Name: 형광등과 결합 염색체 복제 타이밍 현장에서 하이브리드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: 학습하세요 BrdU 표지와 FISH를 결합한 염색체 복제 타이밍 정량 분석법을 통해 포유류 세포에서 재배열된 염색체와 정상 염색체의 복제 시기를 직접 비교하는 방법을 익히세요.

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이 작품은 국립 암 연구소, CA131967의 교부금에 의해 지원되었다.

1. BrdU의 설립 (터미널 라벨링) <ol><li> 이전 BrdU의 추가로 150mm 조직 문화 요리 24 시간에 약 70 %의 합류로 플레이트 세포. </li><li> 전에 수확에 적합한 시간 지점에서 20 μg / ML BrdU (시그마)를 포함하는 신선한 완벽한 미디어와 미디어를 대체합니다. 시간이 세포의 길이는 BrdU는 일반적으로 G2 단계는 시간 (그림 1) 2 사이 5 정도, 세포 유형 및 종과 다를 수있는 미디어에 배양되어 있습니다. </li></ol> 2. Monolayer 셀 문화의 염색체 수확 <ol><li> 접시에서 문화 미디어를 제거하고 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브 10 ML를 수집합니다. 나머지 미디어를 폐기하십시오. </li><li> 10 ML Versine [또는 HBSS (시그마)]로 한 번 세포를 씻어. </li><li> 접시에 Versine (또는 HBSS)의 5 ML 0.25 % 트립신을 추가합니다. 세포 판에서 분리 될 때까지 실온에서 알을 품다. </li><li> 단계 2.1에서 미디어 10 ML을 포함하는 튜브에 trypsinized 세포 현탁액을 추가합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 펠렛 셀에 10 분 400 XG에 원심 분리기. 0.5 미디어 ML 플러스 세포 펠렛을두고, 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 pipetting하여 철저하게 세포를 Resuspend. </li><li> hypotonic 솔루션 3 물방울 추가 (를 0.075 M KCl (시그마)는 37 예열 ° C), 파스퇴르 (Pasteur) 피펫으로 세포 현탁액을 섞는다. 0.5 ML hypotonic 솔루션을 추가하고 파스퇴르 피펫로 다시 섞는다. 5 ML에 hypotonic 솔루션의 볼륨을 데려와 다시 한 번 섞는다. 세포 유형에 따라 20-45 분에 대해 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 10 분 400 XG에 원심 분리기. 0.5 미디어 ML 플러스 세포 펠렛을두고, 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> 부드럽게 튜브를 flicking하여 세포 펠렛을 Resuspend. osmotically 부어 셀은이 시점에서 연약하므로주의가 세포질 세포막을 방해하지 않도록해야합니다. </li><li> 부드럽게 파스퇴르 (Pasteur) pipett로 pipetting하여 혼합; Carnoy의 정착액 (메탄올 1시 3분 빙하 아세트산) 3 방울을 추가5. 부드럽게 파스퇴르 피펫으로 pipetting하여 0.5 ML의 정착액 및 혼합을 추가합니다. 정착액의 용적 (5) ML로 준비하고 부드럽게 파스퇴르 피펫으로 pipetting하여 다시 섞는다. 고정 셀은 몇 개월 -20 ° C에서 어둠 속에서 저장 될 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기 및 단계 2.8에서와 같이 대기음. </li><li> 신선한 정착액에 세포 펠렛을 Resuspend, 펠릿 및 추가 ~ 10 배 Carnoy의 정착액의 볼륨의 볼륨을 예상하고 있습니다. </li><li> 세포 현탁액 서부 유럽 표준시, 얼음처럼 차가운 현미경 슬라이드에 드롭 현명한을 추가, ~ 45 ° 각도로 슬라이드를 누른 상태에서 슬라이드의 표면 흐름에 세포 현탁액 할 수 있습니다. 종이 수건에 평면 슬라이드와 홍수 정착액으로 슬라이드를 마련하고 건조한 공기 할 수 있습니다. 역 현미경을 사용하여 mitotic 확산의 존재에 대한 슬라이드를 선택합니다. </li></ol> 3. RNase 처리 및 에탄올 탈수 <ol><li> 10 μg / 각 슬라이드에 2 배 SSC의 ML RNase A (시그마)의 장소 200 μl, 37 &amp; 드에 품다g, C 1 시간을위한. </li><li> 워시 배 SSC, 3 분 각각에 대해 실온에서 pH를 7.0로 3 회를 슬라이드. </li><li> 3 분 각 객실 온도에서 EtOH (시그마) 시리즈 (70 %, 90 % 및 100 %)을 통해 슬라이드를 탈수. </li><li> 공기는 상온에서 슬라이드를 건조. </li></ol> 4. 현장 하이브리드 화에 BAC 플러스 염색체 특정 Centromere 열거 프로브 (CEP) 또는 전체 염색체 페인트 용 프로브 칵테일의 작성 <ol><li> BAC / CEP 동시 하이브리드를 들어, 사전 하이브 리다이 제이션에 대한 두 개의 프로브 칵테일을 준비합니다. 