Name: 기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 배우세요 손쥐 폐포 상피 세포 II형을 유동세포측정 음성선별로 분리하는 방법을. 높은 생존율과 순도의 세포로 호흡기 질환의 기능 및 분자 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 바이오 안전성 수준이 샘플에서 기본 손쥐 AECII를 정렬에 기술 지원을위한 M. Höxter 감사드립니다. 이 작업은 DB에 독일 연구 재단 (DFG) (SFB587, TP B12 및 BR2221/1-1)와 하노버 바이오 메디컬 연구 학교 (DFG GSC 108)에서 AA에이고의 보조금에 의해 지원되었다. DB는 대통령의 이니셔티브 및 계약 번호 W2/W3-029에 따라 독일어 연구 센터의 Helmholtz 협회 (HGF)의 네트워킹 기금에서 지원됩니다.

필요한 시약 및 재료에 관한 자세한 내용은 아래의 프로토콜의 끝 부분에 다음 표에 나열되어 있습니다. 작업을 시작하기 전에, 4 dispase의 ML과 ° C 물 목욕에 37 미리 따뜻하게을 포함하는 15 ML 튜브를 (마우스 하나씩)을 준비합니다. 가열 블록에서 곧 95-1% 낮은 용해 아가로 오스 (물)의 작은 aliquots를 가열 ° C 액화 때까지 사용 할 때까지 45 ° C에이어서 좋아. 1. 마우스 폐의 작성 <ol><li> CO 2 질식하여 마우스를 희생. 참고 : 성공적으로 수행 될 수 없습니다와 같은 액체와 폐의 설치로, 프로토콜의 단계를 수행하므로이 기관을 손상하므로 자궁 경부 전위를 수행하지 마십시오. nociceptive 반사 손실을 보장합니다. </li><li> 에탄올로 마우스를 뿌려서 몸의 복부 중간 선을 따라 긴 몫을합니다. 복부 털과 피부를 당겨하고 이후도 조심스럽게 잘라 복막을 제거합니다. </li><li> 을 ...에게서 피를 뽑다왼쪽과 오른쪽 경정맥 정맥 (베나 jugularis)뿐만 아니라 신장 동맥 (Arteria renalis)를 절단하여 마우스. 조직과 흐르는 혈액을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 다음 찔린하고 늑골을 멀리 절단하여 마음과 폐를 노출 할 수있는 피임기구를 제거합니다. 폐를 손상하지 특별히 조심하고. </li><li> 추위 인산로 가득 26G 캐뉼라와 10 ML의 주사기로 생리 (PBS), 찔린 심장의 우심실은 버퍼와 혈액의 무료까지 PBS로 폐를 perfuse. </li><li> 기관을 폭로 할 수있는 침샘을 잘라 제거합니다. 또한주의 깊게 호흡 관을 둘러싼 근육을 잘라. </li><li> 기관에 22G 내주하시는의 캐뉼라를 삽입하고, 바늘을 제거하고 폐에 대한 플라스틱 카테터를 밀어. 기관 및 카테터 주변 원사의 작은 조각을 매는하여 카테터를 해결했습니다. </li></ol> 2. 폐 조직의 효소 소화 원하는 경우, bronchoalveolar 세척 유체 샘플 수다음 단계 전에 PBS 또는 매체 기관에 삽입 된 카테터를 통해 폐를 플러싱으로 준비했습니다. <ol><li> 2 ML의 주사기를 사용하여주의 깊게 모든 엽이 완전히 확장되도록 카테터를 통해 폐에 dispase 2 ML (4 ML의 나누어지는에서)의 최대 볼륨을 심어. 액화 아가로 오스의 0.5 ML를 포함하는 1 ML의 주사기와 주사기를 교환하고 또한 폐에 심어. </li><li> 아가로 오스의 다시 흐름을 방지하고 즉시 실험실 티슈과 얼음으로 폐를 커버 할 수있는 카테 테르에 주사기를 둡니다. 몇 분의 아가로 오스 젤을 보자. </li><li> , 휴지, 얼음, 주사기와 카테터를 제거 기관 및 소비세 폐, 심장과 가슴에서 thymus을 잘라. 그런 다음 PBS와 접시에 폐를 씻어 심장, thymus와 나머지 기관을 제거합니다. </li><li> dispase의 나머지 두 ML에 폐를 넣고 45 분 동안 실온에서 알을 품다. </li></ol> 3. 폐의 작성세포 현탁액 <ol><li> dispase에서 폐를 제거하고 DMEM 매체 100 μl DNase에 anti-CD16/32 항체의 7 ML (1 μg / ML 최종 농도)를 포함하는 요리로 전송. </li><li> 집게를 사용하여 완전히 떨어져 당겨 폐 조직을 분해하고 부드럽게 200 RPM으로 설정 로커에 흔들 동안 실온에서 10 분에 품다. 