February 24th, 2013
후각 신호는 곤충의 여러 가지 행동을 중재하고, 휘발성 화합물의 수백 수십 구성 종종 복합 혼합물이다. 곤충 antennal 엽의 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 bioactive 화합물의 식별하는 방법을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 호박벌 뇌의 기록을 통해 복잡한 의미에서 생물학적으로 효과적인 냄새 물질을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 행동 효과 감각을 수집하고, 두 번째로 실험을 위해 가스 크로마토그래프와 다중 채널 기록 시스템을 준비함으로써 달성됩니다. 세 번째 단계는 공장 엽의 안테나에 있는 신경 기록을 위해 호박벌의 뇌를 준비하고 해부하는 것입니다.
그런 다음 전극을 안테나 로브에 삽입하고 복잡한 감각과 개별 구성 요소에 대한 반응으로 신경 활동을 분석하여 팽창된 휘발성 물질에 대한 반응을 측정하여 실험을 수행합니다. 가스 크로마토그래피로 얻은 생물학적 활성 냄새 물질을 확인할 수 있습니다. 따라서 G-C-E-A-G와 같은 다른 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 안테나 부하 뉴런의 민감도와 뇌의 뉴런이 특정 꽃 휘발성 물질에 어떻게 반응하는지 특성화할 수 있는 능력입니다.
전기생리학적 준비, 기록 기술 및 헤드스페이스 휘발성 물질을 수집하는 데 필요한 단계로 인해 결합된 전기생리학적 및 화학적 분석 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 기술은 호박벌의 후각 처리에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 모기나 키스 벌레와 같은 질병 요인이나 진딧물이나 나방과 같은 작물 해충과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 위해 두 번째로 마이크로 매니퓰레이터에 텅스텐 와이어로 만든 기준 전극을 준비했습니다.
마이크로 매니퓰레이터는 프리 앰프에 연결된 코일 와이어, 테데 또는 실리콘 다중 채널 전극과 같은 다중 채널 전극을 가지며 차폐 된 BNC 테이블에 출력이있는 가스 크로마토 그래프를 가지고 있습니다. GC 검출기의 출력은 증폭기 및 데이터 수집 시스템과 인터페이스되어 신경 신호와 GC 신호가 모두 동기화됩니다. 이 예에서 GC 운반 가스는 헬륨이며 DB 5 GC 컬럼에 있습니다.
GC는 온도가 섭씨 200도로 설정된 분할 목록 입구를 사용하고 화염 이온화 검출기 온도가 섭씨 230도로 설정되어 있습니다. 샘플이 gc에서 가열된 후, 컬럼의 폐수는 유리 y 커넥터를 사용하여 화염 이온화 검출기와 B 안테나 사이에서 일대일로 분할됩니다. 이 예에서 GC는 캘리포니아가 원산지인 고산 야생화인 Mimus Lewis 눈 꽃에서 동적 흡수에 의해 수집된 휘발성 물질을 전달하는 데 사용됩니다.
대안적으로, gc를 사용하는 대신에, 단일 휘발성 화합물 또는 화합물의 혼합물을 공기 펄스에 의해 전달할 수 있다. 화합물이 증착된 여과지 조각이 들어 있는 별도의 유리 주사기를 통해 촬영합니다. 공기 펄스는 컴퓨터에 의해 제어되는 솔레노이드 활성화 밸브를 사용하여 일정한 기류에서 전환됩니다.
1 밀리리터 피펫 끝에서 약 1cm를 잘라 준비를 시작하십시오. 호박벌을 피펫 팁 바닥에 놓고 머리만 노출될 때까지 팁의 반대쪽 끝으로 부드럽게 밉니다. 녹인 치과용 왁스를 사용하여 노출된 머리 주위에 주형을 만듭니다.
왁스는 머리를 완전히 고정시키기 위해 겹눈에 부착되어야 하지만 필요한 경우 안테나에 접촉해서는 안 됩니다. 작은 핀을 사용하여 안테나를 고정시킵니다. 그런 다음 마이크로 메스 등 날카로운 칼날을 사용하여 머리 캡슐에 절개 같은 사각형 창을 만듭니다.
안테나 바로 뒤와 겹눈 중 하나에 인접한 절단을 시작합니다. 눈 사이를 직선으로 자릅니다. 다음으로, 머리 낭이 흉부로 구부러질 때까지 등쪽으로 자릅니다.
헤드 캡슐의 반대쪽 끝으로 절단을 계속합니다. 마지막으로 사각형을 완성하기 위해 시작 부분으로 잘라냅니다. 집게를 사용하여 큐티클을 제거합니다.
안테나에 인접한 큐티클을 제거해야 하며, 그렇지 않으면 뇌가 노출되자마자 전극을 방해하게 됩니다. 즉시 조직을 곤충 식염수로 슈퍼 융합하십시오. 안테나 로브가 잘 노출되어 있는지 확인하십시오.
그런 다음 한 쌍의 매우 미세한 집게를 조심스럽게 사용하여 안테나 엽 바로 위의 신경 주위 덮개를 제거합니다. 집게로 꿀벌의 뇌에 구멍을 뚫지 않도록 각별히 주의하십시오. 이제 꿀벌 준비는 전기 생리학적 기록을 위한 준비가 되었습니다.
