을 5 mL의 신선한 배지로 교체하고, 세포를 3시간 동안 배양합니다. 그 후 Promega Transfect의 pro perfection arm mammalian transfection kit를 사용하여, neuro 유전자를 인코딩하는 DNA 10 µg을 16 cells에 transfection합니다. 여기서 해당 세포는 이하 3 또는 a beta cell, 혹은 BTC로 지칭합니다. 다음 날, 세포를 성장 배지 1 mL로 2회 세척합니다.칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS 0.1 milliliters에 헬퍼 바이러스를 세포당 500 vector particles 농도로 첨가합니다. 그다음 세포를 인큐베이터에 넣고 10분마다 꺼냅니다. 디쉬를 부드럽게 흔들어 헬퍼 바이러스가 고르게 분포되도록 합니다.60분 후, 유지 배지 1.5 milliliters를 추가하고 디쉬를 인큐베이터에 넣어 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 유지 배지 1 milliliter를 추가로 넣습니다. 그 후 표준 광학 현미경을 사용하여 세포를 관찰함으로써 세포병성 효과를 평가합니다.감염된 세포는 둥글게 변하며 떨어져 나옵니다. 감염된 세포를 2일까지 계속 배양하십시오. 이 시점에는 세포의 80% 이상에서 세포병성 효과가 나타나야 합니다.피펫팅으로 조바이러스 용해물을 수집한 다음, 이를 5mL 튜브로 옮깁니다. 여기에 40% sucrose를 부피의 10%만큼 첨가합니다. 이 튜브에 0세대 조바이러스 용해물을 의미하는 CVL이라고 표시합니다.바이러스 입자를 방출시키기 위해, 조바이러스 용해물이 담긴 튜브를 -80°C 냉동고와 37°C 항온수조에 번갈아 배치하여 3회 동결-융해시킵니다. 세 번째 동결-융해 사이클이 끝난 후, 동봉된 텍스트에 설명된 대로 배지를 사용하여 벡터를 추가로 증폭시킵니다. 벡터 증폭 과정을 통해 벡터의 5대 계대(passage five 또는 P5)로부터 조바이러스 용해물을 얻게 됩니다.대규모 헬퍼 의존성 아데노바이러스 생산을 위해, 벡터 증폭 단계에서 얻은 P5 패시지를 이전의 동결-해동 과정과 동일하게 세 번 동결-해동하여 시작합니다. 3L 스피너 플라스크의 세포를 500mL 원추형 병으로 옮기고 1000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액 중 100mL만 남기고 모두 제거합니다.그 다음 세포를 재현탁하여 250 milliliter 스피너 플라스크로 옮깁니다. P5 조 viral lysate를 모두 첨가합니다. 이어서 세포당 200 viral particles의 helper virus를 첨가하고 37 °C에서 60 RPM으로 1시간 동안 배양합니다.배양 후, 세포 현탁액 1mL를 12-웰 플레이트의 웰에 옮깁니다. 나머지 세포 현탁액은 새로운 3L 스피너 플라스크로 옮기고 2L의 현탁 성장 배지를 추가합니다. 플라스크와 플레이트를 모두 이산화탄소 배양기에서 60 RPM으로 2일 동안 배양하며, 향후 2일 동안 플레이트 내 세포의 세포병성 효과를 모니터링합니다.플레이트의 세포에서 세포병성 효과가 나타나면 스피너 플라스크의 세포에서도 세포병성 효과가 나타납니다. 배양 후, 원심분리를 통해 세포를 수집하고 P six라고 표시된 50 milliliter 튜브에 100 millimolar tris. HCL 15 milliliters로 재현탁합니다.정제 전까지 이 튜브를 -80 °C에서 보관하십시오. 벡터를 정제하려면, P6 조 viral lysate가 들어 있는 해동된 튜브에 5% sodium deoxy coate 1 mL를 추가하십시오. 부드럽게 섞은 후 실온에서 30분 동안 배양하십시오.그 다음 염화마그네슘, RNAs A 및 DNAs one을 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 6,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 새로운 50 mL 튜브 또는 멸균된 NVT 65 초원심분리 튜브에 수집합니다. 1.25 g/mL의 저밀도 염화세슘 용액 2.8 mL를 첨가합니다.그 후 2 mL 피펫을 사용하여, 피펫 팁을 튜브 바닥에 접촉시킨 상태에서 1.41 g/mL 고밀도 CsCl 용액 2.8 mL를 천천히 분주하여 하층(underlay)을 형성합니다. 다음으로 2 mL 피펫을 사용하여 상층액 5~6 mL를 상층(overlay)으로 추가합니다. 이때 피펫 팁을 튜브 벽면에 접촉시킨 채로 용액을 천천히 분주하여, 튜브의 목 부분까지 가득 채워야 합니다.그렇지 않으면 고속 원심분리 중에 붕괴될 수 있습니다. 필요한 경우 100 millimolar tris HCL을 사용하여 튜브의 나머지 부분을 채우십시오. 그런 다음 10 °C에서 237, 000 ×g로 30분 동안 원심분리하십시오.밀도 구배 초원심분리 후, 불투명한 세포 잔해 아래에 단일한 유백색 벡터 밴드가 보입니다. 때로는 더 뚜렷한 벡터 밴드 아래에 매우 희미한 헬퍼 밴드가 보일 수 있습니다. 70% ethanol을 사용하여 튜브 하단의 유백색 밴드 부위를 닦아냅니다.그 다음 22 게이지 바늘이 장착된 3 mL 주사기를 사용하여, 벡터 밴드의 하단 부분에서 튜브 벽을 뚫고 하단의 유백색 밴드를 수집합니다. 수집한 벡터 물질을 새로운 멸균 초원심분리 튜브로 옮긴 후, 튜브의 목 부분까지 1.35 g/mL 농도의 염화세슘 밀도 용액을 층이 지게 덮어줍니다.10 °C에서 237,000 ×g로 하룻밤 동안 원심분리하십시오. 두 번째 밀도 구배 초원심분리 후, 이전과 같이 유백색 띠를 수집하십시오. 