에 Appetitive 연관 강한 학습 Drosophila 애벌레

본 절차의 목적은 고등 뇌 기능을 분석하는 것입니다. 간단한 모델인 DFA 유충을 대상으로 식욕 및 연합 후각 학습을 분석합니다. 이를 위해 먼저 먹이 바이알에서 3령 유충 30마리를 수집하여 급여합니다.

다음으로, 과당을 보상으로 제공하고 양측에 후각 자극제로 octal이 담긴 냄새 용기를 배치한 페트리 접시에서 유충을 5분 동안 훈련시킵니다. 그 후, 과당 보상 없이 양측에 Amal acetate가 담긴 냄새 용기를 배치하여 5분 동안 두 번째 훈련 단계를 수행합니다. 이 두 가지 훈련 단계를 3회 반복한 후, 보상 없이 유충을 서로 반대편에 놓인 냄새 용기에 노출시켜 5분 동안 테스트합니다.

결과적으로, Amal 아세테이트 대비 특정 옥탈의 상대적 냄새 선호도는 초파리 유충이 후각 자극과 당 보상 사이의 연관성을 형성할 수 있음을 나타내며, 이는 유전적 조작이 용이한 시스템에서 연합 학습을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 이 방법은 신경 기능의 유전적 간섭과 결합하여, 보상을 신호하는 뉴런은 무엇인지, 또는 반복적인 기억의 습득이나 회상에 필요하거나 충분한 뉴런은 무엇인지와 같은 학습 및 기억 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 시연은 사후 분석에 도움이 될 것입니다.

본 연구실의 박사 과정 학생이 먼저 과당이 포함되지 않은 2.5% aros 페트리 접시를 제작합니다. 과당 접시를 준비하려면, 용해된 aros에 과당을 첨가한 후 플레이트에 붓습니다. 그다음, 실험자가 인지하지 못하도록 각 접시에 서로 다른 기호를 표시하여 블라인드 처리합니다.

과당이 포함된 접시는 조건 보상이며, 일반 접시는 비보상입니다. 조건 자극을 위해 10 µL의 순수 1-octanal이 들어있는 맞춤형 테플론 냄새 용기를 총 3개 준비합니다. 뚜껑에는 냄새가 증발할 수 있도록 작은 구멍이 뚫려 있습니다.

둘째, 파라핀 오일에 1:50으로 희석한 amyl acetate 10 µL를 넣은 냄새 용기 3개를 추가로 준비합니다. 이 희석액은 순수 octanal 10 µL만큼이나 유인력이 있어, 먹이 병에서 배회하지 않고 먹이를 섭취하는 개체 30마리를 수집하기 시작합니다. 셋째, 먹이 병으로부터 수집합니다.

본 프로토콜은 하루 중 언제든지 수행할 수 있으며, 일주기 리듬과는 무관합니다. 라바를 수돗물이 몇 방울 담긴 페트리 접시에 옮긴 후, 붓을 사용하여 조심스럽게 앞뒤로 움직여 줍니다.

그 다음, 수돗물을 몇 방울 떨어뜨린 두 번째 페트리 접시에 유충을 옮깁니다. 유충의 몸벽에 먹이 페이스트가 묻어 있는지 확인하십시오. 이제 페트리 접시를 실험 장치에 배치하여 유충이 냄새와 특정 당 큐(sugar queue)를 연관 짓도록 학습시킵니다.

사용되는 두 가지 유형의 디시 중 하나를 선택하여 좌측과 우측에 냄새 용기를 놓습니다. 여기서는 한 개의 8분면 디시를 사용하였으나, 실험자가 보상을 알 수 없으므로 선택은 임의적입니다. 다음으로, 유충 그룹을 디시 중앙에 배치합니다.

뚜껑을 닫고 동물이 자극에 노출된 상태로 5분 동안 기다립니다. 유충이 물방울의 표면 장력을 극복하여 갇히지 않고 자유롭게 탐색할 수 있는지 확인하십시오. 새로운 Amal acetate 용기를 새 Petri dish 위에 놓습니다.

5분 후, 습윤한 붓을 사용하여 유충을 좌우 양측에 서로 다른 자극제가 배치된 반대 유형의 접시로 옮깁니다. 여기서 냄새는 amyl acetate입니다. 유충을 옮긴 후, 뚜껑을 닫고 동물이 5분 동안 탐색하도록 둡니다.

