Name: 기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 학습하세요 Type I 콜라겐 단량체로부터 native, fibrous long spacing, segmental long spacing 콜라겐을 재현 가능하게 합성하는 방법을. 원자력 현미경을 활용한 구조 분석 기법이 포함되어 있습니다.

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우리는 우리의 실험실에서 콜라겐 fibrogenesis 연구를 위해 자신의 시간과 노력을 기부 한 모든 많은 과거의 학부, 대학원 및 사후 박사 학생을 감사드립니다. 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회는 지속적으로 우리의 콜라겐 연구를위한 기금을 제공하고 있습니다.

참고 : 모든 프로토콜에 사용되는 물 저항&gt; 18이 MΩ.cm. 1. 기본 콜라겐 원 섬유 <ol><li> 물 6 μl, 200 MM 20 μl이 HCL과 microfuge 튜브와 혼합의 KCl 400 MM의 10 μl로 pH를 7 조정 HPO 4 오세영 조화를 이루고 있습니다. </li><li> microfuge 튜브와 혼합에 콜라겐 단량체 (0.01 N HCL에 ~ 3 MG / ML) 4 μl를 추가합니다. 이 솔루션은 명확하고 무색해야합니다. </li><li> 37 미리 예열 된 열 블록에 반응 혼합물을 포함하는 microfuge 튜브를 삽입 ° C 및 3-4 시간에 출발합니다. 이 시점에서, 솔루션은 약간 흐리다 주로 기본 콜라겐 원 섬유를 포함해야합니다. </li></ol> 2. 섬유 긴 간격 콜라겐 <ol><li> 실온에서 24 시간에 걸쳐 물 네 번 변화, 물 400 ML에 대해 12-14 kDa MWCO 막을 사용하여 콜라겐 단량체 (0.01 N HCL에 ~ 3 MG / ML) 1 ML을 Dialyze. dialyzed collag바로 사용하지 않는 전용 모노머는 4 ° C에서 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. </li><li> 물을 20 μl 물 3 MG / ML α1-산성 당 단백질의 20 μl와 microfuge 관 dialyzed 콜라겐 모노머의 20 μl 조화를 이루고 있습니다. 이 솔루션은 명확하고 무색해야합니다. </li><li> 30 분 동안 실온에서 반응 혼합물을 포함하는 microfuge 튜브 둡니다. 이 시점에서, 솔루션은 흐린이어야하며 주로 FLS 콜라겐 원 섬유를 포함해야합니다. </li></ol> 3. Segmental 긴 간격 콜라겐 <ol><li> 물을 67 μl, 산도 3.3 100 MM 글리신 - HCL 버퍼 60 μl와 microfuge 튜브와 혼합의 물에서 10 MG / ML ATP의 40 μl 조화를 이루고 있습니다. </li><li> microfuge 튜브와 혼합에 콜라겐 단량체 (0.01 N HCL에 ~ 3 MG / ML) 33 μl를 추가합니다. 이 솔루션은 명확하고 무색해야합니다. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 반응 혼합물을 포함하는 microfuge 튜브 둡니다. 이 시점에서, 해결책은 아직 확실 나타나지만해야합니다대부분 SLS 콜라겐이 포함되어 있습니다. </li></ol> 4. AFM 특성 <ol><li> 다니엘 끈적 테이프의 한 부분으로 운모 표면을 덮고하여 다음을 멀리 필링 AFM 기판에 부착 된 운모의 한 부분의 표면. 운모의 전체 층이 표면에 위반을 줄이고 운모를 재사용하는 경우 기존의 샘플이 제거되어 있는지 확인하기 위해 흘리고되었는지 확인하기 위해 나중에 테이프를 확인합니다. </li><li> 갓 흘리고 운모 기판에 콜라겐 섬유 솔루션 20 μl을 적용합니다. 5 분에 출발합니다. </li><li> 부드럽게 물과 콜라겐 섬유의 솔루션을 씻어 내 버리지. 직접 운모 기판의 중심에 있지만 가장자리에 물을 적용하고 샘플을 가로 질러 흐르고 허용하지 것이 좋습니다. </li><li> 질소 가스의 완만 한 흐름에 따라 표면을 말린다. 