에 Appetitive 연관 강한 학습 Drosophila 애벌레

본 절차의 목적은 고등 뇌 기능을 분석하는 것입니다. 간단한 모델인 DFA 유충을 통해 식욕과 연합 후각 학습을 분석합니다. 이를 위해 먼저 먹이 병에서 3령 유충 30마리를 수집하여 먹이를 제공합니다.

다음으로, 유충을 페트리 접시 위에서 5분 동안 훈련시킵니다. 이때 보상으로 fructose를 제공하며, 양측의 냄새 용기에는 후각 자극제로 octal을 넣습니다. 그 후, 보상인 fructose 없이 양측 냄새 용기에 Amal acetate를 넣은 상태로 5분간 두 번째 훈련 단계를 수행합니다. 이러한 두 가지 훈련 단계를 세 번 반복한 뒤, 보상 없이 서로 반대편에 냄새 용기를 배치하여 5분 동안 유충의 반응을 테스트합니다.

결국, Amal acetate에 대비한 한 종류의 옥탈(octal)에 대한 상대적 냄새 선호도는 초파리 유충이 후각 자극과 당 보상 사이의 연합을 형성할 수 있음을 나타내며, 이는 유전적으로 조작 가능한 시스템에서 연합 학습을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 이 방법을 신경 기능의 유전적 간섭과 결합하면, 보상을 신호하는 뉴런은 무엇인지, 또는 반복적인 기억의 습득이나 회상에 필요하거나 충분한 뉴런은 무엇인지와 같은 학습 및 기억 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 시연은 수술 후 평가(anti a postop)가 될 것입니다.

본 연구실의 박사 과정 학생이 우선 과당이 포함되지 않은 2.5% aros 페트리 접시를 제작합니다. 과당 접시를 준비하려면, 용해된 aros에 과당을 첨가한 후 플레이트에 붓습니다. 그다음, 실험자가 실험 내용을 알 수 없도록 각 접시에 서로 다른 기호를 표시하여 블라인드 처리합니다.

과당이 포함된 접시는 조건 보상이며, 일반 접시는 비보상입니다. 조건 자극을 위해 10 µL의 순수 1-octanol이 담긴 맞춤형 테플론 냄새 용기를 총 3개 준비합니다. 뚜껑에는 냄새가 증발할 수 있도록 작은 구멍이 뚫려 있습니다.

둘째로, 파라핀 오일에 1:50으로 희석한 아밀 아세테이트 10 µL를 넣은 냄새 용기 3개를 추가로 준비합니다. 이 희석액은 순수 1-옥탄 10 µL만큼이나 유인력이 있습니다. 먹이 병에서 배회하지 않고 먹이 활동을 하는 개체 30마리를 수집하는 것으로 시작하십시오. 셋째로,

이 프로토콜은 하루 중 어느 시간대에나 수행할 수 있습니다. 이는 일주기 리듬과 무관합니다. 라바(lava)를 수돗물이 몇 방울 들어 있는 페트리 접시에 옮기고, 붓을 사용하여 조심스럽게 앞뒤로 움직여 줍니다.

그런 다음 유충을 수돗물 몇 방울이 들어 있는 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 유충의 몸벽에 먹이 페이스트가 묻어 있는지 확인합니다. 이제 페트리 접시를 실험 장치에 배치하여 유충이 특정 당 신호를 냄새와 연관시키도록 훈련시킵니다.

자극제로 사용된 두 가지 유형의 접시 중 하나를 선택하여 왼쪽과 오른쪽에 냄새 용기를 배치합니다. 여기서는 팔각(octal)을 사용하였으나, 실험자가 보상을 알 수 없는 눈가림 상태이므로 선택은 임의적입니다. 다음으로, 유충 무리를 접시 중앙에 놓습니다.

뚜껑을 닫고 동물이 자극에 노출되는 동안 5분 동안 기다립니다. 유충이 물방울의 표면 장력을 극복하여 갇히지 않고 자유롭게 탐색할 수 있는지 확인하십시오. 새 페트리 접시에 아세트산 암모늄이 담긴 새 용기를 놓습니다.

5분 후, 젖은 붓을 사용하여 유충을 좌우에 서로 다른 자극이 배치된 반대 유형의 접시로 옮깁니다. 여기서 냄새는 amyl acetate입니다. 유충을 옮긴 후, 뚜껑을 닫고 동물이 5분 동안 탐색하도록 둡니다.