원하는 경우, 세포 현탁액은 다음 단계까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 100 μm와 이후 70 μm, 48 μm 및 30 μm 구멍이있는 첫번째 나일론 meshes를 통해 세포 현탁액을 필터링 할 수 있습니다. 세포의 손실을 최소화하고 수익을 극대화 할뿐만 아니라 DMEM으로 튜브 철저히 요리 각 메쉬를 씻어하는데주의를 기울여야. 당신이 샘플을 풀링하는 경우, 이것은 이후 같은 필터를 통해 한 그룹의 쥐에서 세포 현탁액을 통과하여 여기에 달성 될 수있다. 막힘의 경우 필터를 갱신. </li><li> 볼륨에 따라 하나 이상의 50 ML 튜브로 여과를 전송하고160 XG에서 15 분, 4 ° C.에 대해 원심 분리기 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 2 ML 적혈구 용해 완충액 (0.15 M NH 4 망할 CIA, 0.01 M KHCO 3, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.2)에 세포 펠렛을 Resuspend 빠르게 DMEM 매체 13 ML의 추가에 의해 용해을 해지 할 수 있습니다. 160 XG에서 12 분, 4 ° C.에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송 </li></ol> 4. 흐름 Cytometric 셀 정렬에 대한 항체 염색법 <ol><li> 유동 세포 계측법에 적합한 dilutions에 DMEM 매체에 준비 3 ML 기본 항체 칵테일에 세포를 Resuspend. (항체는 이전에 100 μl의 볼륨에 1 개 10 6 splenocytes 얼룩으로 최적의 작업 dilutions을 위해 titrated되었습니다. 사용 다섯 마우스까지에서 풀링 된 세포에 대한 사용 항체 각각에 대한 최적의 농도를 포함하는 차 항체 칵테일 3 ML. 더 많은 생쥐가 하나 샘플로 풀링하는 경우)의 볼륨을 조정합니다. </li><li> 착색를 들어, 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 배양4 번 ° C. </li><li> 12 160 XG에서 분, 4 DMEM 매체와 원심 분리와 함께 15 ML 튜브를 작성하여 세포를 씻으 ° C. </li><li> 경우 uncoupled 또는 biotinylated 항체는 4.1에 사용되었습니다 표면에 뜨는을 제거하고 2 세포를 resuspend - 3 ML 보조 항체 칵테일. 어둠 속에서 4에 10 분 ° C에 청바지. </li><li> 160 XG에서 12 분, 4 ° C.에 DMEM과 원심 분리로 관을 작성을 통해 세포를 씻으십시오 </li><li> 셀 - 정렬의 튜브에 필터 50 μm을 통해 DMEM 및 사전 필터의 1 ML에있는 세포를 Resuspend. 선택 사항 : 폐 세포 현탁액의 전체 전화 번호를 얻기 위해 셀을 계산합니다. </li></ol> 5. 셀 - 정렬 <ol><li> 정렬하기 전에 vortexing하여 세포를 섞는다. AECII의 세포 분류에 100 μm의 노즐을 사용합니다. 칼집 유체 압력뿐만 아니라 레이저 방출 및 검출 파장은 흐름 cytometric 셀 정렬뿐만 아니라 antib에 사용 된 fluorochromes에 사용되는 악기에 따라 달라집니다ody 착색 절차. </li><li> DMEM을 포함하는 관으로 착색 및 정렬에 사용되는 fluorochromes에 대한 부정적인있는 SSC 높은 세포에서 게이트. (SSC-A) 창 (에 게이팅 전략의 세부 정보를 확인하는 doublets 또는 셀을 합산에서 제외하는 분산 형 높이 (FSC-H) 대 면적 (FSC-A)와 옆으로의 분산 높이 (SSC-H) 대 면적 앞으로 사용 1)을 그림. </li><li> 20 280 XG에서 분, 4 정렬 셀 원심 분리기를 수집하기 위해 ° C. </li><li> 후속 분석을 위해 필요한 문화 중간이나 버퍼에있는 셀을 Resuspend. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

