기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

이 절차의 전반적인 목표는 후속 기능 및 분자 분석을 위해 순수하고 실행 가능한 1차 뉴런 유형 2 폐포 상피 세포를 분리하는 것입니다. 먼저, 희생된 쥐의 폐와 기관에 DYS 디스플레이 용액을 주입한 다음 아가로스를 주입합니다. 그런 다음 dispa가 폐를 소화하도록 허용한 후 폐를 제거합니다.

조직은 수동으로 분해됩니다. 결과 현탁액은 기공 크기가 감소하는 일련의 메쉬를 통해 필터링됩니다. 그런 다음 염색된 2형 폐포 상피 세포를 유세포 분석 음성 선택에 의해 분리합니다.

궁극적으로, 분리된 제2형 폐포 상피 세포는 호흡기 감염 및 파리 자가면역 질환에서 자신의 역할을 연구하기 위해 기능 및 분자 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 특히 자가면역 매개 폐 질환 및 바이러스 감염의 맥락에서 폐 면역 관계 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 장기 및 세포 현탁액 제제를 배우기가 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

이 프로토콜의 전반적인 성공 여부는 다음 단계 중 몇 가지 중요한 세부 사항에 따라 달라집니다: 실험에 참여한 각 마우스에 대해 섭씨 37도의 수조에서 1%low의 작은 분취량에서 4ml의 DYS 베이가 들어 있는 15ml 튜브를 예열합니다. Mel Aros는 액화될 때까지 섭씨 95도의 가열 블록에서 물에 넣습니다. 그런 다음 섭씨 45도까지 부르고 다음에 사용할 때까지 이 온도로 유지하십시오.

쥐 폐를 준비하기 위해 CO2 질식으로 희생된 쥐를 스프레이합니다. 에탄올과 함께. 몸의 복부 정중선을 따라 길게 자릅니다.

그런 다음 복부 먼 피부를 당기고 조심스럽게 복막을 자르고 제거합니다. 마우스를 출혈시킨 후 조심스럽게 조리개를 뚫고 제거한 다음 갈비뼈를 잘라냅니다. 심장과 폐를 노출시키려면 26게이지 캐뉼라와 냉기로 채워진 10ml 주사기로 폐를 다치게 하지 않도록 각별히 주의하십시오.

PBS는 심장의 우심실에 구멍을 뚫고 폐에 피가 없어질 때까지 PBS를 관류합니다. 기관을 노출시키기 위해 침샘을 자르고 제거합니다. 또한 기관을 둘러싼 근육을 조심스럽게 자른다.

다음으로, 22게이지 내주 캐뉼라를 기관에 삽입합니다. 바늘을 제거하고 플라스틱 카테터를 폐 쪽으로 밉니다. 기관과 카테터 주위에 작은 실 조각을 묶어 카테터를 제자리에 고정합니다.

원하는 경우 PBS 또는 배지로 기관에 삽입된 카테터를 사용하여 폐를 세척하여 기관지 폐포 세척액 샘플을 준비합니다. 추가 분석이 있을 때까지 세척액을 얼음에 보관하십시오. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 소화와 조직 분해입니다.

이 프로토콜의 성공을 보장하려면 모든 폐엽과 조직 소화 후에 완전한 원반이 채워지도록 주의해야 합니다. 2 밀리리터 주사기를 사용하여 조심스럽게 조직을 분해해야하며, 모든 엽이 완전히 확장되도록 카테터를 통해 폐로 미리 준비한 최대 2 밀리리터의 디스파를 분해해야합니다. 주사기를 0.5 밀리리터의 액화 아로스가 들어있는 1 밀리리터 주사기로 교환하고 내용물을 폐에 주입하십시오.

주사기를 카테터에 올려 놓고 아로스의 역류를 방지하고 즉시 실험실 티슈, 종이 및 얼음으로 폐를 덮습니다. 에어로 젤을 몇 분 동안 그대로 두십시오. 티슈 페이퍼, 얼음 주사기, 카테터를 제거합니다.