이 시간이 지나면 1라운드 훈련이 완료됩니다. 첫 번째 라운드와 동일한 방식으로 두 라운드의 훈련을 더 수행합니다. 젖은 브러시로 동물을 이동시키고, 각 자극과 보상의 조합에 총 3회씩 노출시킵니다.

실험 테스트를 위해, 코팅되지 않은 agar Petri dish의 서로 반대되는 지점에 각 자극제별로 신선한 냄새 용기를 하나씩 배치하십시오. 훈련된 동물을 dish의 중앙으로 옮깁니다. 뚜껑을 닫고 5분 동안 기다리십시오.

5분 후, 접시 아래에 왼쪽, 오른쪽, 중앙의 세 구역이 명확하게 정의된 템플릿을 사용하여 각 구역에 있는 유충의 수를 세십시오. 중앙 구역은 비선호 점수로 간주되며, 이는 분석을 더 엄격하게 하여 편향의 영향을 줄여줍니다. 마지막으로, 실험을 완료하기 위해 3~일령의 새로운 먹이 공급 유충 30마리를 선택하고, 보상과 자극의 조합을 반대로 하여 훈련 및 테스트를 반복하십시오.

동일한 냄새 용기를 계속 사용하십시오. 형질 전환 동물이 보상 자극에 대해 정상적인 후각 처리 능력을 갖추고 있는지 확인하기 위해 몇 가지 대조군 테스트가 필요합니다. 미경험 냄새 선호도 테스트는 훈련 및 테스트 때와 마찬가지로 30마리의 유충을 수집하고 세척하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 한쪽에 하나의 자극 바이알만 있는 아가로즈 페트리 접시에 유충을 넣습니다. 뚜껑을 닫고 5분 동안 기다립니다. 그 후, 템플릿을 사용하여 자극제 기준 접시의 가까운 쪽, 중간, 그리고 먼 쪽에 있는 유충의 수를 세어 측정합니다.

초보 당 선호도를 테스트하기 위해 실험에 사용된 각 자극에 대해 이 테스트를 수행하십시오. 코르드 접시의 아가로스 절반을 잘라내고 빈 공간을 다른 종류의 용융 아가로스로 채워 절반씩 나뉜 페트리 접시를 준비하십시오. 이때 양쪽 절반의 부피가 일치해야 하며 뚜렷한 경계가 형성되지 않도록 주의하십시오.

이는 실온에서 준비된 하프-하프 디쉬(half half dish)를 사용하여 연습이 필요할 수 있으며, 30마리의 깨끗하고 굶긴 상태의 무경험 개체를 배치합니다. 디쉬 중앙에 세 번째 단계의 성상 유충(star larvae)을 넣습니다. 뚜껑을 닫고 5분 동안 기다립니다.

그 후, 템플릿을 사용하여 양측의 유충 수와 중앙의 유충 수를 각각 측정합니다. 설명된 절차는 trenchgenic 유충을 훈련시키고 테스트하는 데 사용되었습니다. 예시 자극을 사용하여, 페트리 접시의 서로 다른 영역에 있는 유충의 수로 데이터를 집계하였습니다.

이 데이터 선호도에서 5분 후, 지수를 계산하였으며 상호 훈련된 그룹으로부터 성능 지수를 도출하였습니다. 테스트된 유충은 형질전환체였으므로, 향기가 담긴 용기와 공기 사이의 선택뿐만 아니라 순수 향기와 설탕이 첨가된 향기 사이의 선택 또한 제공되었습니다. 박스 플롯에서 계산된 지수를 검토한 결과, 동물들이 과당 향기를 식욕 강화제로 사용하여 옥탄올과 ML acetate를 구별하는 법을 배울 수 있었음을 확인하였습니다.

동물들은 두 자극 모두를 유인물질로 인식했으며, aero보다 fructose aro에 대해 초기 선호도를 보였습니다. 이러한 실험 패러다임은 광범위한 후각 및 시각 자극뿐만 아니라 다양한 보상 및 처벌 자극에 성공적으로 적용되어 왔습니다. 이 패러다임을 초파리에서 사용 가능한 다양한 강력한 유전적 조작법과 결합하면 신경망을 분석하는 데 특히 유용하며, 예를 들어 gal four 발현 패턴으로 정의된 특정 뉴런 집합을 유전적으로 조작함으로써 식욕 학습에서 해당 뉴런들의 기능적 역할을 평가할 수 있습니다.

이 절차를 신경 기능의 유전적 간섭과 함께 사용하면 학습 및 기억에 관여하는 유충 뇌의 신경망을 분석할 수 있습니다. 유충 뇌의 단순성 덕분에 이는 단일 세포 수준까지 가능합니다.