기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연
2012년 12월 26일
우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.
이 프로시저의 전반적인 목적은 후속 기능 및 분자 분석을 위해 순수하고 생존 가능한 일차 신경 유형 2 폐포 상피 세포를 분리하는 것입니다. 먼저, 희생된 마우스의 폐와 기관에 DYS display 용액을 주입한 후 아가로스를 주입합니다. 그 다음, dispase가 폐를 소화하도록 둔 후 폐를 제거합니다.
조직을 수동으로 분쇄합니다. 생성된 현탁액을 공극 크기가 점차 작아지는 일련의 메쉬로 필터링합니다. 그 후, 유세포 분석법을 이용한 음성 선택(negative selection)을 통해 염색세포와 2형 폐포 상피세포를 분리합니다.
결과적으로, 분리된 2형 폐포 상피세포는 호흡기 감염 및 관련 자가면역 질환에서의 역할을 연구하기 위한 기능적 및 분자적 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 특히 자가면역 매개 폐 질환 및 바이러스 감염의 맥락에서 폐 면역 관계 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 장기 및 세포 현탁액 준비 과정은 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.
본 프로토콜의 전반적인 성공 여부는 해당 단계들의 몇 가지 중요한 세부 사항에 달려 있습니다. 실험에 사용되는 각 마우스에 대해, 4 mL의 DYS buffer가 담긴 15 mL 튜브를 37 °C 항온수조에서 미리 가온하십시오. 물에 희석한 1% low-melting agarose의 소량 분주액을 95 °C 가열 블록에 넣고 액상화될 때까지 가열하십시오. 그 후 45 °C로 식힌 다음, 다음 단계에서 사용할 때까지 이 온도를 유지하십시오.
CO2 질식법으로 희생시킨 마우스의 폐를 준비합니다. 에탄올을 사용하여 몸의 복측 정중선을 따라 길게 절개합니다.
그 다음 복측의 먼 피부를 당기고 복막을 조심스럽게 절개하여 제거합니다. 마우스의 혈액을 모두 제거한 후, 횡격막을 조심스럽게 천자하여 제거하고 갈비뼈를 잘라냅니다. 심장과 폐를 노출시키기 위해, 차가운 액체가 채워진 10 milliliter 주사기와 26 gauge 캐뉼라를 사용하되 폐가 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오.
PBS를 이용하여 심장의 우심실을 천자하고, 폐에 혈액이 남지 않을 때까지 PBS로 관류합니다. 타액선을 절단 및 제거하여 기관을 노출시킵니다. 또한, 기관 주변의 근육을 조심스럽게 절개합니다.
다음으로, 22 gauge 유치 캐뉼라를 기관에 삽입합니다. 바늘을 제거하고 플라스틱 카테터를 폐 쪽으로 밀어 넣습니다. 기관과 카테터 주변에 작은 실 조각을 묶어 카테터를 고정합니다.
필요한 경우, 기관에 삽입된 카테터를 사용하여 PBS 또는 배지로 폐를 세척하여 기관지폐포 세척액 샘플을 준비하십시오. 세척액은 추가 분석 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 이 절차에서 가장 어려운 단일 단계는 소화 및 조직 분해 과정입니다.
본 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 조직 소화 후 모든 폐엽에 Dispa가 완전히 채워지도록 주의해야 합니다. 2 mL 주사기를 사용하여 앞서 준비한 Dispa를 최대 2 mL까지 카테터를 통해 폐로 조심스럽게 주입하여 모든 폐엽이 완전히 팽창하도록 조직을 분해하십시오. 주사기를 0.5 mL의 액상 Aros가 들어 있는 1 mL 주사기로 교체한 후, 그 내용을 폐에 주입하십시오.
에어로졸의 역류를 방지하기 위해 카테터에 주사기를 그대로 두고, 즉시 실험용 티슈, 종이 및 얼음으로 폐를 덮어줍니다. 에어로졸 겔 상태로 몇 분간 둡니다. 티슈, 종이, 얼음, 주사기 및 카테터를 제거합니다.
그런 다음 기관을 절단하고 흉강에서 폐, 심장 및 흉선을 적출합니다. 준비된 장기들을 접시에 담아 PBS로 헹굽니다. 이어서 폐에서 심장, 흉선 및 남은 기관 부분을 절단하여 제거합니다.
