형광등과 결합 염색체 복제 타이밍

이 실험적 접근 방식은 BRDU 통합과 형광 인 시투(in situ) 하이브리드화를 결합한 것입니다. 포유류 염색체의 복제 타이밍을 정량적으로 분석하기 위해, 먼저 살아있는 세포에 BRDU를 통합시킨 후 중기 염색체를 수확합니다.

그 다음, 개별 복제 염색체를 식별하기 위해 순차적 BRDU 항체 염색과 병행하여 DNA fish를 수행합니다. 이어서, 광학 현미경을 사용하여 개별 체세포 분열상에서 fish 신호와 BRDU 통합 이미지를 캡처합니다. cyto vision 소프트웨어를 사용하여 각 분리된 염색체에서 BRDU 또는 DPI 신호로 표시되는 픽셀의 면적과 강도를 계산합니다.

결과를 통해 개별 재배열된 염색체와 그 상동 염색체에서의 BRDU 통합 정도를 정량화하고 비교할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 개별 세포를 평가하므로, 최근 개발된 고처리량 마이크로어레이 및 DNA 시퀀싱 프로토콜과 비교하여 집단 내 일부 세포에만 존재하는 염색체 재배열의 복제 및 타이밍 변화를 검출할 수 있는 능력을 갖추고 있습니다. 이 방법은 동일한 세포 내에 존재하는 상동 염색체 간의 직접적인 비교를 가능하게 합니다.

또한 이는 염색체 복제에 영향을 미치는 염색체 재배열을 명확하게 식별할 수 있는 능력을 갖추고 있습니다. 해당 절차를 시연하며 전체 염색체의 타이밍을 보여줄 사람은 내 실험실의 연구원인 Leslie Smith입니다. 세포를 150 millimeter 조직 배양 접시에 약 70% 합류도(confluence)로 파종하고, 적절한 시간에 세포 배양기로 옮겨 24시간 동안 배양하십시오.

수확 전 단계입니다. 10 µg/mL의 BrdU가 포함된 신선한 완전 배지로 배지를 교체하십시오. 세포를 BrdU 포함 배지에서 배양하는 시간은 세포 유형과 종에 따라 다릅니다.

일반적으로 G2기는 2시간에서 5시간 사이입니다. 플레이트에서 배양액을 제거하고, 15 mL 원심분리 튜브에 10 mL를 따로 보관하십시오. 세포를 10 mL의 sine으로 헹군 다음, 남은 sine을 진공 흡입으로 제거하십시오.

그 다음 0.25% trypsin 5 mL를 첨가하고 세포가 플레이트에서 떨어질 때까지 상온에서 배양합니다. 세포를 회수하여 현탁액을 미리 준비해 둔 배지 10 mL에 옮깁니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 배지를 0.5 mL만 남기고 모두 흡입하여 제거합니다.

이제 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포를 충분히 재현탁하여 세포를 삼투성으로 팽창시킵니다. 37°C로 가온된 75 mM 염화칼륨 용액 3방울을 첨가하고, 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 저장액 0.5 mL를 추가로 넣습니다. 이제 저장액의 총 부피를 5 mL로 맞추고 피펫팅하여 혼합합니다.

세포 유형에 따라 세포 현탁액을 37 °C에서 20분에서 45분 동안 배양합니다. 세포가 현탁 상태를 유지하도록 튜브를 기울인 채로 배양하십시오. 그 후 400 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.

상층액 중 0.5 mm만 남기고 모두 흡입한 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 이때 삼투압으로 팽창된 세포는 매우 취약하므로 세포질 막이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 다음으로, 카노 고정액 세 방울을 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.

0.5 milliliters의 고정액을 추가로 넣은 후, 고정액의 전체 부피를 5 milliliters로 맞추고 피펫팅하여 균질한 세포 현탁액을 만듭니다. 이렇게 고정된 세포는 영하 20 °C의 암소에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 원심분리를 통해 고정된 세포를 수확하고, 고정액을 흡입하여 제거한 후, 얼음 위에 놓인 현미경 냉장 보관 상태에서 펠렛을 10배 부피의 고정액에 재현탁합니다.

슬라이드를 약 45도 각도로 기울입니다. 세포 현탁액을 한 방울씩 떨어뜨려 넓게 퍼뜨립니다. 고정액을 슬라이드 전체에 붓고 과잉분을 제거합니다.