해당 띠를 투석 카세트에 옮기고, 염화마그네슘과 수크로스가 포함된 3L의 멸균 T tris, HCL에 넣고 4 °C에서 다음 날까지 하룻밤 동안 투석하십시오.다이얼리시스 카세트에서 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터를 제거하려면, 3 mL 주사기를 사용하여 카세트의 상단 모서리에 2 mL의 공기를 주입하십시오. 주사기와 바늘이 하단 모서리에 오도록 카세트를 돌린 후, 카세트를 세운 상태 그대로 용액을 주사기로 흡입하십시오. 정제된 바이러스가 포함된 용액을 라벨이 부착된 냉동 보관 튜브로 옮기십시오.물리적 역가 측정을 위해 20 µL, DNA 특성 분석을 위해 50 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주한 후 냉동합니다. 이 냉동 튜브에는 정제된 바이러스가 -80 °C에서 보관되어 있습니다. 이후 정제된 바이러스의 역가 순도와 in vitro 효능을 평가해야 합니다.동봉된 문서에 설명된 대로, 당뇨병을 유도하기 위해 strept Odin을 사용합니다. 동봉된 문서에 기술된 본 연구에서는 strept zos 및 처리된 마우스의 고혈당 상태를 매주 모니터링하십시오. 혈당 수치가 48시간 동안 250에서 500 milligrams per deciliter 사이로 유지되면, 꼬리 정맥 주사를 위해 마우스를 꼬리 정맥 고정 장치에 넣으십시오.꼬리 정맥을 확장시키기 위해 꼬리를 따뜻한 물이 담긴 50 milliliter 튜브에 넣습니다. 그 다음 70%ethanol을 적신 티슈로 꼬리를 닦아냅니다. 주사기 내에 기포가 없는지 확인하며 30.5 gauge 바늘이 장착된 1 milliliter 주사기에 적정 농도의 벡터 체크 용액을 채웁니다.그다음 엄지와 검지로 주사 부위 아래의 꼬리를 잡고, 바늘을 꼬리 정맥에 삽입합니다. 바늘이 정맥에 제대로 들어갔다면 바늘 허브에서 혈액이 역류하는 것이 보일 수 있습니다. 벡터를 천천히 주입합니다.바늘이 적절하게 배치되었다면, 주입 후 주입 과정에서 저항이 느껴지지 않을 것입니다. 바늘을 제거하고 거즈로 주입 부위를 눌러 지혈한 후 마우스를 케이지로 복귀시킵니다. 벡터 처리 후에는 매주 6시간 공복 혈당과 체중을 측정하고, 2주마다 인슐린 및 간 효소 수치를 모니터링합니다.치료 후 6주 차에 당내성 검사를 수행하여, 치료 후 3주 및 6주 시점에 인비보(in vivo)에서 포도당 자극 인슐린 분비 기능이 회복되었는지 테스트합니다. 당뇨 쥐의 간에 아데노바이러스 벡터 매개 유전자 전달을 통해 췌도 신생(eyelet neogenesis)이 유도될 수 있는지 평가하기 위해, 조직 MNA 분석 및 면역 염색을 위한 쥐의 간과 췌장을 적출합니다. Helper dependent adenovirus 또는 H-D-A-D-N-G-N 3 및 BTC 벡터는 본 영상에 설명된 대로 준비 및 정제되었으며, 이 벡터들은 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨 쥐의 꼬리 정맥 주사를 통해 투여되었습니다.공벡터와 H-D-A-D-B-T-C 벡터 단독 투여군은 음성 대조군으로 사용되었다. 이후 주사 후 7~10일 동안 이틀마다 혈당 수치를 모니터링하였다. HDAD와 GN three 및 H-D-A-D-B-T-C를 모두 주입한 마우스에서는 고혈당 상태가 회복되었으나, 대조군 마우스에서는 회복되지 않았다.여기에서 볼 수 있듯이, 치료 6주 후 포도당 내성 검사를 통해 포도당 자극 인슐린 분비 또한 모니터링하였습니다. 인슐린이 간에서 합성되었는지 평가하기 위해 HDAD와 GN three 및 H-D-A-D-B-T-C를 모두 주입한 마우스에서 인슐린 분비가 회복되었습니다. 간 내 C-peptide 및 인슐린 함량을 분석하였습니다.C-peptide 농도와 총 인슐린 함량은 상용 ELISA 키트를 사용하여 측정하였습니다. 몰 비율로 확인된 C-peptide와 인슐린의 존재는 간에서 검출된 인슐린이 실제로 간에서 합성되었음을 입증합니다. 면역조직화학 염색 결과, HDAD, NGN3 및 H-D-A-D-B-T-C 처리군 쥐의 간에서는 양성 세포가 나타났으나, 대조군 벡터 처리군 쥐에서는 나타나지 않았습니다. 또한 면역 염색을 통해 NGN3 BTC 처리군 쥐의 췌장에 잔존 섬세포(islets)가 없음을 확인하였습니다.간의 면역 염색을 통해 눈꺼풀 특이적 계보 전사 인자 발현을 평가하였습니다. 여기에 나타난 바와 같이, NGN3는 NGN3 BTC 처리된 마우스의 간에서 발현되었으나, 공벡터 처리된 마우스에서는 발현되지 않았습니다.마찬가지로, 여기에서 볼 수 있듯이 empty vector 처리군과 비교하여 NGN3-BTC 처리 쥐의 간에서 BTC가 더 높은 수준으로 발현되었습니다. PDX1 면역 염색 결과, empty vector 처리 쥐의 간에서는 나타나지 않았으나 NGN3-BTC 처리 쥐의 간에서는 핵 국소화가 확인되었습니다. NKX6.1 또한 NGN3-BTC 처리 쥐의 간에서만 검출되었습니다.종합하면, 이러한 결과는 생쥐 간에서 새로운 눈꺼풀 형성이 성공적으로 유도되었음을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 눈꺼풀 형성 유도-계통 결정 유전자를 간으로 전달하여 눈꺼풀 신생을 유도하기 위한 helper-dependent 아데노바이러스 벡터를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 3주 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 헬퍼 바이러스는 연구를 돕는 1세대 avir라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. in vivo 적용을 위해서는 오염을 최소화해야 합니다.