그런 다음 기관을 잘라내고 가슴에서 폐, 심장 및 흉선을 절제합니다. 준비된 장기를 PBS로 접시에 헹굽니다. 그런 다음 폐에서 심장, 흉선, 남은 기관을 잘라내어 버립니다.

나머지 2ml의 디스플레이가 들어 있는 튜브에 폐를 넣고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 염색 절차 전에 식세포 세포의 FC 수용체를 효율적으로 차단하기 위해 배양을 변경합니다. 디스플레이에서 폐를 밀리리터당 1마이크로그램 7밀리리터, 항 CD 1632 항체 및 DMEM의 DNA 100마이크로리터가 들어 있는 접시로 옮기고, 두 쌍의 집게를 사용하여 폐 조직을 분리하여 폐 조직을 완전히 분해합니다.

그런 다음 원하는 경우 200RPM으로 설정된 로커에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 현탁액은 다음 단계까지 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 일련의 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 피펫팅합니다.

먼저 50밀리리터 튜브 위에 놓인 100미크론 필터를 통해 현탁액을 붓습니다. 샘플을 풀링하는 경우, 동일한 그룹의 마우스에서 세포 현탁액을 동일한 필터를 통과시킵니다. 필터가 막히면 새 것으로 교체하십시오.

70미크론 메쉬 필터로 이 과정을 반복합니다. 세포 손실을 최소화하고 수율을 최대화하기 위해 DMEM으로 각 메쉬와 튜브 및 접시를 철저히 헹굽니다. 그런 다음 다음과 같이 48미크론 메쉬 필터 스팬을 통해 서스펜션을 플라스틱 또는 유리 링으로 당깁니다.

페트리 접시에 흐름을 모으십시오. 그런 다음 30미크론 메쉬로 이 프로세스를 반복합니다. 부피에 따라 여과액을 하나 이상의 50밀리리터, 튜브 및 원심분리기로 15분 동안 섭씨 4도에서 160배 G로 옮깁니다.

스핀 후, supinate를 제거하고 세포 펠릿을 2ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 13 밀리리터의 DMEM 배지를 첨가하여 용해를 신속하게 종료합니다. 용액을 15ml 튜브에 옮기고 G 160배와 섭씨 4도에서 12분 동안 원심분리기합니다.

리스는 CD 11 C, CD 11 BF 4개, 80 CD 19, CD 1632 및 CD 45에 대한 항체를 포함하는 1차 항체 칵테일의 3밀리리터에 있는 세포였다. 배양 후 섭씨 4도의 어두운 곳에서 또는 얼음 위에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 튜브에 DMEM을 채우고 12분 동안 G의 160배와 섭씨 4도에서 원심분리기를 사용하여 세포를 세척합니다.

1ml의 DMEM에 세포를 다시 현탁시키고 세포 분류를 위해 50미크론 필터를 통해 튜브로 사전 필터링합니다. 폐 현탁액의 총 세포 수를 얻기 위해 세포를 세십시오. 소싱 직전에 EC2의 셀 소싱을 위해 100 마이크로 노즐을 사용하십시오.

와류 sheath에 의해 세포 현탁액을 혼합합니다. 유체 압력과 레이저 반사 및 검출 파장은 유세포 분석 세포 분류에 사용되는 기기와 항체 염색 절차에 사용되는 형광 색소에 따라 다릅니다. 먼저, 측면 산란 영역 대 형광 플롯을 생성하고 염색에 사용되는 형광 색소에 대해 음성인 모든 측면 산란 영역 High cells에 대한 게이트를 만듭니다.