우리는 적은 배경과 큰 신호 강도에 다른 stringencies 결과에 따라 개별적으로 BAC와 CEP 프로브를 사전 hybridizing 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 개인 Fosmids는 BAC 클론 대신에 또한 사용될 수 있다는 것을 발견했습니다. 아래에 설명 된 칵테일 제제는 단일 슬라이드의 볼륨을 나타냅니다. 동일한 프로브를 사용하여 여러 슬라이드를 처리하는 경우 단순히 볼륨 appropr을 증가<html> 취미가 생겼다. * BAC DNA 프로브 칵테일 : 11.5 μl 하이브 리다이 제이션 버퍼 (50 % 포름 아미드 (시그마) / 배 SSC / Dextran 황산 (시그마)) 2 μl DH 2 O DH 2 O의 2.5 μl BAC/Cot1 DNA (프로토콜 라벨은 아래를 참조) 15 μl 총 볼륨 * CEP 프로브 칵테일 : 7 μl CEP의 하이브 리다이 제이션 버퍼 (65 % Formamide/2x SSC / Dextran 황산) 2 μl DH 2 O 1 μl CEP/Cot1의 DNA (스펙트럼 Orange/Cy3/Texas 레드와 prelabeled 구입) 10 μl 총 볼륨 * 3시 2분 비율 25 μl / 슬라이드 및 혼합 프로브 칵테일에서 CEP 프로브와 함께 혼합 BAC 프로브를 denaturing 및 사전 하이브리드 (단계 5.1) 후. OR </li><li> 나누어지는 20 μl / 튜브에 전체 염색체 페인트 프로브 (Cy3/Texas 레드)의 슬라이드. 변성 및 사전 하이브 리다이 제이션 단계로 진행합니다. </li></ol>&quot;&gt; 5. 슬라이드와 프로브 변성 및 현장 하이브리드 화에 <ol><li> 75 변성 프로브 칵테일 (들) ° 10 분에 C. Cot1 DNA는 반복적 인 시퀀스에 잡종을 만들다하고 염색체를 metaphase하기 위해 후속 하이브리드을 방지 할 수 있도록 30 분에 37 ° C에서 프리 잡종을 만들다. </li><li> 3 분 72시 70% Formamide/2x SSC, pH를 7.0 ° C의 Coplin 병에서 변성 슬라이드. </li><li> 바로 3 분 각각에 대해 4에 Coplin 병에 EtOH 시리즈 (70 %, 90 % 및 100 %) ° C를 통해 슬라이드를 탈수. </li><li> 슬라이드가 실온에서 건조한 공기 할 수 있습니다. </li><li> 45 미리 따뜻한 슬라이드 ° C 프로브 사전 hybridzation (단계 5.1)의 마지막 10 분을위한 따뜻한 슬라이드. 필요한 경우 사전 hybridized 프로브 칵테일을 섞어서 각 슬라이드 25 UL를 추가, 부드럽게 고무 시멘트로 모든 가장자리를 따라 각 슬라이드과 인감에 coverslip를 놓습니다. 증발을 방지하기 위해 humidified 챔버에 37 ° C에서 하루 아침에 품다. </li></ol><ol><li> 3 분마다 38-40 ° C 50 % formamide/2x SSC, 산도 7.0에서 Coplin 병 3 회에 슬라이드를 씻으십시오. 세차의 온도는 프로브 사이에 다를 수 있습니다. 고 배경 하이브리드가있는 경우 귀하는 세차의 온도를 높일 수 있습니다. 신호가 희미한하고 더 배경이없는 경우 반대로, 다음이 세차의 온도를 줄일 수 있습니다. </li><li> 워시는 상온에서 PN 버퍼 1 시간을 슬라이드 3 분을 위해, 그리고 BrdU 감지 단계로 진행합니다. </li></ol> 7. BrdU 검색 <ol><li> 어둠 속에서 실온에서 10 분 (200 μl / 슬라이드)에 대한 PNM 버퍼를 차단 슬라이드. </li><li> 종이 타월에 가장자리에 설정하여 슬라이드를 배수한다. 37 30 분에 PNM 버퍼에 방지 BrdU-FITC (50 μg / ML 로슈 또는 Millipore) 100 μl를 추가합니다 ° C. </li><li> 3 분마다 실온에서 PN 버퍼에 슬라이드에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 배수에 초과 PN 버퍼는 종이 타월에 에지 기능을 사용하면 한 번에 하나의를 슬라이드. 20 μl DAPI / antifade 장착 솔루션 (Invitrogen)를 추가합니다. 종이 타월로 슬라이드를 커버하고 기포 및 과도한 마운트 솔루션을 강제로 coverslip에 아래로 누르십시오. 이미지 분석을 수행합니다. </li></ol> 8. 이미지를 캡쳐하고 BrdU의 설립을 정량화 <ol><li> 이미지는 올림푸스 BX61 형광 현미경과 올림푸스 CCD 카메라, 100x 목표, 자동 필터 휠과 Cytovision 소프트웨어 (응용 이미징)을 캡처합니다. BrdU는 FITC 필터 사용하여 캡처되며 염색체 페인트를 (텍사스 빨강, Metasystems 또는 Cytocell), BAC의 (Cy3)와 CEP (Vysis 스펙트럼 오렌지) 프로브는 텍사스 레드, Cy3 필터를 사용하여 캡처되며, DAPI는 DAPI 필터 (참조로 캡처 도 2 및도 3). </li><li> 관심 개별 염색체는 BAC / CEP 또는 염색체 특정 페인트 프로브 (그림 2B와 3B)로 식별됩니다. 