폐를 남은 2 mL의 display 용액이 들어 있는 튜브에 넣고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 염색 절차 전에 식세포의 FC 수용체를 효율적으로 차단하기 위해 배양 조건을 조정하십시오. 폐를 display 용액에서 1 µg/mL의 anti CD 1632 항체와 100 µL의 DNAs가 포함된 DMEM 7 mL가 들어 있는 접시로 옮기고, 두 개의 핀셋을 사용하여 폐 조직을 잡아당겨 완전히 해체합니다.
그 다음, 원할 경우 200 RPM으로 설정된 로커 위에서 실온 상태로 10분 동안 배양합니다. 세포 현탁액은 다음 단계까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 일련의 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 피펫팅합니다.
먼저, 50 mL 튜브 위에 놓인 100 µm 필터를 통해 현탁액을 붓습니다. 샘플을 풀링(pooling)하는 경우, 동일한 그룹의 마우스에서 얻은 세포 현탁액을 동일한 필터로 통과시킵니다. 필터가 막히면 새 필터로 교체합니다.
70 µm 메쉬 필터를 사용하여 이 과정을 반복합니다. 세포 손실을 최소화하고 회수율을 극대화하기 위해 각 메쉬뿐만 아니라 튜브와 디쉬를 DMEM으로 충분히 헹궈내십시오. 다음으로, 여기에서 보여주는 것처럼 플라스틱 또는 유리 링 위에 48 µm 메쉬 필터를 펼쳐 현탁액을 통과시킵니다.
통과액을 페트리 접시에 수집하십시오. 그다음 30 micron 메시를 사용하여 이 과정을 반복하십시오. 부피에 따라 여과액을 하나 이상의 50 milliliters 튜브에 옮기고 4 °C에서 160 ×g로 15분 동안 원심 분리하십시오.
원심분리 후, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 2mL의 적혈구 용혈 버퍼에 재현탁합니다. 그런 다음 13mL의 DMEM 배지를 첨가하여 빠르게 용혈을 중단시킵니다. 용액을 15mL 튜브로 옮기고 4°C에서 160×g로 12분 동안 원심분리합니다.
CD 11 C, CD 11 BF four 80 CD 19, CD 1632 및 CD 45에 대한 항체를 포함하는 3 mL의 1차 항체 칵테일로 세포를 반응시켰습니다. 4 °C의 암소 또는 얼음 위에서 세포를 10분 동안 배양하십시오. 배양 후, 튜브를 DMEM으로 채워 세포를 세척하고 4 °C에서 160 ×g로 12분 동안 원심분리하십시오.
세포를 1 mL의 DMEM에 다시 현탁하고, 50 micron 필터로 미리 여과하여 세포 분류용 튜브에 담습니다. 세포 수를 측정하여 폐 현탁액 내의 총 세포 수를 구합니다. 세포 분류 직전에 EC2의 세포 분류를 위해 100 micro 노즐을 사용하십시오.
보텍스 믹서를 사용하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 유체 압력과 레이저 방출 및 검출 파장은 유세포 분석 세포 분류에 사용되는 기기와 항체 염색 절차에 사용된 형광 색소에 따라 달라집니다. 먼저, 측방 산란 영역(sideward scatter area) 대 형광 도표를 생성하고, 염색에 사용된 형광 색소에 대해 음성인 모든 측방 산란 영역 High 세포를 게이팅합니다.
다음으로, side scatter area 대 forward scatter area, forward scatter height 대 forward scatter area, 그리고 side scatter height 대 side scatter area 플롯을 생성하고, 더블릿(doublet)이나 세포 응집체를 제외하기 위해 게이팅하여 DMEM이 담긴 튜브로 분리합니다. 건강한 생쥐로부터 분리한 폐 세포 현탁액을 사용할 때, EC2 게이트는 일반적으로 전체 이벤트의 약 42 ± 10%를 차지합니다. 분리된 세포를 수집하려면 280 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다.