유동 세포 계측법에 의한 손쥐 AECII의 절연에 대한 프로토콜은 기능과 분자 연구의 모든 범위의 마우스 폐에서 기본 셀을 액세스의 급속한 방법을 제공합니다. 설명 절차는 RNA 분리 (그림 2B 참조) transcriptome 연구로 직접 후속 분석을위한 번호 충분 AECII의 높은 가능한 순수 인구를 산출. 기능 어플리케이션의 경우, AECII 에어컨, 중간 또는 공동 문화 실험의 생성 예 수 있도록, 문화, 고립 된 세포를도 가능합니다. 특히 이러한 기능 연구에 대한 혜택으로 여기에 설명 된 바와 같이 부정적인 선택의 주요 세포의 분리는 항체 결합의 대상이 없었다 손길이 닿지 않은 세포를 얻을. 그러나, 세포 라인에서 수행 그 이상의 주요 AECII에서 연구의 장점에도 불구하고, 이러한 기본 세포의 사용에 실질적인 제한이 있습니다. 숫자의 단순한 제한 옆에, 광범위한 검사를 필요로하는 연구의 요구 사항을 충족하지 않을 수있는 기본 AECII는 우리가 48 시간 돌아 평균 관찰...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 내주하시는 캐뉼라 Introcan 22G </td><td> 브라운 </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispase, 100 ML (5000 caseinolytic 단위) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> 15 ML 튜브 4 ML에 나누어지는, -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> Biozym 플라크 아가로 오스 </td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> H 2 O 1 % W / V </td></tr><tr><td> 소 췌장, 2000 Kunitz 단위 / 유리 병에서 Deoxyribonuclease I </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D4263 </td><td> 갓 300 μl DMEM에 1 약병의 콘텐츠를 분해 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> 사용 등의 제조업체 (낮은 G에서 제공lucose, Pyruvate, HEPES) </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 (100 μm, 75 μm) </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352360, 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 나일론 메쉬 (48 μm, 30 μm) </td><td> Bückmann GmbH의 </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 μm 필터 </td><td> PARTEC </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td> 클론 93, 정화 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td> 클론 BM8, APC 결합 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td> 클론 M1/70, PE 결합 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td> 클론 N418, APC 결합 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스CD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td> 클론 30 F11, 정화 </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBio 1D3, PE 결합 </td></tr><tr><td> polyclonal 염소 안티 쥐 IgG </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550767 </td><td> polyclonal, PE 결합 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 대체 fluorochromes에 커플 링 된 항체가 사용할 수있는 흐름 cytometer와 레이저에 따라 사용할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table>

