곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

본 실험 절차의 전반적인 목표는 범블비 뇌의 기록을 통해 복합 향기 중에서 생물학적으로 유효한 후각 자극 물질을 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 행동학적으로 유효한 향기를 수집하고, 둘째로 가스 크로마토그래피와 다채널 기록 시스템을 실험에 맞게 준비합니다. 세 번째 단계는 안테나 엽의 신경 기록을 위해 범블비의 뇌를 준비하고 해부하는 것입니다.

그런 다음 안테나 엽에 전극을 삽입하여 실험을 수행하고, 복합 향기와 그 개별 구성 성분에 대한 신경 활동 분석을 통해 분사된 휘발성 물질에 대한 반응을 측정합니다. 가스 크로마토그래피로 얻은 생물학적 활성 취기질을 식별할 수 있습니다. 따라서 G-C-E-A-G와 같은 다른 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 안테나 부하 뉴런의 민감도와 뇌의 뉴런이 특정 꽃 휘발성 물질에 어떻게 반응하는지 특성화할 수 있는 능력에 있습니다.

전기생리학적 준비 기록 기술과 헤드스페이스 휘발성 물질 수집에 필요한 단계들로 인해 전기생리학 및 화학적 분석 단계를 결합한 과정을 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 기술은 뒤영벌의 후각 처리 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 모기나 침노린재와 같은 질병 매개체 또는 진딧물이나 나방과 같은 농작물 해충과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 위해, 마이크로 매니퓰레이터 상에 텅스텐 와이어로 제작된 참조 전극을 준비하십시오.

마이크로 매니퓰레이터는 코일 와이어, tede 또는 실리콘 다채널 전극과 같은 다채널 전극을 갖추고 있으며, 이는 차폐된 BNC 테이블에 출력이 연결된 가스 크로마토그래프가 있는 프리앰플리파이어에 연결되어 있습니다. GC 검출기의 출력은 증폭기 및 데이터 수집 시스템과 인터페이스되어 신경 신호와 GC 신호가 모두 동기화됩니다. 이 예시에서 GC 운반 가스는 헬륨이며, DB five GC 컬럼을 사용합니다.

GC는 온도가 200 °C로 설정된 split list inlet을 사용하며, 불꽃 이온화 검출기(FID)의 온도는 230 °C로 설정되어 있습니다. 샘플이 GC 내에서 가열된 후, 컬럼에서 나오는 유출물은 유리 Y 커넥터를 통해 불꽃 이온화 검출기와 B 안테나로 1:1 비율로 분할됩니다. 본 예시에서 GC는 캘리포니아 자생 고산 야생화인 Mimus lewisii 꽃에서 동적 흡착법으로 수집한 휘발성 물질을 전달하는 데 사용됩니다.

또는 gc를 사용하는 대신, 단일 휘발성 화합물이나 화합물 혼합물을 공기 펄스로 전달할 수 있습니다. 이는 화합물이 도포된 여과지 조각이 들어 있는 별도의 유리 주사기를 통해 분사됩니다. 공기 펄스는 컴퓨터로 제어되는 솔레노이드 활성 밸브를 사용하여 일정한 공기 흐름(Airstream)에서 전환됩니다.

1mL 피펫 팁의 끝부분에서 약 1cm를 잘라내어 준비를 시작합니다. 범블비를 피펫 팁의 바닥 쪽에 넣고, 머리 부분만 노출될 때까지 팁의 반대쪽 끝으로 조심스럽게 밉니다. 녹인 치과용 왁스를 사용하여 노출된 머리 주변에 몰드를 만듭니다.

왁스는 머리를 완전히 고정시키기 위해 겹눈에 밀착되어야 하지만, 필요한 경우 촉각에 닿지 않도록 주의해야 합니다. 작은 핀을 사용하여 촉각을 고정하십시오. 다음으로, 마이크로 메스와 같이 날카로운 칼날을 사용하여 머리 캡슐에 정사각형 창 모양의 절개창을 만듭니다.

더듬이 바로 뒤쪽과 겹눈 중 하나에 인접한 부위부터 절개를 시작하십시오. 양 눈 사이를 직선으로 절개합니다. 그다음, 머리 캡슐이 흉부로 굽어지는 지점까지 등쪽으로 절개하십시오.

두부 캡슐의 반대쪽 끝까지 절개를 계속합니다. 마지막으로 시작 지점까지 다시 절개하여 사각형 모양으로 자릅니다. 핀셋을 사용하여 큐티클을 제거합니다.

더듬이 인접 부위의 큐티클을 제거해야 하며, 그렇지 않으면 뇌가 노출되자마자 전극의 진입을 방해하게 됩니다. 즉시 곤충 생리식염수로 조직을 세척하십시오. 더듬이 엽(antenna lobes)이 충분히 노출되었는지 확인하십시오.