그 다음 슬라이드를 페이퍼 타월 위에 평평하게 놓아 공기 중에서 건조시킵니다. 도립 현미경을 사용하여 샘플에 유사분열 전이(mitotic spreads)가 있는지 평가합니다. 각 슬라이드에 2 XSSC에 희석된 10 µg/mL RNase A 2 µL를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

실온에서 pH 7.0의 2XSSC로 3분씩 세 번 세척합니다. 그다음 실온에서 에탄올 시리즈를 통해 3분 동안 샘플을 탈수합니다. 각 샘플을 실온에서 공기 건조한 후 냉각된 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다.

표지된 뉴클레오타이드 DNA 기질 4 µg, 10 X NIC 번역 버퍼, DNTP 믹스 및 NIC 번역 효소를 첨가하십시오. 반응물을 16 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 70 °C에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킵니다. 그 다음 얼음 위에서 5분 동안 냉각하십시오.

이제 DNA를 에탄올 침전시키기 위해 3 M sodium acetate 48 µL, 0.25 µg/µL cot-1 DNA 160 µL 및 100% ethanol 1.2 mL를 첨가합니다. 샘플을 -80 °C에서 10분 동안 또는 하룻밤 동안 보관하여 DNA를 침전시킨 후, 원심분리를 통해 침전물을 회수하고 70% ethanol로 세척합니다. 공기 건조된 DNA 프로브를 2회 증류수 40 µL에 재현탁하여, BAC-SEP 동시 하이브리드화에 사용할 표지된 BAC DNA의 최종 농도를 100 ng/µL로 맞춥니다. 동봉된 원고에 상세히 설명된 대로 cot-1 DNA가 포함된 두 개의 별도 프로브 칵테일을 준비합니다.

프로브 칵테일을 75 °C에서 10분 동안 변성시킵니다. 그다음 37 °C에서 30분 동안 배양하여 cot 1 DNA가 반복 서열에 결합하도록 합니다. 이제 백 프로브(back probe)와 S 프로브를 3:2 비율로 혼합하여 샘플당 25 µL가 되도록 준비합니다.

샘플을 변성시키기 위해 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드를 72°C의 70% formamide 2XSSC 용액에 담그고 3분 동안 배양합니다. 즉시 4°C에서 에탄올 시리즈를 통해 3분 동안 샘플을 탈수시킵니다.

프로브 준비를 마치기 전, 각 샘플을 실온에서 약 10분 동안 공기 건조합니다. 슬라이드 워머를 사용하여 슬라이드를 45 °C에서 평형화합니다. 그 다음, back S 프로브 혼합액 25 µL를 첨가합니다.

각 슬라이드에 커버슬립을 조심스럽게 배치하고, 하이브리드화 단계를 위해 고무 시멘트로 모든 가장자리를 밀봉합니다. 습윤 챔버에서 37°C로 하룻밤 동안 샘플을 배양합니다. 38~40°C의 50% IDE 2X SSC pH 7.0 용액에서 3분씩 3회 하이브리드화 후 세척을 수행합니다.

세척의 최적 온도는 프로브에 따라 다릅니다. 배경 하이브리다이제이션(background hybridization)이 심한 경우 세척 온도를 높이십시오. 반대로, 프로브 신호가 약하고 배경이 없다면 세척 온도를 낮추십시오.

실온에서 PN 버퍼로 3분 동안 한 번 세척합니다. BRDU 검출을 위해 각 슬라이드에 200 µL의 PNM 블로킹 버퍼를 첨가합니다. 암소 실온에서 10분 동안 배양한 후, 페이퍼 타월 위에서 슬라이드의 액체를 제거합니다.

그 다음 50 µg/mL anti B-R-D-U-F-E 접합 항체 100 µL를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 실온에서 PN 버퍼로 3분씩 세 번 세척합니다. 각 슬라이드에서 과량의 PN 버퍼를 제거합니다.

그 다음 dappy Antifa 마운팅 용액 20 µL를 추가합니다. 슬라이드 위에 종이 타월을 덮고 커버 슬립을 눌러 기포와 과잉 마운팅 용액을 밀어냅니다. CCD 카메라가 연결된 형광 현미경으로 이미지를 캡처합니다.