이후 분석에 필요한 배양액 또는 완충액에 type two alveolar epithelial cells 또는 EC2를 재현탁합니다. 일차 마우스 type two alveolar epithelial cells는 본 비디오에서 설명한 대로 유세포 분석 음성 선택법으로 분리되었으며, 정렬된 세포의 분석 내용이 여기에 묘사되어 있습니다. 표시된 바와 같습니다.
분리된 세포의 순도는 약 92 ± 5%입니다. 분리된 A EC2를 계면활성제 단백질 C로 염색하였으며, 왼쪽에는 위상차 이미지, 오른쪽에는 면역형광 이미지가 나타나 있습니다. 거의 100%의 세포가 계면활성제 단백질 C 양성으로 확인되어, 순수한 세포 집단이 성공적으로 분리되었음을 입증하였습니다. 생체 내 인플루엔자 A 바이러스 감염의 영향을 평가하기 위해, 1, 2 또는 3일 전에 인플루엔자 A 바이러스 PR8 A/34 또는 인산 완충 식염수를 비강 내 투여한 C57BL/6 마우스로부터 A EC2를 분리하였습니다.
이 도표들은 감염되지 않은 C 57 black six 수컷과 감염 3일 차 수컷의 폐 세포 현탁액을 보여주며, 감염된 폐로 면역 세포가 모집됨에 따라 분리를 위해 염색되었습니다. 감염되지 않은 마우스와 비교하여 감염 3일 차 마우스에서 준비된 세포 현탁액 내의 형광 음성 side scatter area high 세포의 비율이 상당히 감소했습니다. Influenza A virus nuclear protein 발현으로 분리한 C 2는 nuclear protein 특이적 항체를 이용한 세포 내 염색을 통해 분석되었습니다.
히스토그램은 in vivo 감염 마우스에서 분리된 EC2가 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오단백질(nucleo protein)의 세포 내 염색 후 특이적 형광 신호를 나타냄을 보여줍니다. 표는 인플루엔자 A 바이러스 감염 마우스에서 분리된 EC2의 뉴클레오단백질 염색 평균 형광 강도를 나타내며, 세포 내 뉴클레오단백질 염색으로 생성된 신호 강도는 바이러스 감염 기간에 따라 증가합니다. 이는 건강한 마우스에서 분리된 EC2의 생존 능력을 입증하고 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 민감성을 테스트하기 위한 것입니다.
여기에 표시된 것처럼, ex vivo로 감염된 분리 세포에서 인플루엔자 바이러스 핵단백질의 발현 또한 분석되었습니다. EC2의 상당 부분이 감염 6시간 후에 바이러스 핵단백질을 발현합니다. 이러한 데이터가 여기에 요약되어 있습니다.
바이러스 핵 단백질의 세포 내 염색에 대해 EC2 양성을 보이는 비율은 ex vivo 감염 실험에 사용된 바이러스 용량에 따라 달라집니다. 이러한 결과는 분리된 일차 뉴런인 EC2가 생존 가능하며, 관찰된 바이러스 단백질 발현으로 평가했을 때 바이러스 감염 및 복제에 민감하다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 조직 소화 및 붕괴 단계를 세심하게 진행하는 것이 매우 중요합니다.
또한, 형광 음성 및 측면 산란(side scatter) 영역의 고세포군에 대해 엄격하게 게이팅(gaiting)하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 분류를 수행한 후, 분자 및 기능 연구와 같은 다른 방법들을 통해 바이러스 감염 및 자가면역 매개 폐 질환의 맥락에서 폐의 제2형 및 제3형 폐포 세포의 역할을 배제할 수 있습니다.
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개요
이 문서는 흐름 세포계 음성 선택을 사용하여 1차 마우스 2형 폐포 상피 세포(AECII)를 신속하게 분리하는 방법을 설명합니다. 분리된 AECII는 높은 생존율과 순도를 나타내어 호흡기 질환과 관련된 다양한 기능 및 분자 연구에 적합합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 호흡기 생리학
- 면역학
배경
- 2형 폐포 상피 세포는 폐 기능과 항상성에서 중요한 역할을 합니다.
- 이들의 기능을 이해하는 것은 호흡기 질환을 연구하는 데 중요합니다.
- 현재 이들 세포를 분리하는 방법은 시간이 많이 소요되고 비효율적일 수 있습니다.