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 ii 폐포 상피 세포의 흐름 cytometric 절연

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

지난 수년 동안 폐의 면역 규제의 다양한 측면에 대한 폐포 타입 II 상피 세포 (AECII)의 후원금이 점차 인정 받고 있습니다. AECII는 염증 항공의 시토 킨 생산에 참여하고 감염 및 T-세포 매개 autoimmunity 1-8 모두에서 세포를 항원 제시로도 역할을 표시하고 있습니다. 따라서, 그들은 그러한에게기도 하이퍼 반응 등 임상 상황에서도 특별히 흥미있는 외국인뿐만 아니라 자기 항원 직접 또는 간접적 AECII을 타겟팅 감염. 그러나, 건강한 폐뿐만 아니라 염증의 폐포 타입 II 상피 세포에 의해 제공 자세한 immunologic 기능에 대한 우리의 이해는 단편 남아 있습니다. AECII 기능에 관한 많은 연구가 9-12 마우스 또는 인간의 폐포 상피 세포 라인을 사용하여 수행됩니다. 세포 라인과 함께 일하는 것은 확실히 같은 많은 수의 가용성 O와 같은 혜택을 제공합니다광범위한 분석을위한 F 세포. 그러나, 우리는 기본 손쥐 AECII의 사용이 감염이나 면역 염증과 같은 복잡한 과정이 세포 유형의 역할에 대한 이해를 갖게 될 것입니다. 기본 손쥐 AECII들은 분석 설정에서 역할을 모두 추가 외부 요인에 따라되었습니다 즉, 같은 호흡기 질환을 앓고있는 동물에서 직접 분리 할 수​​ 있습니다. 예를 들어, 가능한 AECII은 intranasally 주로 복제 13이 세포를 대상으로 인플루엔자 바이러스에 감염된 생쥐에서 분리 할 수 있습니다. 중요한 것은, 건강한 쥐에서 분리 AECII의 전 생체 감염을 통해 감염에 장착 된 세포 반응의 연구는 더욱 확장 할 수 있습니다. 주요 손쥐 AECII의 절연에 대한 프로토콜은, CD11c, CD11b, F4/80에 대한 특정 항체로 인한 세포 현탁액의 라벨 다음에 마우스 폐의 효소 소화에 기초CD19, CD45 및 CD16/CD32. 세분화 된 AECII 그 다음 높은 라벨과 측면의 분산 (SSC 높은) 세포 인구로 식별되며 3 분류 형광 활성 세포로 구분됩니다. 마우스 폐에서 기본 상피 세포를 분리하는 다른 방법에 비해, 부정적인 선택에 의해 AECII의 흐름 cytometric 절연을위한 프로토콜은 비교적 짧은 시간에 손길이 닿지 않은, 매우 실용적 순수 AECII를 얻을. 또한, 및 패닝과 림프구의 고갈에 의한 절연이 기존의 방법과는 달리 항체 - 커플 링 자석 구슬 14, 15의 바인딩을 통해, 흐름 cytometric 셀 정렬은 셀 크기와 세분화에 의해 차별을 할 수 있습니다. 흐름 cytometric 셀 정렬을위한 장비를 사용할 수 있는지 감안할 때, 설명 절차는 상대적으로 낮은 비용으로 적용 할 수 있습니다. 표준 항체 및 폐 붕괴에 대한 효소 등 자기와 같은 별도의 시약 옆에구슬이 필요합니다. 절연 세포가 체외 문화와 T-세포 자극의 assays에서뿐만 아니라 transcriptome, 프로테옴 또는 secretome 분석 3, 4 등이 포함 기능 및 분자 연구, 다양한 적합합니다.

건강한 쥐에서 분리 폐 세포 현탁액을 정렬하면 AECII 게이트는 일반적으로 42 정도 차지합니다 ± 모든 이벤트의 10 %입니다. 이 비율은 초기 세포 현탁액은기도에 채용 림프구와 기타 면역 세포의 상당히 높은 비율을 포함하므로, 이러한 바이러스 감염과 같은 호흡기 조건에 마우스를 사용하는 경우 현저하게 낮을 수 있습니다. 3 일 다음과 같은 감염에 IAV 감염된 폐 격리 AECII 위해 우리는 약 50 % AECII 게이트의 셀의 빈도의 감소를 관찰했습니다. 정렬 셀의 전형적인 종류뿐만 아니라 재 분석은 그림 1 B와 1 C로 그려져 있습니다. 표시된 바와 같이, 절연 세포의 순도는 약 92 계정 ± 5 %입니다. 그림 2A에서 우리는 순수한 세포 인구의 성공적인 분리에 의해 독점적으로 표현된다 계면 활성제 - 단백질 C,에 얼룩으로 확인 할 수 있습니다 보여AECII 16, 17. <...