이 시간이 경과하면 1차 훈련이 완료됩니다. 1차와 동일한 방식으로 훈련을 2회 더 실시합니다. 습식 브러시를 사용하여 동물을 이동시키고, 각 자극과 보상 조합에 총 3회 노출시킵니다.

실험 테스트를 위해, 코팅되지 않은 agar 전용 페트리 접시의 서로 반대되는 지점에 각 자극제당 하나씩 신선한 냄새 용기를 배치합니다. 훈련된 동물을 접시의 중앙으로 옮깁니다. 뚜껑을 닫고 5분 동안 기다립니다.

5분 후, 디쉬 하단에 왼쪽, 오른쪽, 중앙의 세 구역이 명확히 구분된 템플릿을 사용하여 각 구역 내 유충의 수를 세십시오. 중앙 구역은 비선호 점수로 간주하며, 이는 분석을 더욱 엄격하게 하고 편향의 영향을 줄여줍니다. 마지막으로, 실험을 완료하기 위해 3일령의 새로운 먹이 공급 유충 30마리를 선택하여 보상과 자극의 조합을 반대로 하여 훈련 및 테스트를 반복하십시오.

동일한 냄새 용기를 계속 사용하십시오. 형질전환 동물이 보상 자극에 대해 정상적인 후각 처리 능력을 갖추고 있는지 판단하기 위해 여러 가지 대조군 테스트가 필요합니다. 미경험 냄새 선호도 테스트는 훈련 및 테스트 때와 마찬가지로 30마리의 유충을 수집하고 세척하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 한쪽에 자극 바이알이 하나만 놓인 아가로스 페트리 접시에 유충을 옮깁니다. 뚜껑을 닫고 5분 동안 기다립니다. 그 후, 템플릿을 사용하여 자극제를 기준으로 접시의 가까운 쪽, 중간, 그리고 먼 쪽에 있는 유충의 수를 각각 측정합니다.

미경험 당분 선호도를 테스트하기 위해 실험에 사용된 각 자극제에 대해 이 테스트를 수행하십시오. 코드 접시의 아가로스 절반을 잘라내고 빈 공간을 다른 유형의 용융 아가로스로 채워 반반 페트리 접시를 준비하십시오. 이때 양쪽 절반의 부피가 일치하도록 주의하고 뚜렷한 경계선이 생기지 않도록 하십시오.

이 과정은 준비된 half half dish를 사용하여 상온에서 연습이 필요할 수 있으며, 30마리의 세척된 naive 개체를 배치합니다. dish 중앙에 star larvae를 넣습니다. 뚜껑을 닫고 5분 동안 기다립니다.

그 후, 템플릿을 사용하여 양측의 유충 수를 세고 중앙에 있는 유충 수를 셉니다. 설명된 절차는 trenchgenic 유충을 훈련하고 테스트하는 데 사용되었습니다. 예시 자극을 사용하여, 데이터를 페트리 접시의 서로 다른 영역에 있는 유충 수로 집계하였습니다.

해당 데이터 선호도 측정 5분 후 지수를 계산하였으며, 상호 훈련된 그룹으로부터 성능 지수를 도출하였습니다. 테스트에 사용된 유충이 형질전환체였으므로, 향기 용기와 공기 사이의 선택뿐만 아니라, 순수 향기와 당분이 포함된 향기 사이의 선택 기회도 제공하였습니다. 박스 플롯으로 계산된 지수를 분석한 결과, 과당 향기를 식욕 강화제로 사용하여 동물들이 하나의 옥탄올과 ML 아세테이트를 구별하는 법을 학습할 수 있음을 확인하였습니다.

동물들은 두 자극을 모두 유인물로 인식했으며, aero보다 과당 향에 대해 천연적인 선호도를 보였습니다. 이러한 실험 패러다임은 광범위한 후각 및 시각 자극뿐만 아니라 다양한 보상 및 처벌 자극을 대상으로 성공적으로 사용되어 왔습니다. 이 패러다임을 초파리에서 사용 가능한 강력한 유전자 조작 기법들과 결합하면 신경망을 분석하는 데 특히 유용하며, 예를 들어 gal4 발현 패턴으로 정의된 특정 뉴런 집단을 유전적으로 조작함으로써 식욕 학습에서 해당 뉴런들의 기능적 역할을 평가할 수 있습니다.

이 절차를 뉴런 기능의 유전적 간섭과 병행하여 사용하면, 학습 및 기억에 관여하는 유충 뇌의 신경망을 분석할 수 있습니다. 유충 뇌의 단순성 덕분에, 이러한 분석은 단일 세포 수준까지 가능합니다.