이 운모 기판의 중심에서 가장자리에서 스트림이 아닌을 지시하는 것이 좋습니다. </li><li> 200 × 배율의 광학 현미경에 따라,기본 및 FLS 콜라겐 샘플 원 섬유의 clumps를 표시합니다. SLS의 콜라겐이 표시되지 않습니다. </li><li> 세 가지 콜라겐 구조의 독특한 특성은 AFM으로 관찰 할 수 있습니다. 일반적으로, 실리콘 AFM 프로브를 사용하여 간헐적 접촉 모드에서 AFM과 우리는 이미지를 기본 콜라겐 원 섬유, FLS와 SLS의 콜라겐이 접촉 모드에서 AFM과 우리가 일반적으로 이미지 실리콘 질화물 AFM 프로브를 사용하여 원 섬유 반면. 우리는 때문에 시간과 비용을 고려이 작업을 수행합니다. 실리콘 AFM 프로브는 일반적으로 이미지 기본 콜라겐 원 섬유의 좁은 구간 구조들이 특히 유용한 실리콘 질화물 AFM 프로브보다 선명합니다. 그러나, 실리콘 AFM 프로브는 실리콘 질화물 AFM 프로브보다 콜라겐 샘플의 오염에 대해 더 많이 경향이 자주 교체해야합니다. 따라서, 우리는 대부분 해상도가 더 필요합니다 이미징 기본 콜라겐 원 섬유에 대한 실리콘 AFM 프로브의 사용을 보유 우리는 prol에 간헐적 접촉 모드에서 작동유용성의 긴 사연은 평생. </li></ol> 우리는 적어도 몇 콜라겐 구조를 표시해야합니다 초기 100 × 100 μm이 검사를하는 것이 좋습니다. 그 안에서, 확대에서 10 사이즈 × 10 μm 2 다음 2 × 기본 및 FLS 콜라겐, 또는 SLS 콜라겐의 미세한 기능의 구간 주기성을 관찰하는 두 μm 2 스캔합니다. 또한 초기 스캔이 대표인지 확인하기 위해 콜라겐 샘플에 적어도 두 개의 다른 지역을 확인하는 것이 좋습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

콜라겐 단량체를 정화하는 것은 낮은 산도와 온도에 안정적이며, 기본 콜라겐 원 섬유의 형성은 기본적으로 콜라겐 모노머 솔루션의 pH 및 온도를 높여 포함됩니다. 단량체의 밴드 콜라겐 원 섬유의 reconstitution에 대한 절차는 50 년 이상 동안 존재했습니다. 15 년 전 콜라겐과 첫 번째 연구에 사용 된 저희 연구실은 7 절차에 따라되었음을 절차는 1986 10 채프만과 동료에 의해 ​​요약. 그 이전 일에 콜라겐 섬유 형성을위한 조건은 34에서 오세영이 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0.2, 산도 7.4) 버퍼에 0.18 MG / 콜라겐 모노머의 ML ° C. 있었다 이것과 우리가 노력 한 다른 절차의 단점은 원하는 밴드 원 섬유와 함께 형성 항상 unbanded 원 섬유가 있다는 것입니다. 새로운 조건 ~ 산도​​ 7 100 MM 인산과 100 밀리미터 KCl의 0.3 MG / 콜라겐 모노머의 ML 3-4 시간에 37 ° C에서 떠났다.에게 procedure는 기본 콜라겐 원 섬유를 만들기 위해 이전 절차에서 모든면에서 차이가 여기에 설명했다. 하지만 대부분의 현저하게, 우리는 버퍼 농도를 높여 100 밀리미터 KCl을 추가하여 이온 강도를 두 배로했습니다. 독점적 밴드 콜라겐 원 섬유의 더 일관성 형성에 이온 강도 결과에 증가하고 있습니다. 콜라겐 모노머 솔루션은 사용 제조업체의 권장 기간을 통과했을 때 우리의 경험에서이 절차는 기본 유형 콜라겐을 생산하지 않은 유일한 시간이었다. 이 문제가 발생하면, 어떻게 모든 여전히 관찰 많은 원 섬유에 unbanded하지만 주로 unbanded 아르 이하의 원 섬유의 범위를 관찰합니다. 유효 기간이 만료 콜라겐 모노머은 종종 여전히 기본 콜라겐를 만들기 위해 사용할 수 있지만, 실패 할 경우, 새로운 콜라겐 모노머은 분명히 구입해야합니다. FLS 먼저 Highberger 외에 의해 확인되었다. 콜라겐 준비에 17 Orekhovic에 반영H 외. 18. 또한 연구 Highberger와 슈미트는이 FLS (12)의 형성을 촉진 α1-산성 당 단백질이라고 빠졌다는 생각이 들어서. 우리는 나중에 상업적으로 이용 가능한 콜라겐 모노머과 낮은 산도에서 α1-산성 당 단백질을 결합 천천히 산도는 24 시간 11 물에 대한 혼합물을 dialyzing으로 증가 할 수 있으므로 FLS의 콜라겐을위한 절차를 복제 할 수있었습니다. 