우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

지난 수년간, 폐의 다양한 면역 조절 측면에서 폐포 II형 상피세포(AECII)가 기여하는 역할이...

이 프로시저의 전반적인 목적은 후속 기능 및 분자 분석을 위해 순수하고 생존 가능한 일차 신경 유형 2 폐포 상피 세포를 분리하는 것입니다. 먼저, 희생된 마우스의 폐와 기관에 DYS display 용액을 주입한 후 아가로스를 주입합니다. 그 다음, dispase가 폐를 소화하도록 둔 후 폐를 제거합니다.조직을 수동으로 분쇄합니다. 생성된 현탁액을 공극 크기가 점차 작아지는 일련의 메쉬로 필터링합니다. 그 후, 유세포 분석법을 이용한 음성 선택(negative selection)을 통해 염색세포와 2형 폐포 상피세포를 분리합니다.결과적으로, 분리된 2형 폐포 상피세포는 호흡기 감염 및 관련 자가면역 질환에서의 역할을 연구하기 위한 기능적 및 분자적 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 특히 자가면역 매개 폐 질환 및 바이러스 감염의 맥락에서 폐 면역 관계 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 장기 및 세포 현탁액 준비 과정은 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.본 프로토콜의 전반적인 성공 여부는 해당 단계들의 몇 가지 중요한 세부 사항에 달려 있습니다. 실험에 사용되는 각 마우스에 대해, 4 mL의 DYS buffer가 담긴 15 mL 튜브를 37 °C 항온수조에서 미리 가온하십시오. 물에 희석한 1% low-melting agarose의 소량 분주액을 95 °C 가열 블록에 넣고 액상화될 때까지 가열하십시오. 그 후 45 °C로 식힌 다음, 다음 단계에서 사용할 때까지 이 온도를 유지하십시오.CO2 질식법으로 희생시킨 마우스의 폐를 준비합니다. 에탄올을 사용하여 몸의 복측 정중선을 따라 길게 절개합니다.그 다음 복측의 먼 피부를 당기고 복막을 조심스럽게 절개하여 제거합니다. 마우스의 혈액을 모두 제거한 후, 횡격막을 조심스럽게 천자하여 제거하고 갈비뼈를 잘라냅니다. 심장과 폐를 노출시키기 위해, 차가운 액체가 채워진 10 milliliter 주사기와 26 gauge 캐뉼라를 사용하되 폐가 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오.PBS를 이용하여 심장의 우심실을 천자하고, 폐에 혈액이 남지 않을 때까지 PBS로 관류합니다. 타액선을 절단 및 제거하여 기관을 노출시킵니다. 또한, 기관 주변의 근육을 조심스럽게 절개합니다.다음으로, 22 gauge 유치 캐뉼라를 기관에 삽입합니다. 바늘을 제거하고 플라스틱 카테터를 폐 쪽으로 밀어 넣습니다. 기관과 카테터 주변에 작은 실 조각을 묶어 카테터를 고정합니다.필요한 경우, 기관에 삽입된 카테터를 사용하여 PBS 또는 배지로 폐를 세척하여 기관지폐포 세척액 샘플을 준비하십시오. 세척액은 추가 분석 전까지 얼음 위에 보관하십시오. 이 절차에서 가장 어려운 단일 단계는 소화 및 조직 분해 과정입니다.본 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 조직 소화 후 모든 폐엽에 Dispa가 완전히 채워지도록 주의해야 합니다. 2 mL 주사기를 사용하여 앞서 준비한 Dispa를 최대 2 mL까지 카테터를 통해 폐로 조심스럽게 주입하여 모든 폐엽이 완전히 팽창하도록 조직을 분해하십시오. 주사기를 0.5 mL의 액상 Aros가 들어 있는 1 mL 주사기로 교체한 후, 그 내용을 폐에 주입하십시오.에어로졸의 역류를 방지하기 위해 카테터에 주사기를 그대로 두고, 즉시 실험용 티슈, 종이 및 얼음으로 폐를 덮어줍니다. 에어로졸 겔 상태로 몇 분간 둡니다. 티슈, 종이, 얼음, 주사기 및 카테터를 제거합니다.