표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우
October 30th, 2012
관할 transmembrane 수용체를 신호 소설의 식별을위한 높은 콘텐츠를 심사 방법은 설명되어 있습니다. 이 방법은 대규모 자동화 의무가 있으며, 수에 대한 예측 생체 내 단백질 바인딩과 포유류의 세포에 단백질 단지의 하위 세포 현지화.
다음 실험의 전반적인 목표는 CD NA 발현 클로닝 및 Grab two로 태그된 녹색 형광 단백질의 변화 관찰을 통해 Grab two의 상호 작용 파트너를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 두 번째 단계로 박테리아 용해물에서 CD NA 라이브러리를 준비함으로써 달성됩니다. CDNA는 인간 배아 신장 세포에서 transfection되며, 이는 관심 유전자와 함께 리포터 구조체의 발현을 초래할 것입니다.
다음으로, 형질주입된 플레이트는 세포 전체에 걸쳐 2개의 국소화를 잡는 변화를 시각화하기 위해 오페라 현미경에서 분석되며, 표피 성장 인자 수용체가 GFP의 모집을 매개하는 것을 보여주는 결과가 얻어집니다. 형광 현미경 검사법을 기반으로 한 엔도솜 2개를 잡습니다. 이 두 가지 하이브리드와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 상호 작용 파트너의 세포 내 분포를 고려하는 생리학적 상황에서 그랩 2의 상호 작용 파트너를 식별할 수 있다는 것입니다.
글쎄요, 이 방법은 Grab two에 의한 신호 전달을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 관심 있는 다른 단백질과 같은 다른 시스템에 적용할 수도 있습니다. CDNA 라이브러리에는 글리세롤 스톡에 단일 박테리아 클론이 제공됩니다.
Hudson Rapid pick light의 피커 메뉴에서 reray 명령을 사용하는 96 웰 형식. 소스 플레이트에서 박테리아 클론을 선택하고 96 딥 웰 플레이트에서 1.5 밀리리터 lb amp에 접종합니다. 가스 투과성 밀봉으로 딥 웰 플레이트를 늦게 밀봉하고 셰이커에서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.다음 날 박테리아 A 2000RPM이 포함된 딥 웰 플레이트를 20분 동안 돌립니다.
탁상용 원심분리기의 플레이트 어댑터를 사용하여 웰에서 매체를 흡입하여 박테리아 펠릿을 그대로 유지합니다. 그런 다음 다음과 같이 Tecan Freedom Evo Automation 워크스테이션의 데크를 구성합니다. 플라스미드 준비를 위한 용액을 1-5개의 트로프에 분배하고 데크에 깊은 웰 플레이트를 놓습니다.
딥 웰 플레이트 로드 팁에 인접한 alucian 용액이 있는 다중 웰 트로프를 팁 랙에 놓습니다. 진공 매니폴드를 조립합니다. 플라스미드 결합 플레이트는 매니폴드 내부에 배치되고 플라스미드 필터 플레이트는 매니폴드 Resus 서스펜션 펠릿 위에 250마이크로리터의 용액 1이 배치됩니다.
Resus 서스펜션은 위아래로 피펫팅하여 버퍼를 만듭니다. 펠릿이 완전히 재현탁되었는지 확인하는 것이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다. 셰이커는 위아래로 쓰다듬어도 펠릿이 완전히 다시 부유하지 않는 경우 사용할 수 있습니다.
펠릿이 완전히 재현탁되면 용해 완충액에 250마이크로리터의 용액을 추가하여 박테리아가 잠자리게 됩니다. 플레이트를 밀봉하고 뒤집어 완전한 혼합을 허용합니다. 타이머를 2분으로 설정합니다.
다음으로 350마이크로리터의 용액 3을 추가합니다. 중화 버퍼입니다. 플레이트를 밀봉하고 세 번 선을 뒤집습니다.
박테리아 용해물을 플라스미드 필터 플레이트로 옮깁니다. 5분 동안 진공 청소기를 적용합니다. 필터 플레이트를 제거하고 매니폴드 위에 바인딩 플레이트를 놓습니다.
1분 동안 진공 청소기를 적용합니다. 500마이크로리터의 추가 세척 버퍼를 추가하고 2분 동안 진공 청소기를 적용합니다. 900마이크로리터의 세척 완충 용액 4개를 넣고 2분 동안 진공 청소기를 적용합니다.