우리는 지금 첫번째 물에 대한 콜라겐 모노머를 dialyzing하고 간단하게 FLS의 콜라겐을 형성하기 위해 물에 α1-산성 당 단백질과 결합하여 그 절차의 수정을 제시한다. 여기에 설명 된 FLS 콜라겐 조립 조건은 훨씬 더 많은 시간이 소요됩니다. 콜라겐 모노머는 아직 물에 대한 사전 dialyzed 할 필요가 있지만 대량으로 수행 한 후 ° C 안정적이 사용 될 때까지 4에 저장할 수 있습니다. 이 새로운 절차 수율은 주로 밴드 콜라겐 원 섬유를 FLS. 우리의 경험에서, α1-산성 glyco낮은 결합 단백질과 물이 콘텐츠와 단백질, 그리고 추론 높은 당도하여 성공적으로 FLS 원 섬유를 만드는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 우리가 사용하는 α1-산성 당 단백질의 많은 82 이하의 결합 %의 단백질과 물이 콘텐츠가 있다는 것을 제조업체에 문의하십시오. 그리고 너무 오래 기본 콜라겐 합성, 콜라겐 모노머하는 절차로도 FLS의 콜라겐을 생산하는 고장이 발생할 수 있습니다. 또한, 투석에 사용되는 물의 순도는이 절차의 중요합니다. 예를 들어,도에 대한 콜라겐 모노머 ~ 8 MΩ.cm보다는 FLS의 콜라겐을 형성하지 않습니다 콜라겐 솔루션&gt; 18 MΩ.cm 물 결과의 투석. 세 콜라겐 섬유 유형, 할 수있는 가장 쉬운는 SLS의 콜라겐입니다. SLS의 초기 준비는 슈미트와 동료 15 설명했다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 coll를 사용하여 SLS의 콜라겐을위한 12 년 전 그 프로 시저의 적응을 발표agen 14. 절차는 간단하게 2 밀리그램 / ML ATP와 0.05 %에서 0.5 MG / 콜라겐 모노머의 ML (V / V) 산도 3.5 아세트산을 결합하고, 하루 아침에 실온에서 혼합을 떠날 entailed. 우리의 경험에서 제어 할 수 있어야합니다 SLS 조립의 중요한 점은 반응 솔루션의 pH입니다. SLS는 crystallites의 누적 clumps에 더 많은 기본 조건 (~ 산도를 3.6-3.9) 결과에 조립. 더 많은 산성 조건 (~ 산도를 2.9-3.2) 산도 3.3-3.5의 이상적인 조건 하에서 조립 사람들보다 얇은, 더 분리 crystallites의 결과입니다. 이 범위 (&lt;2.8과&gt; 4) 이외의 반응 PHS는 SLS 콜라겐를 얻을하지 않습니다. 과거에는, 우리는 아세트산을 추가하여 반응 혼합물의 pH를 조정. 더욱 절차를 단순화하기 위해이 원고에서 우리는 pH를 제어 할 수 글리신 - HCL 버퍼를 도입했습니다. 위에서 설명한 프로토콜에서 형성된 세 가지 콜라겐 구조는 문자가그 istic 기능은 나노 미터의 해상도를 할 수있는 수단으로 discerned 할 수 있습니다. 기본 및 FLS 콜라겐은 ~ 67 나노 미터와 ~ 270 nm의 periodicities을 구간을 특징으로하고 있습니다. SLS의 콜라겐의 긴 치수는 ~ 360 nm의 것입니다. 우리는 세 가지 콜라겐 구조를 특성화 AFM을 사용하는 방법 구체적으로 설명하고 있습니다. 단, AFM 프로브는 &lt;10 나노 미터 반경을 가지는 연락처 또는 간헐적 접촉 모드에서 AFM 운영은 이미지이 콜라겐 구조를 할 수 있어야한다. 또한, 전자 현미경은 수 있으며 이러한 콜라겐 구조에게 19을 특징하는 데 사용되었습니다. 이러한 절차의 주요 이점은 그들이 원하는 콜라겐은 건설 주로 생산한다는 것입니다. 이 반응에서 찾을 수있다 콜라겐의 유일한 다른 형태는 종종 AFM 이미지의 배경에 표시됩니다 시작 단량체입니다. 기본 및 FLS 콜라겐의 경우, 그들은 쉽게 unrea의 대부분에서 분리 될 수물 결과 네이티브 또는 FLS 콜라겐 펠릿의 반복 원심 분리와 세척로 cted 단위체. 우리는 고급, 상업적으로 이용 가능한 출발 물질을 사용하여 원시, FLS와 SLS의 콜라겐을 만들기위한 간단하고 신뢰성이 절차를 제시했습니다. 이러한 모든 절차에 사용되는 콜라겐 모노머는 정화 형태로 상업적으로 사용할 수 있습니다. α1-산성 당 단백질과 ATP는 상업적으로도 가능에 있습니다.

