Name: 곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 배우세요 곤충의 후각 정보 처리를 위한 가스 크로마토그래피-다중유닛 기록법을 사용하여 생물학적으로 활성인 휘발성 물질을 식별하는 방법입니다. 이 기술은 뇌 신경 반응을 측정하여 곤충 행동에 영향을 미치는 냄새 분자를 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 NSF 기금 IOS 1,121,692에 의해, 워싱턴의 연구 재단의 대학에 의해 지원되었다.

1. 휘발성 Follection <ol><li> 이 예제에서, 우리는 M.에서 휘발성 샘플을 사용하여 lewisii 꽃 - 캘리포니아에 고산 야생화의 기본. 휘발성 물질이 Riffell 외에 따라 동적 흡착 방법을 사용하여 수집하고 있습니다. 14. 간단히,이 방법은 꽃이 테플론 백에 동봉되는 폐 루프 트래핑 시스템을 사용합니다. 불활성 진공 펌프 사용하여 꽃 주변의 공기는 Porapak Q 행렬로 가득 파스퇴르 피펫으로 구성 &quot;덫&quot;을 통해 형편입니다. 펌프의 반환 공기는 활성탄에 의해 필터링됩니다. 소정의 기간 후에, 우리의 경우 24 H에, Porapak Q 행렬은 집중 추출물를 수집하기 위해, 비 극지 용매, 일반적으로 헥산으로 용출되어 있습니다. 추출물 그런 다음 -80 ° C에서 분석 될 때까지 저장됩니다. 필요한 경우, 샘플은 질소 가스의 흐름에 따라 사전 분석에 집중 할 수 있습니다. 샘플은 이미 잘 - 특징 않는 한,를 통해 그것을 나누어지는을 실행기체 크로마토 그래프 - 질량 분석기 (GC-MS)는 샘플을 사용하기 전에 휘발성 구성 요소를 식별합니다. </li></ol> 2. Electrophysiological 준비 <ol><li> 1000 μl 피펫 팁의 끝에서 약 1cm를 자른다. 피펫 팁의 기본에 범블비 (Bombus impatiens)를 놓고는 머리가 노출 될 때까지 부드럽게 끝의 반대쪽으로 밀어. </li><li> 치과 왁스를 녹여 및 보안에 대한 화합물 눈 위에와 왁스 준수는 꿀벌의 머리가 완전히 고정되어 만들 수 있는지 확인하기, 노출 된 머리 주위를 뜨는거야. 벌의 안테나에 어떤 왁스를하지 않도록주의하십시오. </li><li> 머리가 안전하면, 면도기 블레이드 - 차단기 나 큐티클을 잘라 할 메스 적절한 크기를 사용하여 헤드 캡슐로 광장, 윈도우 같은 절개를합니다. 블레이드 - 차단기를 사용하여 즉시 화합물 눈에 안테나와 인접 하나 뒤에, 머리 캡슐의 등 측면에서 시작합니다. 절단한 화합물 눈에서 contralateral 화합물 눈에 직선. 반대 화합물 눈에 직선을 절단 한 후, 그 가슴 근처의 헤드 캡슐 곡선과 끝날 때까지 dorsally 절개을 시작합니다. 이 시점에서, 머리 캡슐의 반대 끝 부분 절단하기 시작합니다. 마지막으로, 한 번 줄이 반대쪽으로 절단되었습니다 초기 절개의 시작 위치로 다시 줄을 잘라. 이 전극의 삽입을 방해하므로 그것은 안테나에 인접 해 있습니다 큐티클을 제거하는 것이 중요합니다. </li><li> 큐티클을 잘라되면 다음 벌의 뇌를 노출하고, 더 중요한 것은 antennal 엽해야 벌의 큐티클을 제거 포셉 한 쌍의를 사용합니다. 바로 뇌 dessicated이되지 않도록, 곤충 식염수 뇌를 superfusing 시작합니다. 뇌가 노출되면 조심스럽게 즉시 antennal 엽 위의 perineural 피복을 제거하는 아주 좋은 포셉 한 쌍의를 사용합니다. 정말 조심해야하지에포셉과 구멍 벌의 뇌를. </li></ol> 3. 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피 <ol><li> 벌 &quot;준비&quot;- 뇌의 노출이있는 튜브에서 수정이 - 지금 electrophysiological 레코딩을위한 준비가되었습니다. 공기 테이블에 자리 잡고 있습니다 자기베이스에 고정 클램프의 벌을 배치합니다. </li><li> IV 가방, 흐름 컨트롤러, 그리고 생리가 계속 뇌를 superfuses 있도록 튜브를 (곤충 생리가 가득) 준비합니다. </li><li> 벌의 눈에, 텅스텐 와이어로 만든 micromanipulator, insertareference 전극을 사용합니다. </li><li> 별도의 micromanipulator를 사용, 이러한 코일 와이어 tetrode, 또는 실리콘 멀티 채널 전극 (Neuronexus 기술)로, 멀티 채널 전극을 삽입 벌의 antennal 엽에. 이 전극 등의 가열 치사 시스템의 Z-버스 bioamp 프로세서에 가열 치사 시스템의 S-3 Z 시리즈와 같은 사전 증폭기에 연결되어 있습니다. 가스 Chro의 출력차폐 된 BNC 케이블을 통해 matogram의 감지기가 모두 신경 및 GC 신호가 동기화되는 등의 증폭기 및 데이터 수집 시스템과 인터페이스 할 수 있습니다. </li><li> 안정화 할 수있는 신경 레코딩을위한 약 30~60분 기다립니다. 