활용Cytovision 소프트웨어는 관심의 각 염색체는 전체 metaphase 확산에서 &quot;컷 아웃&quot;입니다, 라인은 긴 팔 (그림 2C와 3C)에 짧은 팔의 염색체의 길이를 따라 통해 그려집니다. Cytovision 소프트웨어는 각 염색체의 길이를 따라 픽셀 강도 프로필을 수량화하는 데 사용됩니다. Cytovision 소프트웨어는 픽셀가 차지하는 영역을 계산하고 각 절연 염색체에있는 BrdU 또는 DAPI 신호로 표시 픽셀의 강도를 단정 지을. 각 염색체로 표현 평균 픽셀 강도 그런 다음 픽셀 (표 1, 그림 4)의 총 수를 얻기 위해 해당 픽셀이 차지하는 영역을 곱한 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 염색체의 최신 복제 영역의 시각화 할 수 있습니다. 따라서, BrdU의 설립의 밴드 패턴은 염색체의 적극적 복제 영역의 검출이 가능하고, chromos 간의 복제 타이밍의 차이ome 쌍은이 구간 패턴 (도 2 및도 3)의 차이로 볼 수 있습니다. 마지막으로, 구속력이 패턴에 이러한 차이는 상동 염색체 또는 염색체 팔을 4 ~ 복제 타이밍 차이의 추정을 허용 각 염색체 6,7에 대해 알려진 복제 타이밍지도에 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 두 개의 염색체 6 3A는 염색체 6 4의 정상적인 복제 타이밍에 비해&gt; 2 시간의 패턴을 구간에서 차이를 표시 그림에 있어요. 또한, 여기에 설명 된 것과 유사한 절차를 성공적으로 비활성 및 활성 X 염색체 8,9 사이의 비동기 복제 타이밍 연구에 사용되었습니다. 운영 중 및 운영 중지 X 염색체는 X 염색체 페인트를 사용하여 확인 하였다. 이미지는 채우려 mFISH 소프트웨어 (Vysis)와 X 염색체에 의해 점령 픽셀의 수와 휘황 라 차지하는 픽셀 수를 사용하여 획득 한beled BrdU 그 다음 NIH 이미지 (사용하여 계산 된 <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html을</a> ). </li></ol> 9. 형광 라벨을위한 BAC DNA의 닉 번역 (Vysis) <ol><li> microfuge 관을 차게 다음 프로브 믹스를 추가합니다 : DH 2 O 70 μl (4 μg의 DNA) 10 μl 0.2 MM dUTP - 오렌지 나 그린 20 μl 0.1 MM dTTP 20 μl 10X 닉 번역 버퍼 40 μl NT dNTP의 (마이너스 dTTP) 40 μl 닉 번역 효소 200 μl 총 볼륨 @ 16 ° 길러 CO / N. 10 분 70시 가열에 의해 반응 ° C를 중지합니다. 5 분을 위해 얼음에 진정. </li><li> 프로브 믹스에 다음을 추가하여 에탄올로 DNA를 침전 : 200 μl 프로브 솔루션 48 μl 3 M NaOAc 160 μl Cot1DNA (0.25 μg / UL) 1200 μl 100 % EtOH </li><li> O / N. 10 분에 -80 ° C에서 저장 </li><li> i를 돌려N 20 분에 12,000 XG에서 추위. EtOH에서 가만히 따르다. 70 % EtOH로 한 시간을 씻으십시오. 이전처럼 봐. EtOH에서 가만히 따르다. 공기가 EtOH이 증발 할 때까지 건조 시키십시오. 100 NG / BAC DNA의 μl의 최종 농도 40 μl DH 2 O에 Resuspend. </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li>
<li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li>
<li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+translocations+with+delayed+replication%3A+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li>
<li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li>
<li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li>
<li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+element%28s%29+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li>
<li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+inactivation+of+rDNA+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li>
<li>Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman">http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman</a> (2006).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+checkpoint+response+to+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