그런 다음 기관을 절단하고 흉강에서 폐, 심장 및 흉선을 적출합니다. 준비된 장기들을 접시에 담아 PBS로 헹굽니다. 이어서 폐에서 심장, 흉선 및 남은 기관 부분을 절단하여 제거합니다.폐를 남은 2 mL의 display 용액이 들어 있는 튜브에 넣고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 염색 절차 전에 식세포의 FC 수용체를 효율적으로 차단하기 위해 배양 조건을 조정하십시오. 폐를 display 용액에서 1 µg/mL의 anti CD 1632 항체와 100 µL의 DNAs가 포함된 DMEM 7 mL가 들어 있는 접시로 옮기고, 두 개의 핀셋을 사용하여 폐 조직을 잡아당겨 완전히 해체합니다.그 다음, 원할 경우 200 RPM으로 설정된 로커 위에서 실온 상태로 10분 동안 배양합니다. 세포 현탁액은 다음 단계까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 일련의 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 피펫팅합니다.먼저, 50 mL 튜브 위에 놓인 100 µm 필터를 통해 현탁액을 붓습니다. 샘플을 풀링(pooling)하는 경우, 동일한 그룹의 마우스에서 얻은 세포 현탁액을 동일한 필터로 통과시킵니다. 필터가 막히면 새 필터로 교체합니다.70 µm 메쉬 필터를 사용하여 이 과정을 반복합니다. 세포 손실을 최소화하고 회수율을 극대화하기 위해 각 메쉬뿐만 아니라 튜브와 디쉬를 DMEM으로 충분히 헹궈내십시오. 다음으로, 여기에서 보여주는 것처럼 플라스틱 또는 유리 링 위에 48 µm 메쉬 필터를 펼쳐 현탁액을 통과시킵니다.통과액을 페트리 접시에 수집하십시오. 그다음 30 micron 메시를 사용하여 이 과정을 반복하십시오. 부피에 따라 여과액을 하나 이상의 50 milliliters 튜브에 옮기고 4 °C에서 160 ×g로 15분 동안 원심 분리하십시오.원심분리 후, 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 2mL의 적혈구 용혈 버퍼에 재현탁합니다. 그런 다음 13mL의 DMEM 배지를 첨가하여 빠르게 용혈을 중단시킵니다. 용액을 15mL 튜브로 옮기고 4°C에서 160×g로 12분 동안 원심분리합니다.CD 11 C, CD 11 BF four 80 CD 19, CD 1632 및 CD 45에 대한 항체를 포함하는 3 mL의 1차 항체 칵테일로 세포를 반응시켰습니다. 4 °C의 암소 또는 얼음 위에서 세포를 10분 동안 배양하십시오. 배양 후, 튜브를 DMEM으로 채워 세포를 세척하고 4 °C에서 160 ×g로 12분 동안 원심분리하십시오.세포를 1 mL의 DMEM에 다시 현탁하고, 50 micron 필터로 미리 여과하여 세포 분류용 튜브에 담습니다. 세포 수를 측정하여 폐 현탁액 내의 총 세포 수를 구합니다. 세포 분류 직전에 EC2의 세포 분류를 위해 100 micro 노즐을 사용하십시오.보텍스 믹서를 사용하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 유체 압력과 레이저 방출 및 검출 파장은 유세포 분석 세포 분류에 사용되는 기기와 항체 염색 절차에 사용된 형광 색소에 따라 달라집니다. 먼저, 측방 산란 영역(sideward scatter area) 대 형광 도표를 생성하고, 염색에 사용된 형광 색소에 대해 음성인 모든 측방 산란 영역 High 세포를 게이팅합니다.다음으로, side scatter area 대 forward scatter area, forward scatter height 대 forward scatter area, 그리고 side scatter height 대 side scatter area 플롯을 생성하고, 더블릿(doublet)이나 세포 응집체를 제외하기 위해 게이팅하여 DMEM이 담긴 튜브로 분리합니다. 