그 후, 900 마이크로 리터의 세척 완충 용액 4를 다시 넣고 15 분 동안 진공을 적용합니다. DNA 수집 플레이트를 매니폴드 내부에 놓습니다. 100마이크로리터의 Elucian 완충액을 바인딩 플레이트에 추가하고 2분 동안 배양합니다.
10분 동안 진공 청소기를 적용합니다. 마지막으로 수집 플레이트를 제거하고 NanoDrop 8, 000을 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 일반적으로 이 절차를 시작하기 위해 이 방법으로 마이크로리터당 약 100나노그램의 수율을 기대할 수 있습니다.
hec 2 9 3 세포가 트립되고 측정되고 계수됩니다. 자동 디스펜서를 사용하여 4개의 셀에 10을 두 번 분배하여 Perkin Elmer의 각 웰에 분배합니다. View plate는 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하고 5%의 이산화탄소를 주입하여 transfection을 수행합니다.
자동 액체 처리기를 사용하여 둥근 바닥 96, 웰 플레이트 100나노그램의 GFP의 각 웰에서 다음 혼합물을 준비합니다. 25마이크로리터의 무혈청 배지에 100나노그램의 CD NA가 포함된 2개의 플라스미드 DNA를 채취합니다. 다음으로, 웰당 0.5마이크로리터 트랜스펙트를 포함하는 25마이크로리터의 무혈청 배지를 추가하고 30분 동안 타이머를 시작합니다.
30분 후, 믹스 상태의 CDNA transfection에서 50마이크로리터를 세포로 이동시킵니다. 부드러운 디스펜싱 방법을 사용합니다. 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.
이미지 획득을 시작하려면 Opera 소프트웨어를 시작하십시오. 구성 탭을 선택하고 20배 대물렌즈와 올바른 플레이트 유형을 선택합니다. 다양한 플레이트 유형으로 초점을 맞출 수 있도록 칼라가 대물렌즈에서 올바른 값으로 설정되어 있는지 확인하십시오.
그런 다음 현미경 탭을 선택합니다. 노출 1을 fite 4 88 laser로 정의하고 노출 2를 UV 365 laser로 정의합니다. 두 노출 모두에서 UV 필터를 활성화하고 노출을 할당합니다.
하나는 카메라로, 하나는 노출입니다. 2에서 2로. 노출 시간을 노출의 경우 800밀리초, 노출의 경우 1밀리초 및 40밀리초로 설정합니다.
둘째, 노출을 선택하고 하나는 초점 높이를 0 미크론으로 설정합니다. 초점이 맞춰지면 초점을 선택합니다. 카메라 1을 노출시킵니다.
초점 높이를 조정하여 노출 평면을 최적화하고 테이크 높이를 클릭합니다. 노출 매개변수를 저장하고 노출을 위해 반복합니다. 둘째, 실험 정의 탭을 선택하고 레이아웃 및 하위 레이아웃을 만듭니다.
관련 레이아웃, 노출, 참조 이미지, 기울이기, 자르기 파일 및 하위 레이아웃을 끌어다 놓습니다. 실험을 저장합니다. 자동 실험(automatic experiment) 탭을 선택하고 정상 조건에서 이미지를 획득합니다.
그랩 2는 전체 셀에 걸쳐 국한됩니다. 성장 인자 수용체(growth factor receptor)가 자극을 받으면 원형질막(plasma membrane)으로 전위되고 이후 엔도솜(endosome)으로 내재화됩니다. 이 그림에서 상단 패널은 GFP로 일시적으로 transfection된 6개의 세포를 보여주며, 예상대로 형광이 세포 전체에 분포되어 있습니다.
그러나 GFP로 일시적으로 transfection된 세포에서 세포 표면 수용체 IT EGFR grab two는 하단 패널에서 볼 수 있듯이 엔도솜과 같은 구조로 재배치됩니다. 따라서, 게놈 와이드 라이브러리를 적용할 때, 새로운 그랩 2 결합 세포 표면 단백질을 확인할 수 있을 것으로 기대할 수 있습니다. 이 방법은 세포 표면 단백질의 검출에 국한되지 않습니다.
예를 들어, 그랩 2 매개 내포작용에 관여하는 GPA의 DYNAMIN two는 그랩 2의 전좌를 유도합니다. 이 실험에서, GFP grab two는 DNM 2로 COT를 HEC 2 93 T 세포에 형질 주입되었습니다. GFP grab two가 엔도솜과 같은 구조로 재배치되는 것은 빨간색 원 안의 세포로 설명됩니다.
