카본 블랙 잉크의 혈관 재관류은 뇌 혈관의 신뢰성 시각화 수 있습니다

이 절차의 전반적인 목적은 마우스의 뇌혈관 해부학적 구조를 재현 가능한 방식으로 연구하는 것입니다. 먼저, 추후 카본 블랙 잉크 염색과 비교하기 위해 색조 라텍스로 뇌혈관을 염색합니다. 다음으로, 카본 블랙 잉크들을 혼합하고 좌심실을 통해 PBS-PFA와 카본 블랙 잉크 혼합액으로 동물을 관류합니다.

마지막 단계에서는 뇌를 수집하고, 염색된 뇌혈관의 비교 및 분석을 위해 사진을 촬영합니다. 최종적으로, Image J 소프트웨어를 사용하여 중대뇌동맥과 전대뇌동맥 사이의 문합 지점을 분석합니다. 이 기술의 함의는 혈관 밀도와 혈관 신생을 분석하는 데 활용될 수 있다는 점에서 뇌혈관 질환, 특히 뇌졸중의 치료로 확장됩니다.

이제 이 방법은 뇌의 혈관계에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 심장, 간 또는 신장의 미세 혈관 시각화와 같은 다른 계통에도 적용될 수 있습니다. EP 튜브에서 라텍스와 카본 블랙 잉크를 혼합한 후, 워터배스에서 혼합물을 37 °C로 가온합니다. 23~25 gauge 바늘을 사용하여 가온된 라텍스를 2 mL 주사기에 채웁니다.

그런 다음 12.5 mg의 papine hydrochloride 분말을 1 mL의 멸균 생리식염수에 녹이고, 볼텍싱 후 결과 용액을 인슐린 주사기로 수집합니다. 다음으로, 다른 멸균 인슐린 주사기에서 바늘을 분리하여 분리된 바늘을 20 cm 길이의 PE 10 튜브 끝에 배치합니다. 그 후 PE 10 튜브를 Papine hydrochloride 용액이 들어 있는 인슐린 주사기의 바늘에 연결합니다.

이제 두 개의 인슐린 주사기에 생리식염수 1 mL를 더 채운 다음, 모든 주사기와 멸균된 해부 도구를 마취 전 수술대로 옮깁니다. 마우스의 무게를 잰 후, 지속적으로 마취된 마우스를 배가 위로 향하게 배치합니다. 사지를 고정하고 왼쪽 대퇴정맥 위의 피부를 절개합니다.

이제 대퇴정맥의 위치를 찾아 PE 10 튜브가 연결된 바늘의 끝부분을 삽입합니다. 그 다음 Papine hydrochloride 용액을 분당 약 100 µL의 속도로, 체중 kg당 50 mg의 용량으로 천천히 주입합니다. 주입 후, 복강을 절개하고 횡격막을 관통합니다.

그 다음 갈비뼈를 절개하여 심장을 노출시키고, 동맥 겸자(artery forceps)로 하행 흉부 대동맥을 집습니다. 이어서 우심방을 날카롭게 절개하여 정맥혈을 배출시킵니다. 그런 다음 좌심실에 2 mL의 식염수를 주입합니다.

Profil 용액이나 혼합 잉크 내에 공기가 존재하면 뇌의 혈관 부위가 염색되지 않을 수 있습니다. 성공적인 실험을 위해 모든 주사기에 기포가 완전히 없는지 매우 주의 깊게 확인하십시오. 이제 미리 채워진 주사기의 내용물을 하나씩 천천히 주입하여 18~20초 동안 유색 라텍스를 수동으로 주입한 후, 동물을 5분 동안 그대로 둡니다.

그 후 동물을 안락사시켜 머리를 분리한 다음, 피질이나 혈관 구조가 손상되지 않도록 주의하며 두개골과 뇌막을 제거하고, 전체 뇌를 조심스럽게 적출합니다. 4% PFA 6~8 mL가 들어 있는 60 mm 세포 배양 접시에 뇌를 넣고, 수술 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 접시 아래에 측정 자를 배치합니다. 현미경 대물렌즈와 페트리 접이가 90도 각도가 되도록 하여 뇌의 등쪽 및 배쪽 표면을 25배 배율로 촬영합니다.

초기 거리를 정량화하기 위해, 두 개의 1.5 mL EP 튜브에 herts stemple farba 잉크(CB one) 100 µL 분량 두 개와 pelican scribal schwartz 잉크(CB two) 900 µL 분량 두 개를 각각 혼합하여 카본 블랙 잉크 염색 절차를 시작합니다. 혼합된 잉크를 두 개의 별도 1 mL 인슐린 주사기에 담습니다. 그런 다음 주사기의 캡을 닫고, 1 mL의 생리식염수가 각각 담긴 다른 두 개의 인슐린 주사기와 함께 37 °C 항온수조에 넣습니다.

방금 시연한 대로 마우스를 처리한 후, 약간의 압력을 가해 카본 블랙 잉크 용액 두 가지를 좌심실에 mL당 18~20초에 걸쳐 주입하십시오. 방금 시연한 대로 뇌를 적출하고 사진을 촬영한 후, 뇌를 4% PFA에 하룻밤 동안 두고, 뇌가 완전히 가라앉을 때까지 점진적으로 농도를 높인 설탕 용액에서 배양하십시오. 일시적 국소 뇌허혈을 유도하여 이 단계를 시작하십시오.