자연 활동 및 녹화 채널에 단위의 파형 모양이 일관성이되었습니다되면, 벌을 자극하고 냄새에 기록 채널의 반응을 관찰하는 악취 주사기를 사용합니다. </li><li> 에 의해 뉴런의 세포 스파이크를 기록 자동 임계 값 각 기록 채널에서 신호의 3.5-5 시그마하여 녹화 채널을. 수동 임계 값은 전기 노이즈의 오염을 방지하기 위해 일부 채널 필요할 수 있습니다. 뉴런의 활동 전위가 기록 채널에 전압 스파이크로 표시됩니다. 채널의 전압이 임계 값을 초과하면 시스템은이를 실려, 임계의 교차로 전후 몇 밀리 초 버퍼 및 저장GA는 파형의 스냅 샷, 또는 스파이크. </li><li> 바로이 공기 테이블 옆에있는 GC입니다. GC에 꽃 추출물을 주입하기 전에 GC 실행의 온도 램프를위한 방법이 올바른지 확인하십시오. 우리 예제에서, 우리는 10 ° C / 분의 속도로 온도의 증가에 이어 4 분 50에서 시작 온도 방법 ° C를 사용합니다. 220 ° 우리가 추가 6 분의 GC을 보유하고있는 시간에 C,. 우리는 캐리어 가스로 헬륨이있는 DB-5 GC 컬럼 (J &amp; W 과학, Folsom, CA, USA)를 사용합니다. 입구는 200 ° C.로 설정 온도, splitless입니다 불꽃 이온화 검출기 온도는 230 ° C.로 설정되어 있습니다 </li><li> GC 칼럼으로 adsorbed 휘발성 물질을 해제 할 수있는 GC의 온수 주입 포트에 꽃 천정 공간의 추출물 샘플을 주입. 열에서 유출 물은 불꽃 이온화 검출기 (FID) 및 유리 &quot;Y&quot;커넥터 (J &amp; W 과학)를 사용하여 벌 안테나 사이에 1:1 분할되어 있습니다. REC를 시작당신은 GC에 샘플을 투입으로 전극에서 ording. </li><li> GC 실행 완료 후, 5 15 분을 위해 준비 나머지를 보자. 그런 다음 GC에 다른 샘플을 주입 또는 단일 휘발성 화합물 또는 화합물의 혼합물을 사용하여 준비를 자극한다. 준비를 자극이 후자의 방법에서는 일정한 공기 흐름에서 공기의 펄스는 화합물이 증착 된되는 필터 종이를 포함하는 유리 주사기를 통해 우회합니다. 냄새 자극은 소프트웨어에 의해 제어 솔레노이드가 활성화 된 밸브에 의해 펄스되었습니다. </li><li> 단위 활동이 갑자기 중단하거나 변경할 경우, 생리 똑을 확인하고 15 분 동안 준비 나머지를 보자. 자연 활동이 이전 수준을 회복하지 않으면 사용 가능한 경우 다음 준비는 폐기하고 다른 꿀벌이 사용되어야합니다. </li><li> 실험 후, 여전히 조직의 프로브와 20 분에 포르말린 5퍼센트으로 뇌를 해결할 수 있습니다. 다음, 소비세 뇌그리고 4 시간에 2 % 글 루타 알데히드에 배치하고, 이후 등급 에탄올 탈수 시리즈를 수행하고 살리실산 메틸과 뇌를 취소합니다. 조직, 전극의 조직은 공 촛점 현미경에 의해 명확하게 알아볼 수 있어야합니다 구멍을 AL에있는 위치의 고정과 개간을 기반으로합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 분석은 기록 된 신경 단위를 분리하고 식별 할 수있는 실험 후 데이터를 수집했습니다. 이러한 피크 또는 계곡 진폭, 최대 반폭 등의 스파이크 모양, 또는 감소 조치에 따라 별도의 파형, 또는 &quot;스파이크&quot;(주요 구성 요소) 17 일반적인 소프트웨어 프로그램을 (오프라인 정렬 기, MClust 및 SClust)를 사용 18 (그림 2). 3 차원 공간에서 분리 (PC1-PC3)과 서로의 통계적 다른 것을 스파이크의 만 클러스터를 사용합니다 (변수 ANOVA, P &lt;0.05) (그림 2) 추가 분석을 위해. 를 참조하십시오tetrode 기록과 스파이크 - 정렬 방법에 대한 자세한 설명을위한 인용 # S 17-19. </li><li> 시간 스탬프 각 클러스터에 스파이크하고, 래스터 플롯과 발사 속도 응답 (도 2, 3A)를 만들 MATLAB 또는 Neuroexplorer을 (Nex 기술, 윈스턴 세일럼, NC)를 사용하여 분석을 위해 이러한 데이터를 내보낼 수도 있습니다. </li><li> 동시에 기록 GC 데이터를 사용 휘발성 물질의 유지 시간을 확인합니다. 그 시간 지점에서 단위 반응을 검사 할 크로마토 그램의 피크의 꼭대기에 의해 결정 휘발성 물질의 보유 시간을 사용합니다. </li><li> GC 실행을 통해 각 단위 반응을 확인하려면, 100 밀리 초 간격으로 스파이크의 개수 및 bin 및 휘발성 물질을 용출의 보존 기간을 참조하여 속도 응답을 해고의 시간 과정을 검토합니다. 100 밀리 초 간격의 스파이크의 binning는 GC에서 용출 odorant에 neuronal 응답의 시간 코스에 대해, 충분히 상세하게, 또는 신호를 제공합니다. </li><li> EXA에다른 용출의 휘발성 물질에 인구 응답을 채굴, 전에 3 초 샘플링 창을 통해 1.5 초를 개별 단위의 발사 속도 응답을 통합하고, 1.5 초 후의 보존 기간 휘발성 (그림 3). 이 기간은 GC에서 휘발성 용출 기간의 전형적인 있습니다. 및 (열) GC 유출에 앙상블 응답을 나타내는 각 행과 활동 매트릭스로를 준비하고 (; 우리는이 색상 코딩을 (파란색은 낮은 응답입니다 빨간색이 높은 발사 속도 응답이다) 단위의 속도 응답을 발사 보여 그림 3). </li></ol>