이 절차에 따라 면역침전 또는 생화학적 분석과 같은 다른 방법을 사용하여 상호 작용이 직접적인지 간접적인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 내 단백질 상호 작용을 식별하기 위해 발현 클로닝을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
개요
이 기사는 신규 신호 전달 능력을 가진 막관통 수용체를 식별하기 위한 대규모 자동화에 적합한 고내용 스크리닝 방법을 설명합니다. 이 방법을 통해 포유류 세포에서 단백질 결합 및 단백질 복합체의 세포 내 국소화를 예측할 수 있습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 신호 전달
배경
- 단백질 상호작용을 이해하는 것은 세포 신호 전달 경로를 설명하는 데 중요합니다.
- 전통적인 방법은 생리학적 조건을 정확하게 반영하지 않을 수 있습니다.
- 고내용 스크리닝은 자동화되고 효율적인 분석을 가능하게 합니다.
- GFP 태깅은 단백질 국소화에 대한 시각적 통찰력을 제공합니다.
연구 목적
- CDNA 발현 클로닝을 사용하여 Grab2의 상호작용 파트너를 식별합니다.
- 자극에 대한 Grab2 국소화의 변화를 관찰합니다.
- 단백질 상호작용에 대한 생리학적 맥락을 제공하여 기존 방법을 개선합니다.
사용된 방법
- 박테리아 용해액으로부터 CDNA 라이브러리를 준비합니다.
- 리포터 구성물을 사용하여 인간 배아 신장 세포를 형질주입합니다.
- 형광 현미경을 사용하여 형질주입된 세포를 분석합니다.
- 플라스미드 준비 및 세포 형질주입 과정을 자동화합니다.
주요 결과
- GFP-태그된 Grab2는 세포 전체에 국소화되고 자극 시 플라즈마막으로 이동합니다.
- 상피 성장 인자 수용체와의 상호작용은 엔도솜으로의 내재화로 이어집니다.
- 이 방법은 생리학적 맥락에서 단백질 상호작용을 성공적으로 식별합니다.
- 결과는 관심 있는 다른 단백질에 대한 잠재적 응용을 나타냅니다.
결론
- 고내용 스크리닝 방법은 단백질 상호작용 연구에 효과적입니다.
- 이 접근 방식은 Grab2 이외의 다양한 신호 전달 경로에 적용할 수 있습니다.
- 자동화는 스크리닝 프로세스의 효율성과 확장성을 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-content imaging of Grb2 signaling complexes via expression cloning enables direct visualization of protein-protein interactions in mammalian cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This workflow provides quantitative and spatially resolved data on signaling complex formation, enhancing predictive confidence at the discovery-to-lead inflection point. The approach is broadly applicable for portfolio triage and prioritization of signaling pathway targets in oncology and cell signaling research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping Grb2 interaction networks in a physiological context.
- Supports biological de-risking by visualizing subcellular localization and complex formation in live mammalian cells.
- Facilitates functional target validation through quantitative assessment of protein recruitment and relocalization.
- Improves predictive confidence for advancing signaling pathway targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for high-content screening of protein-protein interactions.
- Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative imaging outputs across cDNA libraries.
- Enables scalable, genome-wide identification of novel Grb2-binding proteins for downstream evaluation.
- Supports reliable compound or genetic perturbation screening by providing robust localization readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant signaling pathways by modeling Grb2 recruitment in mammalian cells.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling follow-up biochemical confirmation.
- De-risks mechanistic assumptions prior to in vivo model investment.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to Grb2 signaling dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This high-content imaging workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and unbiased screening strategies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing Grb2 complex formation in response to diverse stimuli.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput identification of interaction partners.
- Analytics: Delivers quantitative localization and recruitment metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and mechanistic continuity into preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and expression cloning platform adaptable to other signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales protein interaction screening in mammalian systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of signaling pathway assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content imaging, cell culture, and molecular cloning.
- Needs access to automated liquid handling, fluorescence microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data interpretation criteria.
- Adaptable to various mammalian cell lines and signaling proteins with appropriate construct design.
- Dependent on robust image acquisition and quantitative analysis pipelines for reliable outputs.