중대뇌동맥의 관강 내 폐쇄 표준 프로토콜에 따라, 재관류 기간이 끝난 후 앞서 시연한 대로 CB one 및 CB two 잉크로 혈관을 염색하고, 37°C에서 2% TTC 용액으로 뇌 전체를 5~10분 동안 염색합니다. 경색 부피를 확인하기 위해, 경색 영역은 흰색으로 유지되는 반면 비허혈 영역은 붉은색으로 변합니다. 염색된 뇌 표면의 이미지를 여는 것으로 시작하여, 시연된 방식대로 이미지를 수집해 뇌혈관의 육안 해부학적 구조를 분석합니다.

Image J 소프트웨어를 사용하여, 착색된 라텍스로 관류된 뇌는 복측 표면에 위치한 혈관 염색 정도가 다양하게 나타날 수 있습니다. 반면 CB one과 CB two 관류를 사용하면 복측과 배측 표면의 모든 혈관이 염색됩니다. 스케일을 밀리미터(mm) 단위로 설정하고, 전대뇌동맥(anterior cerebral artery, ACA)과 중대뇌동맥(middle cerebral artery, MCA) 사이의 문합 지점들을 표시하여 이 모든 문합 지점을 연결하는 가상의 선을 생성하십시오.

이제 뇌의 전두극(frontal pole)에서 4mm 및 6mm 지점에서 문합선과 중앙선 사이의 거리를 측정하십시오. 동물당 3~4장의 이미지를 분석한 후 평균값을 계산하십시오. 서로 다른 동물 그룹 간의 값을 비교하여 뇌혈관 해부학적 구조의 변이를 확인하십시오.

C 57 black six J 동물의 경우, ACA와 MCA 사이의 문합선은 전두극(frontal pole)으로부터 6mm 거리보다 4mm 거리에서 정중선에 더 가깝게 위치하는 것을 확인할 수 있으나, APO lipoprotein e 녹아웃 마우스에서는 이와 관련하여 유의미한 차이가 나타나지 않습니다. 반면, SV 1 29 마우스의 혈관 해부학적 분석 결과, 문합선은 전두극으로부터 4mm와 6mm 지점 모두에서 정중선으로부터 더 멀리 떨어져 있으며 더 평행하게 위치합니다. 허혈 조건 하에서는 대사 활성 조직과 괴사 조직을 각각 나타내는 적색 및 백색의 조직 경계면을 경색 경계로 식별하고, 뇌의 전두극으로부터 4mm 및 6mm 지점에서 정중선으로부터 경색 경계까지의 거리를 측정하십시오.

본 프로토콜은 설치류 뇌혈관의 기존 라텍스 기반 시각화 방식이 가진 기술적 한계를 극복합니다. 유색 라텍스를 관류한 후 촬영한 첫 번째 이미지에서 보듯, 복측 표면의 큰 혈관들만 염색되고 배측 표면 전체는 염색되지 않은 채로 남게 됩니다. 반대로, CB one과 CB two를 관류하면 소혈관과 대혈관 모두 균일하게 충분히 채워집니다.

염색 상태는 7일 동안 품질 변화 없이 안정적으로 유지됩니다. Image J 프로그램을 사용하여, 지역적 혈관 해부학적 구조의 차이를 평가하기 위해 잉크로 관류시킨 다양한 쥐 그룹에서 A CA와 MCA 사이의 문합점과 정중선 사이의 거리를 분석할 수 있습니다. POE를 녹아웃시켜도 C 57 black six J 쥐의 뇌혈관 해부학적 구조에는 영향을 미치지 않으나, C 57 black six J와 SV 1 29 계통 간에는 유의미한 차이가 관찰될 수 있습니다.

실험적 설치류 뇌졸중 모델에서 TTC 염색은 경색 부피를 시각화하는 데 널리 사용됩니다. CB one 및 CCB two 염색 또한 허혈 조건 하에서 혈관의 구조적 변화를 관찰하는 데 적용 가능하며, TTC 염색과 병행했을 때 높은 안정성을 보여줍니다. 서로 다른 뇌허혈 지속 시간 및 재관류 시점에 의해 유도된 허혈성 뇌에서 뇌혈관과 경색 부피가 동시에 시각화된 모습에 주목하십시오.

45분 또는 90분 동안의 허혈 후 1일 또는 5일의 재관류 기간을 거친 a c와 MCA 사이의 문합 지점을 분석한 결과, 예상대로 정중선과 문합 지점 간의 평균 차이는 그룹 간에 유의미한 차이를 보이지 않았습니다. 또한, 평균 거리는 비허혈성 동물과 동일한 범위 내에 있었습니다. 그러나 정중선에서 경색 경계까지의 거리는 그룹 간에 유의미한 차이를 보였으며, 이는 허혈-재관류 손상 정도가 심할수록 경색 부피가 증가함을 반영합니다.

이 기술은 실험적 뇌졸중 분야의 연구자들이 마우스 뇌의 혈관 영역을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 잠재력을 가지고 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 락스 또는 카본 블랙 잉크를 뇌에 관류시켜 마우스의 뇌혈관 해부학적 구조를 연구하는 방법과 Image J 소프트웨어를 사용하여 염색된 뇌 조직을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.