<ol><li>Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory%3A+converging+evidence+for+common+principles+across+phyla%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla.</a> Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).</li>
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<li>Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+behavior+in+the+moth+Manduca+sexta+in+response+to+complex+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).</li>
<li>Raguso, R. A., Pellmyr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+headspace+analysis+of+floral+volatiles%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods.</a> Oikos. 81, 238-254 (1998).</li>
<li>Rodriguez-Saona, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore-induced+blueberry+volatiles+and+intra-plant+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling.</a> J Vis Exp. , e3440(2011).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. , e1098(2009).</li>
<li>Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+large-scale+neuronal+ensembles+with+silicon+probes+in+the+anesthetized+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat.</a> J Vis Exp. , e3282(2011).</li>
<li>Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+representation+of+olfactory+mixtures+in+the+honeybee+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe.</a> European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).</li>
<li>Stökl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deceptive+pollination+system+targeting+drosophilids+through+olfactory+mimicry+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast.</a> Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).</li>
<li>Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elektrophysiologische+untersuchungen+von+chemo-+und+mechanorezeptoren+der+antenne+des+seidenspinners+Bombyx+mori+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).</li>
<li>Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroantennographic+detector%3A+a+selective+and+senstitive+tool+in+the+gas+chromatographic+analysis+of+insect+pheromones%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones.</a> Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).</li>
<li>Schneider, D., Boeckh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rezeptorpotential+und+nervenimpulse+einzelner+olfaktorischer+sensillen+der+insektenantenne%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).</li>
<li>Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+perception+of+oilseed+rape+Brassica+napus+%28Brassicaceae%29+volatiles+by+the+cabbage+seed+weevil+Ceutorhynchus+assimilis+%28Coleoptera%2C+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).</li>
<li>Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+natural+stimuli+in+the+rodent+main+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb.</a> Neuron. 50, 937-949 (2006).</li>
<li>Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+patterns+and+their+functional+implications+in+the+antennal+lobe+of+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> PLoS ONE. 6, e23382(2011).</li>
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</ol>