콜라겐은 세 폴리펩티드 사슬에서 형성 트리플 나선형 구조를 가지고 구조 단백질의 클래스입니다. 이 트리플 나선형 단량체은 또한 점점 더 큰 구조를 형성 할 수있는 hierarchal 방식으로 조립. 1 확인되었습니다 최소 28 유전자 다른 콜라겐 종류가 있습니다. 결합, 콜라겐으로 합성 한 모든 콜라겐 단백질 2 90 %까지 I 지배적 인 양식 회계를 입력과 동물에서 발견 된 총 단백질의 30 %를 차지합니다. 입력 I의 콜라겐은 피부, 인대, 힘줄과 뼈에 fibrillous 구조로 발견됩니다. 원자 힘 현미경 (AFM)과 전자 현미경 (EM) I 기본 콜라겐 섬유는 일반적으로 ~ 67 nm의 3-5 (보통 D-구간로 칭함)의 특징 기간과 구간 표시 형식의 이미지. 제가 콜라겐 모노머는 두 개의 동일한 α1 (I) 체인 하나 α2 (I) 체인보다 각각 더로 구성된 트리플 나선형 heterotrimer입니다 입력긴 천 아미노산. 그것은 긴 길이와 직경 1.4 나노 미터에 300 nm의 크기와 얇은입니다. 콜라겐 단량체가 쉽게 자연적으로 형성된 높은 순서 구조에게 6 파괴함으로써 얻을 수 I를 입력합니다. 우리 7 많은 사람들의 8-10는 이러한 수용성 단량체 빌딩 블록은 다음 체외에서 D-밴드 원 섬유를 (그림 1) 재구성하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 기본 콜라겐 원 섬유뿐만 아니라, 두 개의 다른 높은 순서 콜라겐 구조는 같은 단량체 빌딩 블록을 사용하여 체외에서 형성하는 것으로되어 있습니다. 두 구조는 섬유 긴 간격 (FLS) 및 segmental 긴 간격 (SLS) 콜라겐 (그림 1)입니다. 콜라겐 모노머은 α1-산성 당 단백질과 결합 될 때 FLS 콜라겐은 원래 콜라겐 같은 fibrillous 구조이지만, 원래 콜라겐 11. 체외에서보다 큰 구간 주기성을 특징으로하는, FLS의 콜라겐이 형성 <suP&gt; 12. FLS의 콜라겐은 비록 거의 13도 생체에서 관찰되지 않았습니다. 단량체가 결정 격자 14처럼 레지스터에 정렬되어 있기 때문에 SLS의 콜라겐이 crystallites으로 설명되어 있습니다. 콜라겐 모노머는 아데노신 삼인산 (ATP) 15와 결합 될 때 SLS의 콜라겐이 형성한다. 자연적으로 발생 SLS의 콜라겐은 섬유 아세포의 문화 매체에서 관찰되지만 추출 조직 샘플에서 가능성이 작은 크기와 구별 지형은 16 부족으로 인해.되었습니다 이 원고의 목표는 잘 FLS, 심지어 가장 경험이 연구자가 재현 할 수있는 SLS의 콜라겐과 같은 기본 콜라겐 원 섬유를 만들기에 대한 자세한 절차를 제시하는 것입니다. 상업적으로 이용 가능한 고급 출발 물질을 사용하여, 우리는 가능한 한 간단하게 프로토콜을 만들기 위해 노력하고 아직도 그들을 안정적으로 작동하고 있습니다. 어떻게 다른 콜라겐 구조를 특성화 AFM을 사용하는 방법 또한 자세히만든 s입니다. 이 작품이 높은 순서 콜라겐 구조 중 하나 이상을 공부 및 / 또는 기타 응용 프로그램에서 전구체로 사용하려면 연구자에게 도움이 될하지만, 현재 전문 지식의 부족하거나 조직 샘플에서 작동하도록하지 않으 않습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 / 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> I 콜라겐 모노머를 입력 (~ 3 MG / ML 0.01에서 N HCL) </td><td> Inamed 고급 Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> 롯 1,261,443 (2.9 MG / ML, 산도 2.1) 롯 1,629,346 (3.2 MG / ML, 산도 2.1) 롯 6006 (3.2 MG / ML, 산도 2.1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 연구 Biochemicals 국제 </td><td> A-141 </td><td> 롯 FBJ-1194A </td></tr><tr><td> 소 플라즈마에서 α1-산성 당 단백질 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G3643 </td><td> 많은 051K7440 (89.8 %) 많은 011K7410 (82 %) 많은 065K7405 (71.2 %) 많은 063K7495 (71.9 %) 많은 117K7535 (75.9 %) (단백질 + 수분 함량) </td></tr><tr><td> A1-산 glycopr인간의 플라즈마에서 otein </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G9885 </td><td> 많은 128H7606 (70.9 %) 많은 049K7565V (68 %) (단백질 + 수분 함량) </td></tr><tr><td> 운모 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - 실리콘 SPM-센서 </td><td> Nanoworld </td><td> NHC </td><td> 우리는 간헐적 접촉 모드에 실리콘 AFM 탐침을 사용하는 것이 </td></tr><tr><td> Veeco의 Nanoprobe 팁 </td><td> Veeco (현재 Bruker AFM 프로브) </td><td> NP-S </td><td> 우리가 접촉 모드에 사용하는 실리콘 질화물 AFM 프로브 </td></tr></tbody></table>

기본, 섬유 긴 간격 및 segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

콜라겐 원 섬유는 구조 비계와 기계적 강도를 제공하기 위해 동물 조직의 세포 외 기질에 존재한다. 이러한 기본 콜라겐 원 섬유는 ~ 67 nm의 특성 구간 주기성을 가지고 길이와 직경 1.4 나노 미터에 300 nm의 아르 유형 I 콜라겐 단량체의 계층 총회를 통하여 생체에 형성된다. 체외에서, 그에게 조건을 변화하여 단량체 빌딩 블록이 노출되어, 50 미크론까지의 길이 저울에 이르기까지 독특한 구조는 기본 타입 원 섬유뿐만 아니라 포함 건설뿐만 아니라, 섬유 긴 간격 및 segmental 긴 간격 콜라겐. 할 수 있습니다 여기, 우리는 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 콜라겐 모노머의 세 가지 콜라겐 구조를 형성하기위한 절차를 제시한다. 우리와 다른 사람들이 세 가지 유형의를 만들기 위해 과거에 출판 한 프로토콜을 사용하는 것은 일반적으로 구조의 혼합물로 연결됩니다. 특히, unbanded 원 섬유는 일반적으로 F했다기본 콜라겐을 만들 때 ound, 그리고 섬유 긴 간격 콜라겐을 만들 때 기본 원 섬유는 종종 참석했다. 이 새로운 절차는 거의 대부분 원하는 콜라겐 섬유 종류를 생산의 장점이 있습니다. 원하는 구조의 형성은 원자 힘 현미경을 사용하여 영상으로 확인됩니다.

기본 콜라겐 100 MM 인산에 ~ 0.3 MG / ML 콜라겐 모노머 37에서 왼쪽으로 pH를 7 100 밀리미터 KCl의 반응 혼합물 ° C 3-4 시간에 대한 명확한 ~ 67 나노 미터는 D-구간과 기본 타입 콜라겐 원 섬유를 포함하는 솔루션을 얻을 것입니다 unbanded 원 섬유없이. 200 × 배율의 광학 현미경에서 여러 원 섬유의 clumps는 일반적으로 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경 (그림 2)에서 볼 특히 때 운모 기판에 볼 수 있습니다. 전형적인 예제에서 임의의 100 × AFM의 100 μm이 검사는 일반적으로 긴 5-50의 마이크론 이상의 몇 원 섬유가 표시됩니다 (그림 3A-C). 개인, 구분 콜라겐 원 섬유는 쉽게이 단계에서 식별 할 수 있습니다. 512 × 512 픽셀이 이미지 스캔을 통해 10 × 10 μm 2 스캔 크기로 확대하면 모든 원 섬유가 밴드하는 표시 (그림 3D-F </stroNG&gt;). 정확하게 구간 주기성을 측정하기 위해서는 2 × 2 μm이 스캔 크기 (도 3g-I)로 확대하는 것이 가장 좋습니다. 주기성을 구간 것은 단순히 측정하고 여러 봉우리 나 계곡 사이의 길이 방향의 거리를 평균에 의해 결정될 수있다. AFM 소프트웨어가 허용하는 경우 또는, 1 차원 푸리에도 사용할 수 있습니다 단면 길이 방향을 따라 변환 할 수 있습니다. 