표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

다음 실험의 전반적인 목표는 cDNA 발현 클로닝과 녹색 형광 단백질이 태그된 Grab two의 변화 관찰을 통해 grab two의 상호작용 파트너를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아 용해물로부터 cDNA 라이브러리를 준비함으로써 수행됩니다. 그 다음 단계로, cDNA를 인간 배아 신장 세포에 형질전환시키면 관심 유전자와 함께 리포터 컨스트럭트가 발현됩니다.

다음으로, 세포 내 Grb2 국소화의 변화를 시각화하기 위해 형질전환된 플레이트를 Opera 현미경으로 분석하며, 형광 현미경 분석을 통해 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor) 매개로 GFP 태그된 Grb2가 엔도솜으로 모집되는 결과가 얻어집니다. 이 기술이 yeast two-hybrid와 같은 기존 방법과 비교했을 때 갖는 주요 장점은 상호작용 파트너의 세포 내 분포를 고려한 생리적 상황에서 Grb2의 상호작용 파트너를 식별할 수 있다는 점입니다.

본 방법은 Grab two에 의한 신호 전달을 식별하는 데 사용될 수 있지만, 다른 관심 단백질과 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다. cDNA 라이브러리는 글리세롤 스탁 내의 단일 박테리아 클론 형태로 제공됩니다.

Hudson Rapid pick light의 picker 메뉴에 있는 re ray 명령을 사용하여 96웰 포맷으로 진행합니다. 소스 플레이트에서 박테리아 클론을 피킹하여 96 deep well 플레이트의 1.5 mL lb amp에 접종합니다. deep well 플레이트를 가스 투과성 씰로 밀봉하고, 쉐이커에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 박테리아가 포함된 deep well 플레이트를 2000 RPM에서 20분 동안 원심분리합니다.

탁상용 원심분리기에 플레이트 어댑터를 사용하여, 박테리아 펠릿은 그대로 둔 채 웰에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 다음으로, 여기에 표시된 것과 같이 Tecan Freedom Evo 자동화 워크스테이션의 데크를 구성합니다. 플라스미드 준비를 위한 용액들을 1번부터 5번 트러프에 분배하고, 데크 위에 딥웰 플레이트를 배치합니다.

alucian 용액이 담긴 멀티웰 트러프를 딥웰 플레이트 옆에 둡니다. 팁 랙에 팁을 장착합니다. 진공 매니폴드를 조립합니다. 플라스미드 결합 플레이트를 매니폴드 내부에 배치하고 플라스미드 필터 플레이트를 매니폴드 위에 올립니다. 250 µL의 solution one으로 펠렛을 재현탁합니다.

피펫팅을 통해 Resus 현탁 완충액을 섞어줍니다. 펠릿이 완전히 재현탁되었는지 확인하는 것이 이 실험 과정의 성공에 있어 매우 중요합니다. 피펫팅만으로 펠릿이 완전히 재현탁되지 않을 경우 쉐이커(shaker)를 사용할 수 있습니다.

펠릿이 완전히 재현탁되면 250 µL의 용해 버퍼 용액을 첨가하여 박테리아를 용해시킵니다. 플레이트를 밀봉하고 뒤집어 완전히 혼합합니다. 타이머를 2분으로 설정합니다.

다음으로, 중화 완충액인 용액 3을 350 µL 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하고 3회 반전시켜 섞어줍니다.

박테리아 용해물을 플라스미드 필터 플레이트로 옮깁니다. 5분 동안 진공을 가합니다. 필터 플레이트를 제거하고 매니폴드 위에 결합 플레이트를 놓습니다.

1분 동안 진공을 가합니다. 추가 세척 버퍼 500 µL를 넣고 2분 동안 진공을 가합니다. 세척 버퍼 용액 4 900 µL를 넣고 2분 동안 진공을 가합니다.

그 후, 세척 완충액 900 µL를 네 번 더 추가하고 15분 동안 진공을 가합니다. DNA 수집 플레이트를 매니폴드 내부에 배치합니다. 결합 플레이트에 용출 완충액 100 µL를 추가하고 2분 동안 배양합니다.