염색체 확산의 준비는 여기에 설명 된 성공적인 복제 - 타이밍 분석을위한 중요한 단계입니다. hypotonic 치료 전에 colcemid 전처리 단계의 포함은 주파수와 mitotic 세포의 확산에 도움 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 수확하기 전에 1-3 시간에 colcemdi에 세포를 노출, 10 UG / ML의 최종 농도에 colcemid 사용합니다. 그러나, colcemid 전처리 단계의 포함은 G2의 길이를 변경할 수 있으며, 그 결과 염색체 3 응축의 명백한 복제 타이밍 및 상태를 변경할 수 있습니다. 이 절차는 세포주기 기간에 따라 달라집니다 BrdU의 부화의 길이를 다양하여 여러 가지 세포 유형과 종에 적용 할 수 있습니다. 대부분의 인간 및 마우스 세포 라인은 G2 단계는 일반적으로 3-6 시간이므로 BrdU 트리트먼트는이 범위에 일반적으로있다. BrdU에 대한 대안은 5 ethynyl - 2&#39;deoxyuridine (에듀) 및 사...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 안티 BrdU-FITC </td><td> 로슈 Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 μg / μl </td></tr><tr><td> 닉 번역 키트 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> 스펙트럼 오렌지 dUTP </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 다름 </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP 하이브 리다이 제이션 버퍼 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP의 하이브 리다이 제이션 버퍼 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> 염색체 파이국세청 </td><td> MetaSystems 그룹 </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> 올림푸스 BX61 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 이미징 소프트웨어 시스템 </td><td> 응용 이미징 </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> 디지털 카메라 </td><td> 하늘 </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 현장 하이브 리다이 제이션 요리 IN 포름 아미드 솔루션 70% Formamide/2x SSC 35 ML 포름 아미드 * (시그마) 10 ML 10X SSC 5 ML D 2 H 2 0 HCL와 7.0 산도 (시그마) *이 -20 ° C.에 저장되어 그 포름 아미드를 사용하는 것이 중요합니다 장시간 실온 보관이 개미의 산성과 pH의 w를 생성합니다병 너무 낮. 50% Formamide/2x SSC 25 ML의 포름 아미드 (시그마) 10 ML 10X SSC 15 ML DH 2 O HCL와 7.0 산도 (시그마) 20x SSC, 4 L 702g NaCl (시그마) 358g 오세영 구연산 (시그마) 볼륨 DH 2 O PN 버퍼 [0.1 M NaP0 4 0.1 % NP_40 (시그마)] 0.1 M 솔루션 인산 나트륨의 각 (필터 소독, 500 ML의 aliquots에 저장)을 확인합니다. 0.1 M 아뇨 2 P0 4, L 13.8 g 아냐이 P0 4 (시그마) : 볼륨 DH 2 O 0.1 M 아뇨 2 P0 4 1 패 </str긴 사연&gt; 14.2 g 아냐이 P0 4 (시그마) 볼륨 DH 2 O. PN : 0.1 M 아뇨 2 P0 4 2 HP0 4 산도 8.0 NA 0.1 M의 pH를 조정합니다. 필터 살균 및 NP-40의 1 ML를 추가합니다. PNM 50 ML 1.25 g 비 지방 건조 우유 (시그마) 25 ML PN 버퍼 (위 레시피) 지속적으로 저어로 15-20 분 동안 섞는다. 10 분 400 XG에 2 번 봐. 표면에 뜨는 사용하여 유발 우유 단백질을 방해하지 않도록하십시오. </td></tr></tbody></table>