그림 4는 섬유와 해당 종 방향 단면의 AFM 높이 이미지를 보여줍니다. FLS 콜라겐 1 MG / ML μ1 - 산성 당 단백질 및 30 분 동안 실온에서 왼쪽으로 물에 ~ 1 MG / ML 콜라겐 모노머의 반응 혼합물은 FLS의 콜라겐 원 섬유의 솔루션을 얻을 수 있습니다. 기본 콜라겐의 경우 관찰되는 것과 유사 원 섬유의 Clumps은 쉽게 200 광학 현미경 × m 아래에있는 운모 기판에 볼 수 있습니다agnification. 전형적인 예제에서 AFM에 의해 무작위로 100 × 100 μm이 검사는 일반적으로 적어도 몇 원 섬유를 표시합니다. 512 × 512 픽셀이 이미지 스캔 크기, 구간 주기성이 표시 10 × 더 정확하게 10 μm이 스캔 (그림 5A) 또는과 2 × 2 μm이 스캔 (그림 5B). 그림 5C로 확대하여 측정 할 수 있습니다 FLS 섬유의 길이 방향이 단면. SLS 콜라겐 2 밀리그램 / ML ATP의 반응 혼합물이와 산도 3.3 100 MM 글리신 - HCL 버퍼에서 ~ 0.5 MG / 콜라겐 모노머의 ML은 2 시간 동안 실온에서 왼쪽으로는 SLS의 콜라겐의 솔루션을 얻을 수 있습니다. 일반적으로, SLS의 crystallites은 광학 현미경으로 표시되지 않습니다. AFM은 SLS의 crystallites의 존재를 확인하기 위해 필요합니다. 전형적인 예제에서 AFM에 의해 무작위로 100 × 100 μm이 검사는 일반적으로 여러가 표시됩니다점. 10 × 10 μm 2 스캔으로 확대하는 것이 여러 SLS의 crystallites (그림 6a가) 표시됩니다. 그리고 2 × 2 μm 두 검사 (그림 6B)가 SLS의 결정자의 미세한 구조를 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> 그림 1. 콜라겐 모노머의 체외에서 형성 될 수있다 콜라겐 원 섬유의 세 가지 구조적으로 다른 형태. AFM 이미지는 모두 같은 크기 규모 (2 × 2 μm 2)에 콜라겐 모노머와 세 개의 높은 순서 콜라겐 구조를 묘사. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> 그림 2. 운모의 기본 콜라겐 원 섬유의 광학 현미경 DIC (A) 손길이 닿지 않은 및 (b) t을 thresholded하고 날카롭게로 ~ 200 × 배율의 디지털 이미지원 섬유를 강조 O. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> 운모에 대한 기본 콜라겐 원 섬유의 그림 3. AFM 이미지. 간헐적 접촉 모드 AFM 진폭 이미지가 표시됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> 그림 4. () 0.5 × 1 μm이 간헐적 접촉 모드 AFM 높이 이미지 (수직 규모 = 100 나노 미터) 및 기본 콜라겐 섬유의 (b)는 길이 방향 단면도. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> 그림 5. 운모의 FLS의 콜라겐 원 섬유의 AFM 이미지. () 10 × 10 μm이 접촉 모드 AFM 편향 이미지, (B) 2 × 2 μm이 접촉 모드 AFM 편향 이미지와 (C)의 길이 방향FLS 콜라겐 섬유의 단면. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> 그림 6. 운모에 대한 SLS의 콜라겐의 AFM 이미지. 간헐적 접촉 모드 AFM 진폭 이미지가 표시됩니다.

간편하고 재현 절차는 일반적인 상업적으로 이용 가능한 유형 I 콜라겐 모노머에서 세 구조적으로 구분 콜라겐 어셈블리를 만들기위한 설명되어 있습니다. 기본 유형은 섬유 긴 간격 또는 segmental 긴 간격 콜라겐은 300 nm의 긴 1.4 나노 미터 직경 단량체 빌딩 블록이 노출되는에 조건을 변화하여 구성 할 수 있습니다.

기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

콜라겐 섬유(Collagen fibrils)는 동물 조직의 세포외 기질에 존재하며 구조적 지지체와 기계적 강도를 제공합니다. 이러한 천연...