건강한 생쥐로부터 분리한 폐 세포 현탁액을 사용할 때, EC2 게이트는 일반적으로 전체 이벤트의 약 42 ± 10%를 차지합니다. 분리된 세포를 수집하려면 280 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다.이후 분석에 필요한 배양액 또는 완충액에 type two alveolar epithelial cells 또는 EC2를 재현탁합니다. 일차 마우스 type two alveolar epithelial cells는 본 비디오에서 설명한 대로 유세포 분석 음성 선택법으로 분리되었으며, 정렬된 세포의 분석 내용이 여기에 묘사되어 있습니다. 표시된 바와 같습니다.분리된 세포의 순도는 약 92 ± 5%입니다. 분리된 A EC2를 계면활성제 단백질 C로 염색하였으며, 왼쪽에는 위상차 이미지, 오른쪽에는 면역형광 이미지가 나타나 있습니다. 거의 100%의 세포가 계면활성제 단백질 C 양성으로 확인되어, 순수한 세포 집단이 성공적으로 분리되었음을 입증하였습니다. 생체 내 인플루엔자 A 바이러스 감염의 영향을 평가하기 위해, 1, 2 또는 3일 전에 인플루엔자 A 바이러스 PR8 A/34 또는 인산 완충 식염수를 비강 내 투여한 C57BL/6 마우스로부터 A EC2를 분리하였습니다.이 도표들은 감염되지 않은 C 57 black six 수컷과 감염 3일 차 수컷의 폐 세포 현탁액을 보여주며, 감염된 폐로 면역 세포가 모집됨에 따라 분리를 위해 염색되었습니다. 감염되지 않은 마우스와 비교하여 감염 3일 차 마우스에서 준비된 세포 현탁액 내의 형광 음성 side scatter area high 세포의 비율이 상당히 감소했습니다. Influenza A virus nuclear protein 발현으로 분리한 C 2는 nuclear protein 특이적 항체를 이용한 세포 내 염색을 통해 분석되었습니다.히스토그램은 in vivo 감염 마우스에서 분리된 EC2가 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오단백질(nucleo protein)의 세포 내 염색 후 특이적 형광 신호를 나타냄을 보여줍니다. 표는 인플루엔자 A 바이러스 감염 마우스에서 분리된 EC2의 뉴클레오단백질 염색 평균 형광 강도를 나타내며, 세포 내 뉴클레오단백질 염색으로 생성된 신호 강도는 바이러스 감염 기간에 따라 증가합니다. 이는 건강한 마우스에서 분리된 EC2의 생존 능력을 입증하고 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 민감성을 테스트하기 위한 것입니다.여기에 표시된 것처럼, ex vivo로 감염된 분리 세포에서 인플루엔자 바이러스 핵단백질의 발현 또한 분석되었습니다. EC2의 상당 부분이 감염 6시간 후에 바이러스 핵단백질을 발현합니다. 이러한 데이터가 여기에 요약되어 있습니다.바이러스 핵 단백질의 세포 내 염색에 대해 EC2 양성을 보이는 비율은 ex vivo 감염 실험에 사용된 바이러스 용량에 따라 달라집니다. 이러한 결과는 분리된 일차 뉴런인 EC2가 생존 가능하며, 관찰된 바이러스 단백질 발현으로 평가했을 때 바이러스 감염 및 복제에 민감하다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 조직 소화 및 붕괴 단계를 세심하게 진행하는 것이 매우 중요합니다.또한, 형광 음성 및 측면 산란(side scatter) 영역의 고세포군에 대해 엄격하게 게이팅(gaiting)하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 분류를 수행한 후, 분자 및 기능 연구와 같은 다른 방법들을 통해 바이러스 감염 및 자가면역 매개 폐 질환의 맥락에서 폐의 제2형 및 제3형 폐포 세포의 역할을 배제할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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