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

포유류의 DNA 복제는 일시적 복제 프로그램에 따라, S 단계 동안 다른 시간에 염색체를 따라 여러 사이트에서 시작합니다. 복제 타이밍 사양은 epigenetic 수정에 대한 반응 조직 별 및 발달 신호에 의해 규제 동적 과정이라고 생각합니다. 그러나, 어디에서 DNA 복제가 염색체 함께 시작하면 규제 메커니즘을 제대로 이해 남아 있습니다. 상동 염색체는 보통 그러나이 규칙에 중요한 예외가 있습니다, 동기식 복제합니다. 예를 들어, 여성 포유류의 세포에 두 개의 X 염색체 중 하나는 X의 불 활성화 1로 알려진 과정을 통해 늦은 복제됩니다. 2-3 시간이 될 것으로 추정 복제 타이밍,이 지연과 함께 유전자의 대부분은 transcriptionally 한 X 염색체에 침묵된다. 또한, X의 불 활성화 센터로 알려진 이산 시스 - 연기의 궤적은, 일 포함하여이 X의 불 활성화 과정을 조절전체 비활성 X 염색체에 지연 복제 타이밍의 전자 유도. 또한, 암 세포와 세포에서 발견 특정 염색체 rearrangements는 전체 염색체에게 2,3에 영향을 미치는&gt; 3시간 그 복제 타이밍에 상당한 지연을 표시 이온화 방사선에 노출. 우리 연구실의 최근 작품은 이산의 중단 시스 - 행동의 전체 염색체 (4)에 영향을 미치는 매우 늦은 복제 표현형에 염색체 loci 결과를 나타냅니다. 추가 &#39;염색체 공학&#39;연구는 포유류의 염색체는 각 염색체의 적절한 복제 타이밍 5 제어 이산 시스 - 행동 loci가 포함되어 있다는 제안이 이상 복제 - 타이밍 표현형의 다양한 염색체 결과에 영향을 미치는 특정 염색체 rearrangements를 나타냅니다. 여기, 우리는 현장 하이브리드 화에 형광과 결합 염색체 복제 타이밍의 정량 분석​​하는 방법을 제시한다. 이방법은 동일한 세포 내에서 상동 염색체 간의 복제 타이밍의 직접 비교를 허용, 6에서 적응되었습니다. 또한,이 방법은 전체 염색체에 영향을 복제 타이밍의 변화와 연관 염색체 rearrangements의 모호 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 최근에 개발 된 높은 처리량 마이크로 어레이 이상 또는 재 배열 및 염색체를 취소 뜯어을 제시 상동 대립 유전자를 구별 할 수 없습니다 프로토콜을 시퀀싱 장점이 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 하나의 셀을 평가하기 때문에 또한, 그것은 인구의 셀의 일부만에 존재하는 염색체 rearrangements의 염색체 복제 타이밍의 변화를 감지 할 수 있습니다.

인간의 염색체 6의 복제 타이밍 분석의 예는 그림 2에 표시됩니다. 6q16.1에있는 ASAR6 유전자 4의 삭제를 포함하는 셀은 5 시간에 BrdU에 노출 mitotic 세포에 대한 수확 및 염색체 6 페인트 프로브 (Vysis)와 물고기와 BrdU의 설립에 대한 처리되었습니다. 두 6의 사이 BrdU 구간 패턴에 상당한 차이가 있습니다, 이는 이전에 염색체 6의 [표시 4 염색체 6 패턴을 구간 복제 타이밍에 중 하나에 대한&gt; 2 시간의 복제시기에 지연과 일치 삭제]. 또한, DAPI의 얼룩과 비슷한 분석 (그림 2D)에 비해 BrdU의 설립 (픽셀)의 총 금액에 상당한 차이가있다. 인간의 염색체 6의 복제 타이밍 분석의 또 다른 예는 그림 3에 표시됩니다. 샘을 포함하는 셀4 그림 2는 ...

염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을 활용<em&gt; 현장에서</em&gt; 포유류의 염색체 복제 타이밍을 평가하는 하이브리드 (물고기). 이 기술은 동일한 세포 내에서 재 배열 및 취소 - 재 배열 염색체의 직접적인 비교를 할 수 있습니다.