이 절차들의 전반적인 목표는 콜라겐 단량체를 사용하여 세 가지 서로 다른 종류의 고차 콜라겐 구조를 재현성 있게 만드는 방법을 보여주는 것입니다. 네이티브 콜라겐은 콜라겐 단량체 용액의 pH를 높여서 만들며, 섬유성 롱 스페이싱 콜라겐은 콜라겐 단량체를 알파 1 산성 당단백질과 결합시켜 만들고, 세그멘탈 롱 스페이싱 콜라겐을 생성합니다.콜라겐은 콜라겐 단량체와 TP를 혼합하여 제조합니다. 최종적으로, 원자간력 현미경(atomic force microscopy)을 사용하여 형성된 세 가지 서로 다른 유형의 콜라겐 구조를 분석합니다. 기존에 발표된 절차와 비교하여 이 프로토콜의 주요 장점은 원하는 콜라겐 구조를 형성하는 과정이 더 간단하고 재현성이 매우 높다는 점입니다. 이 프로토콜들은 지난 10년 동안 저희 연구실에서 개발되었으며, 시작 물질로 신뢰할 수 있는 상용 콜라겐 단량체 공급원을 활용하였습니다. 명확한 67 nm D-banding을 가진 천연 콜라겐 섬유를 생성하는 절차는 저희 연구실의 대학원생인 Calvin Chang이 시연할 예정입니다.먼저 히팅 블록을 37 °C로 예열합니다. 다음으로, 마이크로 원심분리 튜브에 3 mg/mL 콜라겐 단량체 용액 4 µL를 넣어 완충액을 준비하고 잘 혼합합니다. 완성된 용액은 맑고 무색이어야 합니다.천연 콜라겐 피브릴을 형성하기 위해 혼합물을 37 °C로 예열된 히팅 블록 위에 3~4시간 동안 둡니다. 최종 용액은 약간 뿌옇게 보여야 하며, 섬유성 롱 스페이싱 콜라겐을 준비하기 위해 주로 천연 콜라겐 피브릴을 포함하게 됩니다. 먼저, 3 mg/mL 콜라겐 모노머 용액 1 mL를 12~14 kDa 분자량 컷오프 막에 넣습니다.다음으로 400 milliliters의 물을 사용하여 투석하며, 24시간 동안 물을 네 번 교체합니다. 그 후, 투석된 콜라겐 단량체 20 microliters와 초순수 20 microliters, 그리고 물에 용해된 3 milligrams per milliliter 농도의 Alpha one acid glycoprotein 20 microliters를 마이크로 원심분리 튜브에 함께 넣고 혼합합니다.섬유성 폐 간격 콜라겐이 실온에서 30분 동안 조립되도록 둡니다. 이 시간 동안 용액은 투명한 상태에서 탁한 상태로 변하며 섬유성 폐 간격 콜라겐을 형성하게 됩니다. 먼저, 마이크로 원심분리 튜브에 산성 버퍼를 준비하십시오.10 mg/mL 농도의 TP 수용액 40 µL를 완충액에 첨가하고 혼합합니다. 마지막으로 0.01 N 염산에 용해된 3 mg/mL 콜라겐 단량체 용액 33 µL를 첨가하고 잘 섞어줍니다.분절적 장간격 콜라겐(segmental long spacing collagen)을 실온에서 2시간 동안 조립시킵니다. 앞서 설명한 다른 두 가지 형태의 콜라겐과 달리, 이 준비 과정에서의 최종 용액은 투명하게 나타납니다. 원자 힘 현미경(AFM) 또는 FM 분석을 위해 깨끗하고 평평한 표면을 얻으려면, MICA로 제작된 AFM 기판에 점착 테이프 조각을 붙인 후 최소 한 층을 벗겨냅니다.테이프를 확인하여 층 전체가 제거되었는지 확인합니다. 적절한 표면이 확보되면, 마이카 기판 위에 collagen FI 용액 20 µL를 도포하고 5분 동안 둡니다. 5분 후, 마이카 기판 가장자리에 물을 추가하여 시료 위로 10~15초 동안 흐르게 하여 과잉 피브릴을 씻어냅니다.시료 영역에 물을 직접 추가하지 마십시오. 그 다음, 기판의 한쪽 가장자리부터 질소 가스를 완만하게 흘려 표면을 건조시킵니다. 이때 가스 흐름이 시료의 중심을 향하지 않도록 주의하십시오.광학 현미경을 사용하여 200배 배율에서 샘플의 천연 및 섬유성 장간격(long spacing)을 확인합니다. 콜라겐 샘플은 섬유 덩어리를 보이지만, 분절성 장간격 콜라겐은 관찰되지 않습니다. 