다음으로, 측면 산란 영역 대 전방 산란 영역, 전방 산란 영역 대 전방 산란 영역, 측면 산란 높이 대 측면 산란 영역 플롯을 생성하고 DMEM을 포함하는 튜브로 유입되는 이중선 또는 세포 응집체 소스를 제외하기 위한 게이트를 생성합니다. 건강한 마우스에서 분리된 폐 세포 현탁액을 소싱할 때 EC2 게이트는 일반적으로 모든 이벤트의 약 42 플러스 마이너스 10%를 차지합니다. 분류된 세포를 수집하기 위해 G 280회, 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다.

후속 분석을 위해 필요에 따라 2형 폐포 상피 세포 또는 EC2를 배양액, 배지 또는 완충액에 재현탁합니다. 1차 쥐 2형 폐포 상피 세포는 이 비디오에 설명된 대로 유세포 측정 음성 선택에 의해 분리되었으며, 분류된 세포의 분석이 여기에 설명되어 있습니다. 표시된 대로.

분리된 세포의 순도는 대략 92 더하기 5%를 뺀 값이며, 계면활성제 단백질에 대해 정렬된 A EC2의 Ciis 스핀이 염색되었고, CA 위상차 이미지가 왼쪽에 표시되고, 면역 형광이 오른쪽에 표시되었습니다. 거의 100%의 세포가 계면활성제 단백질 C 양성으로 밝혀져 순수한 집단의 성공적인 분리를 확인했습니다. 생체 내 인플루엔자 A 바이러스 감염의 영향을 평가하기 위해, A EC2를 C 57 BL 6 마우스에서 분리하여 인산염 완충 식염수 또는 인플루엔자 A 바이러스 PR 8 A 34를 1일, 2일 또는 3일 전에 비강 내

이 플롯은 감염되지 않은 폐 세포와 감염된 폐에 면역 세포가 동원되어 분류를 위해 염색된 3일 감염된 C 57 흑인 6명의 남성으로 인한 폐 세포 현탁액을 보여줍니다. 산란 영역이 높은 세포를 가진 형광 음성 측의 비율은 감염되지 않은 마우스에 비해 감염된 3일로부터 제조된 세포 현탁액 내에서 상당히 감소합니다. Influenza, A virus 핵 단백질 발현을 C2로 분류하여 핵 단백질 특이적 항체를 이용한 세포내 염색을 통해 분석하였다.

히스토그램은 생체 내 감염된 마우스에서 분리된 C 2가 인플루엔자 A 바이러스, 핵 단백질에 대한 세포 내 염색 후 특정 형광 신호를 생성한다는 것을 보여줍니다. 이 표는 핵 단백질의 평균 형광 강도를 보여주며, 인플루엔자에서 분리된 EC2의 세포 내 핵 단백질 염색에 의해 생성된 신호의 강도를 염색합니다. 바이러스에 감염된 마우스는 건강한 마우스에서 분리된 EC2의 생존력을 입증하고 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 감수성을 테스트하기 위해 바이러스 감염 기간이 증가함에 따라 증가합니다.

플루엔자, 바이러스 핵 단백질 발현도 본 명세서에 나타난 바와 같이 X vivo에 감염된 분리된 세포에서 분석하였다. EC2의 상당 부분이 감염 후 6시간 후에 바이러스 핵 단백질을 발현합니다. 이러한 데이터는 여기에 요약되어 있습니다.

바이러스 핵 단백질의 세포 내 염색에 대한 EC2 양성의 비율은 생체 외 감염 실험에 사용된 바이러스 선량에 따라 다릅니다. 이러한 결과는 분리된 1차 뉴런인 EC2가 생존 가능하고 바이러스 감염 및 복제에 취약하다는 것을 보여주며, 이는 본 바이러스 단백질의 발현으로 평가됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 조직 소화 및 분해 단계를 신중하게 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다.

또한, 형광 음성 및 측면 s 게터 영역 높은 세포에서 엄격하게 보행하는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 분류할 때: 이 절차에 따라 분자 및 기능 연구와 같은 다른 방법을 형성하여 바이러스 감염 및 자가면역 매개 폐 질환의 맥락에서 폐의 3분의 1인 2형의 역할을 배제할 수 있습니다.