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

이 실험적 접근 방식은 BRDU 통합과 형광 인 시투(in situ) 하이브리드화를 결합한 것입니다. 포유류 염색체의 복제 타이밍을 정량적으로 분석하기 위해, 먼저 살아있는 세포에 BRDU를 통합시킨 후 중기 염색체를 수확합니다.그 다음, 개별 복제 염색체를 식별하기 위해 순차적 BRDU 항체 염색과 병행하여 DNA fish를 수행합니다. 이어서, 광학 현미경을 사용하여 개별 체세포 분열상에서 fish 신호와 BRDU 통합 이미지를 캡처합니다. cyto vision 소프트웨어를 사용하여 각 분리된 염색체에서 BRDU 또는 DPI 신호로 표시되는 픽셀의 면적과 강도를 계산합니다.결과를 통해 개별 재배열된 염색체와 그 상동 염색체에서의 BRDU 통합 정도를 정량화하고 비교할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 개별 세포를 평가하므로, 최근 개발된 고처리량 마이크로어레이 및 DNA 시퀀싱 프로토콜과 비교하여 집단 내 일부 세포에만 존재하는 염색체 재배열의 복제 및 타이밍 변화를 검출할 수 있는 능력을 갖추고 있습니다. 이 방법은 동일한 세포 내에 존재하는 상동 염색체 간의 직접적인 비교를 가능하게 합니다.또한 이는 염색체 복제에 영향을 미치는 염색체 재배열을 명확하게 식별할 수 있는 능력을 갖추고 있습니다. 해당 절차를 시연하며 전체 염색체의 타이밍을 보여줄 사람은 내 실험실의 연구원인 Leslie Smith입니다. 세포를 150 millimeter 조직 배양 접시에 약 70% 합류도(confluence)로 파종하고, 적절한 시간에 세포 배양기로 옮겨 24시간 동안 배양하십시오.수확 전 단계입니다. 10 µg/mL의 BrdU가 포함된 신선한 완전 배지로 배지를 교체하십시오. 세포를 BrdU 포함 배지에서 배양하는 시간은 세포 유형과 종에 따라 다릅니다.일반적으로 G2기는 2시간에서 5시간 사이입니다. 플레이트에서 배양액을 제거하고, 15 mL 원심분리 튜브에 10 mL를 따로 보관하십시오. 세포를 10 mL의 sine으로 헹군 다음, 남은 sine을 진공 흡입으로 제거하십시오.그 다음 0.25% trypsin 5 mL를 첨가하고 세포가 플레이트에서 떨어질 때까지 상온에서 배양합니다. 세포를 회수하여 현탁액을 미리 준비해 둔 배지 10 mL에 옮깁니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 배지를 0.5 mL만 남기고 모두 흡입하여 제거합니다.이제 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포를 충분히 재현탁하여 세포를 삼투성으로 팽창시킵니다. 37°C로 가온된 75 mM 염화칼륨 용액 3방울을 첨가하고, 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 저장액 0.5 mL를 추가로 넣습니다. 이제 저장액의 총 부피를 5 mL로 맞추고 피펫팅하여 혼합합니다.세포 유형에 따라 세포 현탁액을 37 °C에서 20분에서 45분 동안 배양합니다. 세포가 현탁 상태를 유지하도록 튜브를 기울인 채로 배양하십시오. 그 후 400 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.상층액 중 0.5 mm만 남기고 모두 흡입한 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 이때 삼투압으로 팽창된 세포는 매우 취약하므로 세포질 막이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 다음으로, 카노 고정액 세 방울을 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.0.5 milliliters의 고정액을 추가로 넣은 후, 고정액의 전체 부피를 5 milliliters로 맞추고 피펫팅하여 균질한 세포 현탁액을 만듭니다. 이렇게 고정된 세포는 영하 20 °C의 암소에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 원심분리를 통해 고정된 세포를 수확하고, 고정액을 흡입하여 제거한 후, 얼음 위에 놓인 현미경 냉장 보관 상태에서 펠렛을 10배 부피의 고정액에 재현탁합니다.슬라이드를 약 45도 각도로 기울입니다. 세포 현탁액을 한 방울씩 떨어뜨려 넓게 퍼뜨립니다. 고정액을 슬라이드 전체에 붓고 과잉분을 제거합니다.그 다음 슬라이드를 페이퍼 타월 위에 평평하게 놓아 공기 중에서 건조시킵니다. 도립 현미경을 사용하여 샘플에 유사분열 전이(mitotic spreads)가 있는지 평가합니다. 각 슬라이드에 2 XSSC에 희석된 10 µg/mL RNase A 2 µL를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.실온에서 pH 7.0의 2XSSC로 3분씩 세 번 세척합니다. 그다음 실온에서 에탄올 시리즈를 통해 3분 동안 샘플을 탈수합니다. 각 샘플을 실온에서 공기 건조한 후 냉각된 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다.표지된 뉴클레오타이드 DNA 기질 4 µg, 10 X NIC 번역 버퍼, DNTP 믹스 및 NIC 번역 효소를 첨가하십시오. 반응물을 16 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 70 °C에서 10분간 가열하여 반응을 중단시킵니다. 그 다음 얼음 위에서 5분 동안 냉각하십시오.이제 DNA를 에탄올 침전시키기 위해 3 M sodium acetate 48 µL, 0.25 µg/µL cot-1 DNA 160 µL 및 100% ethanol 1.2 mL를 첨가합니다. 샘플을 -80 °C에서 10분 동안 또는 하룻밤 동안 보관하여 DNA를 침전시킨 후, 원심분리를 통해 침전물을 회수하고 70% ethanol로 세척합니다. 공기 건조된 DNA 프로브를 2회 증류수 40 µL에 재현탁하여, BAC-SEP 동시 하이브리드화에 사용할 표지된 BAC DNA의 최종 농도를 100 ng/µL로 맞춥니다. 동봉된 원고에 상세히 설명된 대로 cot-1 DNA가 포함된 두 개의 별도 프로브 칵테일을 준비합니다.프로브 칵테일을 75 °C에서 10분 동안 변성시킵니다. 그다음 37 °C에서 30분 동안 배양하여 cot 1 DNA가 반복 서열에 결합하도록 합니다. 이제 백 프로브(back probe)와 S 프로브를 3:2 비율로 혼합하여 샘플당 25 µL가 되도록 준비합니다.