이를 통해 서로 다른 콜라겐의 고유한 특성을 가장 잘 관찰할 수 있습니다.AFM을 사용하여 처음에는 100 by 100 µm 정사각형 영역을 스캔하고, 이어서 10 by 10 µm 정사각형, 마지막으로 2 by 2 µm 정사각형 크기로 확대하여 스캔합니다. 이는 천연 및 섬유성 폐 간격의 밴딩 주기성을 관찰하기 위함입니다. Collagen은 폐 분절 간격 collagen의 더 미세한 특징들이었습니다.천연 콜라겐 섬유의 경우, 섬유성 장간격(fibrous long spacing)과 분절성 장간격(segmental long spacing) 분석을 위해 실리콘 AFM 프로브를 사용하여 간헐적 접촉 모드(intermittent contact mode)로 원자 힘 현미경을 작동시키십시오. 콜라겐 섬유의 최적의 결과물을 얻으려면 접촉 모드(contact mode)로 원자 힘 현미경을 작동시키고 질화실리콘 AFM 프로브를 사용하십시오. 초기 스캔 결과가 대표성을 갖는지 확인하기 위해 콜라겐 시료의 최소 두 곳 이상의 다른 영역을 확인하십시오.FM의 높은 공간 해상도는 이 비디오에서 설명하는 다양한 콜라겐 조제물을 특성화하는 데 이상적입니다. FM은 천연 콜라겐 섬유, 섬유성 long spacing 콜라겐 및 분절성 long spacing 콜라겐을 쉽게 구분할 수 있습니다. 미분 간섭 대비 현미경과 같은 광학 현미경 기술은 섬유를 보여주기는 하지만, 이러한 방법으로 조제된 세 가지 유형의 콜라겐을 구분 짓는 나노미터 규모의 특징은 보여줄 수 없습니다. 일반적인 샘플에서 FM으로 100 by 100 µm 영역을 무작위로 스캔하면, 길이가 5 to 50 µm인 개별 분리된 섬유가 최소 몇 개는 관찰됩니다.이 단계에서 콜라겐 피브릴(fibril)을 쉽게 확인할 수 있으며, 10 µm x 10 µm 스캔 크기로 확대하면 모든 피브릴에 띠(band)가 형성되어 있음을 알 수 있습니다. 띠의 주기성을 정확하게 측정하기 위해서는 2 µm x 2 µm 스캔 크기로 확대하는 것이 가장 좋습니다. 10 µm x 10 µm 스캔 크기로 확대하면 모든 피브릴이 띠 모양임을 보여줍니다.밴딩 주기성을 정확하게 측정하기 위해서는 2 by 2 µm 크기의 정사각형 스캔 영역으로 확대하는 것이 가장 좋습니다. long spacing 콜라겐 절차에 따라 콜라겐을 준비하면 밴딩 주기가 증가하여 섬유 길이를 따라 270 nm의 반복 단위가 생성됩니다. 일반적인 시료의 경우, FM을 이용해 100 by 100 µm 크기의 정사각형 영역을 무작위로 스캔하면 최소 몇 개의 피브릴이 관찰됩니다.밴딩 주기성은 10 by 10 µm 정사각형 스캔을 확대하여 확인할 수 있으며, 2 by 2 µm 정사각형 스캔을 통해 쉽게 측정할 수 있습니다. 마지막으로, 분절성 장간격 콜라겐(segmental long spacing collagen)은 섬유를 전혀 형성하지 않고 개별 분절 형태로 존재합니다. 전형적인 시료의 경우, FM으로 100 by 100 µm 정사각형 영역을 무작위로 스캔하면 많은 개별 점들이 관찰됩니다.10 by 10 µm 크기의 정밀 영역 스캔에서는 여러 개의 SLS 결정체가 관찰되며, 2 by 2 µm 크기의 정밀 영역 스캔에서는 SLS 결정체의 더 세밀한 구조가 확인됩니다. 이 영상을 시청한 후, 시판되는 콜라겐 단량체로부터 균일하게 성숙한 천연 FLS 및 SLS 콜라겐 구조체를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 콜라겐은 세포 및 조직 배양을 위한 기질이나 지지체로 유용한 생체 적합성 물질입니다.이 절차를 통해 본 연구 및 기타 응용 분야에 적합한 콜라겐 구조를 구축할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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