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곤충 후각로 인한 행동이 복제, 호스트 사이트 선택, 적절한 음식 자원의 식별 등을 포함하여 다양한 프로세스를 운전합니다. 이러한 프로세스의 연구는 소스뿐만 아니라 행동을 중재 아르 이러한 화합물을 식별 할 수있는 능력에서 방출 된 휘발성 물질을 식별 할 수있는 능력이 필요합니다. 문제를 복잡하게하는 것은 냄새가 함께 각각의 성분 6,7,13,19,20 다르게 인식되고 독특한 향을 만들어 각각의 화합물의 수백 수십 구성된다는 것입니다. 처음 성 페로몬 시스템 12 실시 연구, 그리고 더 최근의 식품 및 산란 관련 냄새 13,20에서, 혼합물의 행동 효과는 혼합에 몇, 주요 휘발성 물질의 함수로 거주하는 것으로 나타하고 있습니다 혼합물은 개별 성분보다 훨씬 더 큰 행동 반응을 이끌어내는 것을. 그 키를 식별성분 따라서 현대 화학 생태뿐만 아니라 후각 신경 생물학의 중요한 구성 요소입니다. 기술의 다양한 곤충의 행동을 유...

<table border="1"><tbody><tr><td> 항목의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Porapak 타입 Q 80-100 메쉬 </td><td> 워터스 </td><td> WAT027060 </td><td></td></tr><tr><td> 레이놀즈 오븐 가방 </td><td> 레이놀즈 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GC </td><td> 애질런트 </td><td> 7820A </td><td></td></tr><tr><td> GC 컬럼 </td><td> J &amp; W 과학, Folsom, CA, USA </td><td> DB-5 (30m, 0.25 mm, 0.25 μm) </td><td></td></tr><tr><td> 분석 헬륨 캐리어 가스 </td><td> Praxair </td><td> HE K </td><td> 한 참조 / 분 </td></tr><tr><td> 16 채널 실리콘 전극 </td><td> Neuronexus Technologies </td><td> a4x4-3mm50-177 </td><td></td></tr><tr><td> 정밀 와이어 NiCr, 0.012 mm 직경) </td><td> Sandvik Kanthal HP 리드 </td><td> PX000004 </td><td> 사용자 정의 tetrodes 및 stereotrodes을 만들기위한 </td></tr><tr><td> 사전 증폭기 </td><td> 터커 - 데이비스 시스템 </td><td> PZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> 증폭기 </td><td> 터커 - 데이비스 시스템 </td><td> RZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 시스템 - OpenEx 스위트 </td><td> 터커 - 데이비스 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 온라인 스파이크 - 정렬 소프트웨어 - SpikePac </td><td> 터커 - 데이비스 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 오프라인 스파이크 - 정렬 소프트웨어 - Mclust 스파이크 - 정렬 도구 상자 </td><td> 데이비드 Redish, 신경 과학, 대학학과미네소타 </td><td> 에서 무료로 다운로드 <a href="http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html" target="_blank">http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html</a> </td><td> MATLAB 도구 상자 </td></tr></tbody></table>