그런 다음 매우 미세한 핀셋을 사용하여 촉각 엽 바로 위의 신경초를 조심스럽게 제거합니다. 핀셋으로 벌의 뇌를 찌르지 않도록 각별히 주의하십시오. 이제 벌 표본이 전기생리학적 기록을 위한 준비가 되었습니다.

준비된 벌을 마그네틱 베이스에 고정된 클램프에 부착하는 것으로 시작합니다. 유량 제어기가 달린 저장조에서 공급되는 곤충용 식염수로 벌을 충분히 적신 상태로 유지하십시오. 이제 대조측 뇌 조직에 참조 전극을 삽입합니다.

다음으로, 벌의 안테나 엽에 다채널 전극을 삽입하십시오. 전극이 제자리에 위치하면, 기록이 안정화될 때까지 30분에서 60분 동안 기다리십시오.

이 시간 동안, 임계값 설정(thresholding)을 통해 뉴런의 세포외 스파이크(extracellular spikes)를 준비하십시오. 일부 기록 채널의 노이즈로 인해 개별 기록 채널에 대해 수동 임계값 설정이 필요할 수 있습니다. 다음으로, GC 분석의 온도 램프(temperature ramp)가 정확한지 확인하십시오.

본 예시에서는 온도가 50 °C에서 4분간 유지된 후, 분당 10 °C씩 상승하여 최종 온도인 220 °C에 도달하거나 또는 6분간 유지됩니다. 기록 채널에 있는 단위들의 파형 모양이 일관되게 나타나면 신경 기록이 안정된 것으로 간주합니다. 안정화가 되면 시린지에 꽃의 헤드스페이스 향료를 채우고 이를 gc의 헤드 주입구에 주입하십시오.

그 후 GC 분석이 완료되면 즉시 전극에서 기록을 시작하십시오. 표본을 5분에서 15분 동안 휴지시킵니다. 그 다음 GC에 다른 시료를 주입하거나, 단일 휘발성 화합물 또는 화합물 혼합물을 사용하여 표본을 자극하십시오.

자발적 활동이 어느 시점에서 갑자기 중단되거나 변화하는 경우, 식염수 점적 상태를 확인하고 표본을 15분 동안 안정시킵니다. 그 후에도 활동이 이전 수준으로 회복되지 않으면 해당 표본을 폐기하십시오. 실험 종료 후, 프로브가 조직에 삽입된 상태로 뇌를 고정하고, 뇌를 적출한 뒤 고정액을 제거하고 뇌를 탈수시킵니다.

그런 다음 공초점 현미경을 통해 mimus Luci 꽃향기에서 기록 채널의 위치를 식별할 수 있습니다. 휘발성 물질의 총 개수는 측정 과정을 통해 확인됩니다. GC 분석으로는 일반적으로 60에서 70가지 화합물이 검출됩니다.

Mimus Luci의 향은 주로 beta myosin과 alpha pinine을 포함한 모노 테르페노이드로 구성됩니다. 향의 나머지 성분은 6탄소 휘발성 물질로 이루어져 있습니다. 여러 준비물에 3 µL의 Mimus Lewis 안구 추출물을 사용하여 자극을 주었습니다.

다채널 전극으로 기록된 8개의 신경 단위 중 하나에서 얻은 이 기록은 뉴런이 특정 휘발성 물질에 얼마나 선택적으로 반응하는지를 보여줍니다. 이 예시에서는 해당 화합물인 dine이 표시되어 있습니다. 여기 8개 신경 단위의 반응이 나타나 있습니다.

전체 집단의 약 절반이 반응하지 않았습니다. 이는 꽃의 헤드스페이스에서 유출되는 휘발성 화합물의 다양성을 고려할 때 놀라운 결과이지만, 여러 준비 과정에서 일관되게 나타났으며 다른 연구에서도 보고된 바 있습니다. 반응하는 유닛들의 정규화된 발화율은 특정 그룹의 취기 물질에 대해 강한 선택성이 있음을 보여줍니다.

화살표로 표시된 냄새 물질들이 가장 강력한 반응을 유도했습니다. 이들은 demine과 trans beta osain입니다. 따라서 이 영상을 시청한 후에는 실험을 위해 곤충을 준비하는 방법과 다채널 기록 장치가 연결된 가스 크로마토그래피를 사용하여 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

따라서 목표는 복잡한 향기 성분 조합 중에서 행동 유발 효과가 있을 것으로 추정되는 휘발성 물질을 식별하는 것입니다. 이 기술을 숙달하고 본 절차를 적절히 따르면 2~3시간 내에 수행할 수 있습니다. 식별된 휘발성 물질이 곤충의 행동 반응을 매개하는 효능을 완전히 결정하기 위해, 해당 물질을 이용한 행동 테스트와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.