준비된 꿀벌을 마그네틱베이스에 고정된 클램프에 부착하는 것으로 시작합니다. 유량 컨트롤러가 있는 저수지에서 전달되는 곤충 식염수와 융합된 상태로 유지하십시오. 이제 기준 전극을 반대쪽 뇌 조직에 삽입합니다.
다음으로, 다채널 전극을 꿀벌의 안테나 로브에 삽입합니다. 전극이 제자리에 있을 때. 녹음이 안정화될 때까지 30-60분 정도 기다립니다.
이 기간 동안, 역치를 통해 뉴런의 세포 외 스파이크에 대비하십시오. 개별 녹음 채널 녹음 채널의 노이즈로 인해 일부 채널의 경우 수동 임계값이 필요할 수 있습니다. 다음으로, GC 실행의 온도 램프가 올바른지 확인합니다.
이 예에서 온도는 섭씨 50도에서 4분 동안 시작한 다음 분당 10도씩 증가하여 최종 온도가 섭씨 220도가 되거나 6분 동안 유지됩니다. 기록 채널에 있는 단위의 파형 모양이 일관되면 신경 기록이 안정적인 것으로 간주됩니다. 안정화되면 주사기에 꽃 헤드스페이스 냄새를 넣고 GC의 헤드 주입구에 냄새를 주입합니다.
그런 다음 GC 실행이 완료된 후 즉시 전극에서 기록을 시작합니다. 5분에서 15분 동안 준비를 그대로 두십시오. 그런 다음 다른 샘플을 GC에 주입하거나 단일 휘발성 화합물 또는 화합물 혼합물을 사용하여 준비물을 자극합니다.
어느 시점에서든 자발적인 활동이 갑자기 멈추거나 변하면 식염수 방울을 확인하고 15분 동안 제제를 그대로 두십시오. 그런 다음 활동이 이전 수준을 회복하지 못하면 제제를 버리십시오. 실험이 끝나면 조직에 프로브가 남아 있는 상태에서 뇌를 고정한 다음 뇌를 절제하고 고정제를 제거하고 뇌를 탈수시킵니다.
그런 다음 녹음 채널의 위치를 mimus Luci 꽃 향기의 컨포칼 현미경으로 식별할 수 있습니다. 약탈하는 휘발성 물질의 총 수입니다. GC는 일반적으로 60에서 70 사이의 화합물입니다.
Mimus Luci의 향기는 주로 베타 미오신 (beta myosin)과 알파 피닌 (alpha pinine)을 포함한 모노 테르 페 노이드로 구성되어 있습니다. 나머지 냄새는 6개의 탄소 휘발성 물질로 구성되어 있습니다. Mimus Lewis 눈 추출물 3마이크로리터로 여러 제제를 자극했습니다.
다채널 전극에 의해 기록된 8개의 신경 단위 중 하나에서 기록한 이 기록은 뉴런이 특정 휘발성 물질과 얼마나 선택적으로 경쟁하는지를 보여줍니다. 이 예에서 dine은 표시된 화합물입니다. 다음은 8가지 신경 단위의 응답입니다.
앙상블의 약 절반이 반응이 없었습니다. 이것은 꽃 머리 공간에서 암시된 휘발성 화합물의 다양성을 감안할 때 놀라운 일이지만, 이는 제제 간에 일관되며 다른 연구에서도 보고되었습니다. 반응 단위의 정규화된 발사 속도는 냄새 물질 그룹에 대한 강한 선택성이 있음을 보여줍니다.
화살표로 강조 표시된 냄새 물질은 가장 강력한 반응을 이끌어냈습니다. 이들은 데민(demine)과 트랜스 베타 오사인(trans beta osain)입니다. 따라서 이 비디오를 시청한 후에는 곤충이 실험을 위해 준비한 다음 다중 채널 기록과 함께 가스 크로마토그래피를 사용하여 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
그런 다음 목표는 복잡한 꽃다발에서 행동에 효과적인 것으로 추정되는 냄새 물질을 식별하는 것입니다. 이 기술을 숙달하면 이 절차를 따라 적절하게 수행하면 2-3시간 내에 수행할 수 있습니다. 곤충의 행동 반응을 매개하는 휘발성 물질의 효능을 완전히 결정하기 위해 확인된 냄새 물질에 대한 행동 테스트와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
본 연구는 곤충에서 생물학적으로 활성적인 냄새 물질을 식별하는 데 중점을 두며, 특히 말벌의 뇌에서 기록을 통해 이루어집니다. 이 방법은 행동과 관련된 냄새를 수집하고 이러한 복잡한 혼합물에 대한 신경 반응을 분석하는 것을 포함합니다.
Identifying bioactive volatiles that drive insect behavior is critical for agricultural biotechnology and vector control programs. The GCMR technique enables high-sensitivity detection of behaviorally active compounds by linking chemical analysis with neural responses in the insect brain. This supports target validation and assay development for pest management and pollinator attraction strategies.
The GCMR method fits within the discovery continuum from early target identification to lead optimization, particularly for behavior-modulating compounds in agricultural and public health applications.