곤충 antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (gcmr)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

모든 생물은 환경에 자신의 행동 및 생리적 반응을 결정하는 감각 자극으로 가득 찬 세상을 살고 있습니다. 후각은에 응답하고, 사이, 복잡한 냄새 자극을 차별하기 위해 후각 시스템을 사용 곤충에 특히 중요합니다. 이 냄새는 재생산 및 서식지 선택 1-3로 프로세스를 중재하는 행동을 이끌어내는. 또한, 수분 4-6 식품 작물 7 herbivory, 질병 8,9의 전송을 포함하여 농업과 인간의 건강을 위해 매우 중요 곤충의 mediates 동작에 의한 화학 감지. 후각 신호와 곤충 행동에서의 역할 확인은 생태 학적 프로세스와 인간의 음식 자원과 웰빙을 모두 이해하는 따라서 중요합니다. 현재까지, 곤충의 행동을 유도 휘발성 물질의 식별이 어렵고 종종 지루한했다. 현재 기술은 다음과 같습니다가스 크로마토 그래피 결합 electroantennogram 기록 (GC-EAG) 및 가스 단일 sensillum 레코딩 (GC-SSR) 10-12를 크로마토 그래피 - 커플 링. 이 기술은 bioactive 화합물의 식별에 중요한 것으로 판명. 13,14, 우리는 antennal 엽에있는 뉴런 (곤충의 기본 후각 센터 AL)에서 멀티 채널 electrophysiological 레코딩 ( &#39;GCMR&#39;이라고한다)에 커플 링 된 가스 크로마토 그래피를 사용하는 방법을 개발했습니다. 이 최신 기술은 우리가 냄새 정보가 곤충 뇌에 표시하는 방법을 조사 할 수 있습니다. 후각 처리의 수준 냄새에 신경 응답이 AL의 뉴런에 안테나의 수용체 뉴런의 수렴의 정도에 매우 민감 인하여 때문에 또한, AL 녹음은 자연 냄새 효율적이고 고감도로의 활성 성분의 검출을 할 수 있습니다. 여기 GCMR을 설명하고 사용 예를 제공합니다. 몇몇 일반적인 단계는 invol 아르bioactive 휘발성 물질과 곤충 응답의 검출에 ved. 휘발성 물질 먼저 관심 소스에서 수집 (이 예에서 우리는 속 Mimulus (Phyrmaceae)에서 꽃을 사용) 및 표준 GC-MS 기술에게 14-16를 사용하여 필요에 따라 특징해야합니다. 곤충은 기록 전극이 신경 녹음이 시작 antennal 엽 및 다중 채널에 삽입 된 후, 최소한의 절개를 사용하여 학습을위한 준비가되어 있습니다. 신경 데이터의 후 처리는 특정 odorants는 곤충 신경계에서 중요한 신경 반응의 원인이되는 드러내고있다. 우리가 여기에 제시 예는 수분 연구에 특정한이지만, GCMR는 연구 생물 및 휘발성 소스의 광범위한 확장 할 수 있습니다. 예를 들어,이 방법은 odorants 벡터 곤충, 농작물 해충을 끌거나 repelling의 식별에 사용할 수 있습니다. 또한, GCMR는 또한 PO 등의 유익 곤충에 대한 attractants를 식별하는 데 사용할 수 있습니다llinators. 기술은뿐만 아니라 비 곤충 분야로 확대 할 수 있습니다.