10분 동안 진공을 가합니다. 마지막으로, 수집 플레이트를 제거하고 NanoDrop 8, 000을 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 일반적으로 이 절차를 시작하기 위해 본 방법으로는 µL당 약 100 nanograms의 수율을 기대할 수 있습니다.

hec 2 9 3 세포를 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하고 수를 측정합니다. 자동 분주기를 사용하여 Perkin Elmer 뷰 플레이트(View plate)의 각 웰에 2 × 10⁴개의 세포를 분주합니다. 트랜스펙션을 위해 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

자동 액체 핸들러를 사용하여 라운드 바텀 96-웰 플레이트의 각 웰에 다음과 같은 혼합물을 준비합니다. 25 µL의 무혈청 배지(serum free medium)에 100 ng의 GFP 플라스미드 DNA와 100 ng의 CD NA를 넣습니다. 다음으로, 0.5 µL의 transfect in이 포함된 무혈청 배지 25 µL를 각 웰에 추가하여 혼합하고 30분 동안 타이머를 작동시킵니다.

30분 후, cDNA transfection mix 50 µL를 세포에 옮겨줍니다. 이때 부드럽게 분주하는 방법을 사용하십시오. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

이미지 획득을 시작하려면 Opera 소프트웨어를 실행하십시오. 구성 탭을 선택하고 20배 대물렌즈와 올바른 플레이트 유형을 선택하십시오. 다양한 플레이트 유형에서 초점을 맞출 수 있도록 대물렌즈의 칼라(collar)가 올바른 값으로 설정되었는지 확인하십시오.

다음으로, 현미경 탭을 선택합니다. 노출 1은 fite 4 88 레이저로, 노출 2는 UV 365 레이저로 정의하십시오. 두 노출 설정 모두에서 UV 필터를 활성화하고 노출을 할당합니다.

1번을 카메라 1번과 노출에 설정하십시오. 2번을 카메라 2번에 설정하십시오. 노출 시간은 노출 1의 경우 800 milliseconds로, 노출 2의 경우 40 milliseconds로 설정하십시오.

둘째, 노출을 선택하고, 초점 높이를 0 µm로 설정합니다. 초점이 맞으면 Focus를 선택합니다. 카메라 1을 노출시킵니다.

노출 평면을 최적화하기 위해 초점 높이를 조정한 후 높이 측정(take height)을 클릭하십시오. 노출 파라미터를 저장하고, 노출 2(exposure Two)에 대해 동일하게 반복하십시오. 실험 정의(experiment definition) 탭을 선택하고 레이아웃 및 서브 레이아웃을 생성하십시오.

적절한 레이아웃, 노출, 참조 이미지, 왜곡, 크롭 파일 및 서브 레이아웃을 드래그 앤 드롭하십시오. 실험 설정을 저장합니다. 자동 실험 탭을 선택하고 일반 조건에서 이미지를 획득하십시오.

Grab two는 세포 전체에 걸쳐 국소화되어 있습니다. 성장 인자 수용체가 자극되면, 이는 세포막으로 전이된 후 엔도솜 내부로 내입됩니다. 이 그림의 상단 패널은 GFP grab two가 일시적으로 형질전환된 CO M six 세포를 보여주며, 예상대로 형광이 세포 전체에 분포되어 있습니다.

하지만 GFP-GRB2와 세포 표면 수용체인 EGFR를 일시적으로 형질전환시킨 세포에서는 하단 패널에 표시된 것과 같이 GRB2가 엔도솜 유사 구조로 재배치됩니다. 따라서 게놈 와이드 라이브러리를 적용하면, 새로운 GRB2 결합 세포 표면 단백질을 식별할 수 있을 것으로 기대됩니다. 이 방법은 세포 표면 단백질 검출에만 국한되지 않습니다.

예를 들어, Grab 2 매개 엔도사이토시스(endocytosis)에 관여하는 GPA의 DYNAMIN 2는 Grab 2의 전위(translocation)를 유도합니다. 본 실험에서는 HEC 2 93 T 세포에 GFP Grab 2와 DNM 2를 공동 형질전환(cot transfected)시켰습니다. 빨간색 원 내부의 세포들은 GFP Grab 2가 엔도솜 유사 구조(endosome like structures)로 재배치된 모습을 보여줍니다.

이 절차 이후에 면역침전법이나 생화학적 분석과 같은 다른 방법을 사용하여 상호작용이 직접적인지 또는 간접적인지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 하위 세포 내 단백질 상호작용을 확인하기 위해 발현 클로닝을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.