- 본 연구는 분리 효율성을 향상시키는 간소화된 접근 방식을 제시합니다.
연구 목적
- 순수하고 생존 가능한 1차 2형 폐포 상피 세포를 분리합니다.
- 후속 기능 및 분자 분석을 용이하게 합니다.
- 호흡기 질환에서 AECII에 대한 이해를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 희생된 마우스의 폐와 기관 내 DYS 디스플레이 및 아가로스를 주입합니다.
- 소화 후 폐 조직을 수동으로 분해합니다.
- 점점 작아지는 구멍 크기의 메쉬를 통해 생성된 현탁액을 여과합니다.
- 흐름 세포계 음성 선택을 통해 AECII를 분리합니다.
주요 결과
- 이 방법은 분리된 AECII의 높은 생존율과 순도를 제공합니다.
- 분리된 세포는 기능 및 분자 연구에 적합합니다.
- 이 절차는 효율적이고 재현 가능합니다.
- 자가면역 및 감염성 호흡기 질환 연구에 잠재적 적용이 있습니다.
결론
- 이 분리 방법은 2형 폐포 상피 세포 연구를 향상시킵니다.
- 고품질의 AECII는 호흡기 질환에 대한 더 나은 통찰력을 제공할 수 있습니다.
- 이 접근 방식은 향후 연구에서 다른 세포 유형에도 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) enables mechanistic de-risking in respiratory disease target validation by providing a disease-relevant system that reflects in vivo complexity. This approach supports predictive confidence in early discovery by yielding highly viable, pure AECII suitable for functional and molecular assays, reducing reliance on immortalized cell lines. The method facilitates translational continuity from discovery through preclinical evaluation of immune-mediated lung pathologies and viral infection models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a primary cell context that retains native lung microenvironmental influences.
- Operational Value: Provides a reproducible source of untouched AECII for pathway clarification and functional target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing assessment of compound effects on AECII-mediated immune regulation in infection and autoimmunity models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, highly pure AECII suspensions suitable for downstream functional assays including T-cell stimulation and cytokine profiling.
- Quantitative Output: Enables measurement of dependent variables such as surfactant protein C expression and intracellular viral nucleoprotein levels as biomarkers of cellular state and infection susceptibility.
- Scalability: Compatible with flow cytometry platforms allowing multiplexed sample processing and cross-group comparison in preclinical studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Permits isolation of AECII from mice subjected to respiratory challenges such as influenza infection, enabling study of cell-intrinsic responses under pathophysiological conditions.
- Translational Biomarker Alignment: Facilitates correlation of functional readouts with molecular signatures (e.g., viral protein expression) relevant to human respiratory disease mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing data on AECII viability and susceptibility to viral replication, informing mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary AECII for hypothesis testing in early biology, enabling assay development for screening campaigns, and generating quantitative functional and molecular readouts that inform translational research decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in lung immunology by providing access to primary AECII from naïve and challenged mice.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions enabling reproducible compound evaluation in functional assays such as cytokine secretion and immune cell interaction assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements including sideward scatter high gating, fluorescence intensity of viral nucleoprotein, and surfactant protein C positivity for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through ex vivo and in vivo infection models that model human respiratory pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow applicable across multiple respiratory disease models, reducing redundant optimization efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity through use of primary cells reflecting native lung biology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via flow cytometric negative selection, minimizing variability introduced by enzymatic depletion or magnetic bead methods.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of lack of efficacy in AECII-mediated pathways, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by generating data on AECII function in infection and autoimmunity, supporting indication selection and biomarker strategy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue handling, enzymatic lung digestion, and flow cytometric cell sorting instrumentation.
- Dependent on access to flow cytometer with appropriate laser and detection capabilities for sideward scatter and fluorescence discrimination.
- Necessitates standardization of antibody cocktails and gating strategies across sites to ensure reproducibility of AECII isolation.
- Involves optimization of tissue disintegration steps to maximize yield while preserving cell viability and surface marker integrity.
- Limited by the accessibility of AECII in diseased lungs, where immune cell infiltration may alter SSChigh gate frequency and require adaptive gating.