M.를 사용하여 GCMR 분석에서 lewisii 꽃 향기가, 우리는 GC에 추출물의 3 μl를 삽입. GC를 통해 용출 휘발성 물질의 총 수는 일반적으로 60-70 휘발성 물질입니다. M.의 향기 lewisii는 주로 여섯 탄소 등 2 헥산 올과 같은 휘발성 물질, 그리고 천정 공간의 &lt;1 %를 구성하는 sesquiterpenoids로 구성된 향기의 나머지 부분과 함께, β-myrcene (acyclic)와 α-피넨 포함 monoterpenoids로 구성되어 있습니다. GCMR는 antennal 엽의 뉴런의 감도뿐만 아니라 생물학적으로 중요한 휘발성 물질의 neuronal 처리를 활용합니다. 그러나,이 자연의 멀티 채널 녹음이 효과에 antennal 엽에있는 뉴런의 무작위 표본을 채취하시면됩니다. 다른 준비 사이의 프로브 위치의 위치에 약간의 변화가 기록 배열이 다른 뉴런를 ...

후각 신호는 곤충의 여러 가지 행동을 중재하고, 휘발성 화합물의 수백 수십 구성 종종 복합 혼합물이다. 곤충 antennal 엽의 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 bioactive 화합물의 식별하는 방법을 설명합니다.

곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

모든 생물은 환경에 대한 행동 및 생리적 반응을 결정하는 감각 자극으로 가득 찬 세상에 살고 있습니다. 후각은...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 범블비 뇌의 기록을 통해 복합 향기 중에서 생물학적으로 유효한 후각 자극 물질을 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 행동학적으로 유효한 향기를 수집하고, 둘째로 가스 크로마토그래피와 다채널 기록 시스템을 실험에 맞게 준비합니다. 세 번째 단계는 안테나 엽의 신경 기록을 위해 범블비의 뇌를 준비하고 해부하는 것입니다.그런 다음 안테나 엽에 전극을 삽입하여 실험을 수행하고, 복합 향기와 그 개별 구성 성분에 대한 신경 활동 분석을 통해 분사된 휘발성 물질에 대한 반응을 측정합니다. 가스 크로마토그래피로 얻은 생물학적 활성 취기질을 식별할 수 있습니다. 따라서 G-C-E-A-G와 같은 다른 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 안테나 부하 뉴런의 민감도와 뇌의 뉴런이 특정 꽃 휘발성 물질에 어떻게 반응하는지 특성화할 수 있는 능력에 있습니다.전기생리학적 준비 기록 기술과 헤드스페이스 휘발성 물질 수집에 필요한 단계들로 인해 전기생리학 및 화학적 분석 단계를 결합한 과정을 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 기술은 뒤영벌의 후각 처리 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 모기나 침노린재와 같은 질병 매개체 또는 진딧물이나 나방과 같은 농작물 해충과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 위해, 마이크로 매니퓰레이터 상에 텅스텐 와이어로 제작된 참조 전극을 준비하십시오.마이크로 매니퓰레이터는 코일 와이어, tede 또는 실리콘 다채널 전극과 같은 다채널 전극을 갖추고 있으며, 이는 차폐된 BNC 테이블에 출력이 연결된 가스 크로마토그래프가 있는 프리앰플리파이어에 연결되어 있습니다. GC 검출기의 출력은 증폭기 및 데이터 수집 시스템과 인터페이스되어 신경 신호와 GC 신호가 모두 동기화됩니다. 이 예시에서 GC 운반 가스는 헬륨이며, DB five GC 컬럼을 사용합니다.GC는 온도가 200 °C로 설정된 split list inlet을 사용하며, 불꽃 이온화 검출기(FID)의 온도는 230 °C로 설정되어 있습니다. 샘플이 GC 내에서 가열된 후, 컬럼에서 나오는 유출물은 유리 Y 커넥터를 통해 불꽃 이온화 검출기와 B 안테나로 1:1 비율로 분할됩니다. 본 예시에서 GC는 캘리포니아 자생 고산 야생화인 Mimus lewisii 꽃에서 동적 흡착법으로 수집한 휘발성 물질을 전달하는 데 사용됩니다.또는 gc를 사용하는 대