샘플을 변성시키기 위해 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드를 72°C의 70% formamide 2XSSC 용액에 담그고 3분 동안 배양합니다. 즉시 4°C에서 에탄올 시리즈를 통해 3분 동안 샘플을 탈수시킵니다.프로브 준비를 마치기 전, 각 샘플을 실온에서 약 10분 동안 공기 건조합니다. 슬라이드 워머를 사용하여 슬라이드를 45 °C에서 평형화합니다. 그 다음, back S 프로브 혼합액 25 µL를 첨가합니다.각 슬라이드에 커버슬립을 조심스럽게 배치하고, 하이브리드화 단계를 위해 고무 시멘트로 모든 가장자리를 밀봉합니다. 습윤 챔버에서 37°C로 하룻밤 동안 샘플을 배양합니다. 38~40°C의 50% IDE 2X SSC pH 7.0 용액에서 3분씩 3회 하이브리드화 후 세척을 수행합니다.세척의 최적 온도는 프로브에 따라 다릅니다. 배경 하이브리다이제이션(background hybridization)이 심한 경우 세척 온도를 높이십시오. 반대로, 프로브 신호가 약하고 배경이 없다면 세척 온도를 낮추십시오.실온에서 PN 버퍼로 3분 동안 한 번 세척합니다. BRDU 검출을 위해 각 슬라이드에 200 µL의 PNM 블로킹 버퍼를 첨가합니다. 암소 실온에서 10분 동안 배양한 후, 페이퍼 타월 위에서 슬라이드의 액체를 제거합니다.그 다음 50 µg/mL anti B-R-D-U-F-E 접합 항체 100 µL를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 실온에서 PN 버퍼로 3분씩 세 번 세척합니다. 각 슬라이드에서 과량의 PN 버퍼를 제거합니다.그 다음 dappy Antifa 마운팅 용액 20 µL를 추가합니다. 슬라이드 위에 종이 타월을 덮고 커버 슬립을 눌러 기포와 과잉 마운팅 용액을 밀어냅니다. CCD 카메라가 연결된 형광 현미경으로 이미지를 캡처합니다.100x 대물렌즈와 자동 필터 휠 및 CytoVision 소프트웨어를 사용하여, FITC 필터로 BrDU를 캡처하고, Cy3 또는 Texas Red 필터로 염색체 페인트, 백(back) 및 중심체 프로브를 캡처하십시오. 또한, 핵 염색을 위해 DAPI 필터를 사용하십시오. CytoVision 소프트웨어에서 백 EP 또는 염색체 특이적 페인트 프로브를 사용하여 관심 있는 개별 염색체를 식별하십시오.중기 분산 표본에서 관심 있는 각 염색체를 전체적으로 잘라냅니다. DPI 및 FITZY 염색체 이미지를 새 창에 복사하여 붙여넣습니다. 도구 메뉴에서 그래프 아이콘을 선택하면 각 개별 염색체를 따라 Fitz 및 dappy 염색의 면적과 강도를 나타내는 그래프를 생성할 수 있습니다.이는 염색체의 단완에서 장완까지 길이에 따라 선을 그려 수행합니다. 도구 메뉴에서 데이터 아이콘을 선택하고 ZI 및 dpi에 대해 계산된 면적과 강도를 표시하는 표를 생성합니다. 다음으로, 관심 있는 염색체의 ZI 및 DPI 신호를 선택합니다.그다음 표 아이콘에서 intensity와 area 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어는 각 신호에 대해 평방 인치당 픽셀의 수치 측정값을 생성합니다. 이어서, 각 염색체의 평균 픽셀 강도를 해당 픽셀이 차지하는 면적에 곱합니다.염색체의 최신 복제 영역 시각화를 위한 총 픽셀 수를 구하려면, 활발하게 복제되는 염색체 영역의 BRDU 통합 밴드 패턴을 평가하십시오. 그런 다음 BRDU 밴딩 패턴의 차이를 기반으로 염색체 쌍 간의 복제 타이밍 차이를 계산하십시오. 포유류 세포의 염색체는 시간적 프로그램에 따라 복제되며, S기의 시작과 끝에 각각 조기 복제와 후기 복제가 일어납니다.포유류 세포의 전형적인 S기는 8에서 10시간 동안 지속되며, G2기는 보통 2에서 5시간입니다. 이 실험 시스템에서는 BRDU를 점진적으로 더 긴 시간 동안 첨가하여, 이들 세포가 가진 염색체 복제의 마지막 부분들을 표지합니다. 해당 세포들은 6q16.1에 위치한 인간 as a R six 유전자의 결실을 포함하고 있습니다. BRDU로 5시간 동안 처리한 후 유사분열 세포를 수확하여 BRDU 결합 및 염색체 6번 페인트 프로브를 이용한 형광 인시튜 하이브리드화를 위해 처리한 결과, 두 개의 6번 염색체에서 세 개의 형광 표지가 나타납니다.BRDU 밴딩 패턴의 현저한 차이는 두 개의 6번 염색체 중 하나에서 복제 시기가 2시간 이상 지연되었음을 나타냅니다. Cyto vision 소프트웨어는 두 개의 6번 염색체에서 DPI와 BRDU의 서로 다른 신호 강도 프로파일을 보여주며, 이는 비동기적 복제를 시사합니다. 또한, DPI 염색에 대한 유사한 분석과 비교했을 때 BRDU 통합의 총량에서도 상당한 차이가 나타납니다.인간 AR six 유전자를 포함하는 백 프로브(back probe)를 사용하면 이 세포에서 긴 팔(long arm)에 결실이 있는 단일 6번 염색체가 강조됩니다. 흥미롭게도, 비-ED 6번 염색체보다 더 강한 BrdU 통합과 더 확장된 BrdU 통합 밴딩 패턴이 관찰됩니다. 7개 서로 다른 세포의 분열기 전개도(mitotic spreads)를 처리하여 두 6번 염색체 간의 복제 시기 차이를 정량화하였습니다.BRDU 수치는 결실된 6번 염색체와 비결실된 6번 염색체의 전체 픽셀 값 사이에서 2배 이상의 차이를 보입니다. 이 기술을 숙달하면 3일 이내에 적절하게 수행할 수 있습니다. 이제 동일한 세포 내에 존재하는 상동 염색체의 복제 및 타이밍을 측정하는 방법과, 복제 변화와 상관관계가 있는 염색체 재배열을 명확하게 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다.전체 염색체의 타이밍.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Schumacher, D., 그리고 Sogaard-Andersen, L. 느리게 성장하는 사회성 박테리아 Myxococcus xanthus 의 완전한 영양 세포 주기의 형광 생세포 영상. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 박테리아 세포 분열 중 형광 태그된 염색체 기원을 추적하기 위해 생세포 영상을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 타임랩스, 위상 차이 현미경 및 형광 현미경을 사용하여 염색체 분리 역학을 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 염색체 분리 타임랩스 영상