100x 대물렌즈와 자동 필터 휠 및 CytoVision 소프트웨어를 사용하여, FITC 필터로 BrDU를 캡처하고, Cy3 또는 Texas Red 필터로 염색체 페인트, 백(back) 및 중심체 프로브를 캡처하십시오. 또한, 핵 염색을 위해 DAPI 필터를 사용하십시오. CytoVision 소프트웨어에서 백 EP 또는 염색체 특이적 페인트 프로브를 사용하여 관심 있는 개별 염색체를 식별하십시오.

중기 분산 표본에서 관심 있는 각 염색체를 전체적으로 잘라냅니다. DPI 및 FITZY 염색체 이미지를 새 창에 복사하여 붙여넣습니다. 도구 메뉴에서 그래프 아이콘을 선택하면 각 개별 염색체를 따라 Fitz 및 dappy 염색의 면적과 강도를 나타내는 그래프를 생성할 수 있습니다.

이는 염색체의 단완에서 장완까지 길이에 따라 선을 그려 수행합니다. 도구 메뉴에서 데이터 아이콘을 선택하고 ZI 및 dpi에 대해 계산된 면적과 강도를 표시하는 표를 생성합니다. 다음으로, 관심 있는 염색체의 ZI 및 DPI 신호를 선택합니다.

그다음 표 아이콘에서 intensity와 area 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어는 각 신호에 대해 평방 인치당 픽셀의 수치 측정값을 생성합니다. 이어서, 각 염색체의 평균 픽셀 강도를 해당 픽셀이 차지하는 면적에 곱합니다.

염색체의 최신 복제 영역 시각화를 위한 총 픽셀 수를 구하려면, 활발하게 복제되는 염색체 영역의 BRDU 통합 밴드 패턴을 평가하십시오. 그런 다음 BRDU 밴딩 패턴의 차이를 기반으로 염색체 쌍 간의 복제 타이밍 차이를 계산하십시오. 포유류 세포의 염색체는 시간적 프로그램에 따라 복제되며, S기의 시작과 끝에 각각 조기 복제와 후기 복제가 일어납니다.

포유류 세포의 전형적인 S기는 8에서 10시간 동안 지속되며, G2기는 보통 2에서 5시간입니다. 이 실험 시스템에서는 BRDU를 점진적으로 더 긴 시간 동안 첨가하여, 이들 세포가 가진 염색체 복제의 마지막 부분들을 표지합니다. 해당 세포들은 6q16.1에 위치한 인간 as a R six 유전자의 결실을 포함하고 있습니다. BRDU로 5시간 동안 처리한 후 유사분열 세포를 수확하여 BRDU 결합 및 염색체 6번 페인트 프로브를 이용한 형광 인시튜 하이브리드화를 위해 처리한 결과, 두 개의 6번 염색체에서 세 개의 형광 표지가 나타납니다.

BRDU 밴딩 패턴의 현저한 차이는 두 개의 6번 염색체 중 하나에서 복제 시기가 2시간 이상 지연되었음을 나타냅니다. Cyto vision 소프트웨어는 두 개의 6번 염색체에서 DPI와 BRDU의 서로 다른 신호 강도 프로파일을 보여주며, 이는 비동기적 복제를 시사합니다. 또한, DPI 염색에 대한 유사한 분석과 비교했을 때 BRDU 통합의 총량에서도 상당한 차이가 나타납니다.

인간 AR six 유전자를 포함하는 백 프로브(back probe)를 사용하면 이 세포에서 긴 팔(long arm)에 결실이 있는 단일 6번 염색체가 강조됩니다. 흥미롭게도, 비-ED 6번 염색체보다 더 강한 BrdU 통합과 더 확장된 BrdU 통합 밴딩 패턴이 관찰됩니다. 7개 서로 다른 세포의 분열기 전개도(mitotic spreads)를 처리하여 두 6번 염색체 간의 복제 시기 차이를 정량화하였습니다.

BRDU 수치는 결실된 6번 염색체와 비결실된 6번 염색체의 전체 픽셀 값 사이에서 2배 이상의 차이를 보입니다. 이 기술을 숙달하면 3일 이내에 적절하게 수행할 수 있습니다. 이제 동일한 세포 내에 존재하는 상동 염색체의 복제 및 타이밍을 측정하는 방법과, 복제 변화와 상관관계가 있는 염색체 재배열을 명확하게 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다.

전체 염색체의 타이밍.