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연구

JoVE Journal

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신경과학

odorants에 후각 감각 뉴런의 Electrophysiological 반응은 단일 sensillum 레코딩을 사용하는 곤충에서 측정할 수 있습니다. 이 비디오를 문서에서 우리는 식초 파리의 안테나에서 단일 sensillum 레코딩을 수행하는 방법을 보여줍니다 것입니다...

곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae</em

Multielectrode 어레이 (MEA) 녹음 뉴런의 대규모 인구의 전기적 활동을 연구하는 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 동시에 조직을 자극하는 동안 마우스 vomeronasal 상피에서 기록 MEA 준비의 세부 사항을 제시한다.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

곤충 후각 시스템은 electroantennograms (EAG)와 안테나에 위치한 모든 odorant 수용체 뉴런 (ORNs)에서 개별 안에 보관되어과는 반응을 표현하는 아르 단일 sensillum 레코딩 (SSR)의 형태로 기록 odorant 유발 반응에 대한 독특한 기회를 제공 각각 sensilla.

모쓰 강한 시스템에서 Electrophysiological 측정

성인 배꼽 orangeworm의 electrophysiological 응답 (측정하여 빠르게 화면 호스트 식물의 휘발성 물질에 대한...

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

우리는 자율 로봇에서 EAG(electroantennogram) 형태로 곤충 안테나를 사용하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 당사의 실험적인 설계로 하루 이내에 안정적인 녹음이 가능하며 최대 10Hz까지 개별 냄새 패치를 해결할 수 있습니다. 후각 검색을위한 EAG 센서의 효율성은 로봇을 냄새 소스로 운전하는 것으로 입증됩니다.

후각 검색을위한 자율 로봇에 곤충 Electroantennogram 센서를 사용하여

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다.

에서 전기 생리 학적 기록<em&gt; Drosophila</em&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla

개미 종 Colobopsis explodens 의 작은 노동자는 가스 크로마토그래피-질량 분석에 의해 이후 용 매 추출 및 분석에 대 한 그들의 hypertrophied 악의 선 저수지에 저장 된 왁 스와 같은 콘텐츠를 분리 해 부. 주석 및 오픈 소스 소프트웨어 MetaboliteDetector를 사용 하 여 휘발성 성분의 식별도 설명 되어 있습니다.

악의 선 저수지 내용 보에서의 절연 ' 개미 (Formicidae) GC-MS와 MetaboliteDetector Volatilome 분석에 대 한 폭발

이 종이에 곤충 mouthparts의 palps sensilla basiconica에서 단일 sensillum 기록에 대 한 상세 하 고 매우 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

메뚜기 벨 Sensilla Basiconica에 대 한 단일 Sensillum 녹음

여기서, 우리는 비파괴 샘플링 절차를 사용하여 꽃꽃에서 꽃 향기 휘발성을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.

GC-MS 열 탈착 샘플링을 위한 헤드스페이스 휘발성 수집 기법을 사용한 신속한 플로랄 향수 휘발성 수집

순수, odorant 수용 체 odorant 분자 수증기 단계에서 흡입에 의해 활성화 됩니다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 시스템 활용 액체 단계 odorant 자극. 여기, 선물이 odorant 자극 기상에 따라 odorant 수용 체 활성화의 실시간 생체 외에서 모니터링 수 방법.

실시간 체 외 Odorant 수용 체 활성화는 Odorant 수증기 단계에서의 모니터링

배우세요 곤충의 후각 정보 처리를 위한 가스 크로마토그래피-다중유닛 기록법을 사용하여 생물학적으로 활성인 휘발성 물질을 식별하는 방법입니다. 이 기술은 뇌 신경 반응을 측정하여 곤충 행동에 영향을 미치는 냄새 분자를 정밀하게 분석할 수 있습니다.

곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

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