neo-islet-formation-liver-diabetic-mice-helper-dependent-adenoviral

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

이 프로토콜은 하나가 당뇨병 치료를위한 잠재적인 치료 표적을 찾기 위해 기능성 베타 세포 질량을 조절 요소를 식별할 수 있습니다. 프로토콜은 adenoviruses과 유전자 발현의 조작에 따라 분리된 쥐의 islets에 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 간소화된 방법으로 구성되어 있습니다.

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

우리는 섬 항원 특정 기본 CD4 + T 세포의 입양 전송하여 두 주 이내에 생쥐에서 제 1 형 당뇨병 (T1D)를 유도하는 재생 방법을 제공합니다.

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

마우스에 독도의 omental 이식 하는 방법을 소개 합니다. 격리 된 독도 히드로와 혼합 하 고 혼합 당뇨 마우스의 omental 주머니에 배치 됩니다. 그리고, 혈액 포도 당 감시 면역 조직화 학적인 분석을 수행 합니다.

마우스에 Omentum 작은 섬 이식 하는 방법

여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 운반하는 렌티바이러스에 의해 형화되는 분산된 인간 섬 세포로부터 유전자 변형된 인간 의사구성을 생성하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 쉽게 사용할 수있는 효소 및 배양 혈관을 활용하고, 쉽게 수행 할 수 있으며, 기능 및 형태 학적 연구에 적합한 유전자 변형 인간 의사 를 생산합니다.

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

이 프로토콜은 자발적 당뇨병 NOD 마우스에서 정제된 비장 세포로 도전받은 비만 당뇨병(NOD) 중증 복합 면역 결핍 마우스에서 NIT-1 세포를 이식하고 이미징하기 위한 간단하고 최소 침습적인 방법을 설명합니다.

생쥐에서 자가면역 당뇨병의 입양 이식 모델에서 이식편 생존의 생물발광 모니터링

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

배우세요 당뇨 쥐의 간에서 도우미에 의존 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 전송으로 네오-작은섬을 형성하는 방법입니다. 이 기법은 고혈당을 역전시키고 인슐린 생성 세포를 유도하여 당뇨병 치료에 활용됩니다.

도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

더 많은 동영상 탐색