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

우리는 면역형광과 결합된 쉽게 맞춤화된 가닥 특이적 형광 FISH(in situ hybridization) 프로토콜을 개발했습니다. 이를 통해 RNA 역학을 자세히 조사하고 단일 세포 수준에서 염색질 구조, 핵 조직 및 전사 조절에 대한 통찰력을 동시에 얻을 수 있습니다.

빠른 형광 현장에서 하이브리드 프로토콜

여기에서는 슬라이드 장착형 염색체에서 반복적인 이색성 염기서열을 시각화하기 위해 형광 DNA 제자리 혼성화(DNA ISH)를 수행하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 최소한의 시약만 필요하며 짧거나 긴 프로브, 다양한 조직, 형광 또는 비형광 기반 신호로 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

여기서는 대장균의 복제 분기점을 멈추고 붕괴시키기 위해 부위 특이적이고 가역적인 생체 내 단백질 블록을 사용하는 시스템을 설명합니다. 복제 블록의 설정은 형광 현미경으로 평가하고 중성 2차원 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 복제 중간체를 시각화합니다.

사이트 특정 복제 막힘의 유도<i&gt; E. 대장균</i&gt; 형광 리프레 운영자 시스템을 사용하여

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높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

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Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

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이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.

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이 프로토콜은 크로마틴에 응축수를 만들기 위해 화학적으로 유도된 단백질 이질화를 보여줍니다.  화학 이량제와 텔로미어에 대미원식 백혈병 (PML) 핵 체의 형성이 입증된다. 물방울 성장, 용해, 국소화 및 조성물은 살아있는 세포 이미징, 면역 형광 (IF) 및 시상 혼성화 (FISH)에서 형광으로 모니터링됩니다.

텔로미어의 화학적 이산화 유발 단백질 응축수

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

학습하세요 BrdU 표지와 FISH를 결합한 염색체 복제 타이밍 정량 분석법을 통해 포유류 세포에서 재배열된 염색체와 정상 염색체의 복제 시기를 직접 비교하는 방법을 익히세요.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍

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