기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

이 절차의 전반적인 목표는 콜라겐 단량체를 사용하여 재현성을 높이고 세 가지 종류의 고차원 콜라겐 구조를 만드는 방법을 보여주는 것입니다. 천연 콜라겐은 콜라겐 단량체 용액의 pH를 높여 섬유질의 긴 간격을 유지하여 만들어집니다. 콜라겐은 콜라겐 단량체와 알파 1산 당단백질 및 분절 긴 간격을 결합하여 만들어집니다.

콜라겐은 콜라겐 단량체와 TP를 혼합하여 만들어집니다. 궁극적으로, 원자력 현미경은 형성된 세 가지 유형의 콜라겐 구조를 특성화하는 데 사용됩니다. 이전에 발표된 절차에 비해 이러한 프로토콜의 주요 장점은 원하는 콜라겐 구조를 형성하는 데 더 간단하고 재현성이 매우 높다는 것입니다. 이러한 프로토콜은 지난 10년 동안 우리 연구실에서 개발되었으며, 제 연구실의 대학원생인 Calvin Chang이 투명한 67나노미터 DB 밴딩을 가진 천연 콜라겐 섬유를 만들기 위해 시술을 시연하는 출발 물질로 신뢰할 수 있는 상업용 콜라겐 공급원을 활용했습니다.

열 블록을 섭씨 37도로 미리 예열하는 것으로 시작하십시오. 다음으로, 밀리리터당 3밀리그램의 콜라겐 단량체 용액 4마이크로리터의 마이크로 원심분리기 튜브에 완충액을 준비하고 잘 혼합합니다. 결과 용액은 투명하고 무색이어야 합니다.

혼합물을 섭씨 37도의 예열 블록에 3-4시간 동안 올려 놓아 천연 콜라겐 원섬유를 형성합니다. 최종 용액은 약간 흐려야 하며 섬유질의 긴 간격 콜라겐을 준비하기 위해 주로 천연 콜라겐 원섬유를 포함해야 합니다. 첫째, 12-14 킬로달톤 분자량 차단 멤브레인에 1 밀리리터 당 3 밀리그램 콜라겐 단량체 용액 1 밀리리터

다음으로 400ml의 물에 대해 투석하고 24시간 동안 물을 4번 교체합니다. 다음으로, 투석된 콜라겐 단량체 20마이크로리터와 초순수 20마이크로리터 및 밀리리터당 3밀리그램 20마이크로리터를 결합합니다. 물 속의 알파 원 산성 당 단백질을 마이크로 원심 분리 튜브에 함께 넣고 섞습니다.

섬유질 폐 간격 콜라겐이 실온에서 30분 동안 조립되도록 합니다. 이 기간 동안 솔루션은 맑은 상태에서 흐린 상태로 이동하여 아픈 정신적 긴 간격을 형성합니다. 콜라겐. 먼저 마이크로 원심분리기 튜브에 산성 완충액을 준비합니다.

밀리리터당 10밀리그램의 40마이크로리터, 물에 있는 TP를 완충 용액에 넣고 혼합합니다. 글쎄, 마지막으로 0.01에 있는 밀리리터 콜라겐 단량체 용액 33마이크로리터를 추가합니다. 일반 염산과 혼합하여 결합하십시오.

분절 긴 간격의 콜라겐이 2시간 동안 실온에서 조립되도록 합니다. 최종 해결책은 설명된 다른 두 가지 형태의 콜라겐과 달리 이 준비에서 명확해질 것입니다. 원자력 현미경 또는 FM을 위한 깨끗하고 평평한 표면을 얻으려면 운모로 만든 A FM 기판에 접착 테이프 조각을 부착하고 하나 이상의 층을 벗겨냅니다.

테이프를 확인하여 전체 레이어가 제거되었는지 확인합니다. 적절한 표면이 얻어지면 20마이크로리터의 콜라겐 FI 용액을 운모 기질에 바르고 5분 동안 그대로 둡니다. 5분 후, MICA 기질의 가장자리에 물을 첨가하고 10-15초 동안 샘플을 가로질러 흐르도록 하여 과도한 원섬유를 헹굽니다.

시료 영역에 직접 물을 첨가하지 마십시오. 그런 다음 기판의 한쪽 가장자리에서 부드러운 질소 가스 흐름을 사용하여 표면을 건조시킵니다. 스트림을 샘플의 중심에 조준하지 않도록 주의하십시오.

광학 현미경으로 샘플을 200배 배율, 기본 및 섬유질 긴 간격으로 확인합니다. 콜라겐 샘플은 섬유의 덩어리를 보여주지만 분절 긴 간격의 콜라겐은 보이지 않습니다. 다양한 콜라겐의 고유한 특성이 가장 잘 관찰됩니다.

A FM을 사용하여 초기 100 x 100 마이크로미터 정사각형 스캔을 수행한 다음 10 x 10 마이크로미터 정사각형, 마지막으로 2 x 2 마이크로미터 정사각형의 스캔 크기로 확대합니다. 네이티브 및 섬유성 폐 간격의 밴딩 주기성을 관찰합니다. 콜라겐은 분절 폐 간격 콜라겐의 더 미세한 특징이었습니다.

네이티브 콜라겐 fis의 경우, 섬유질 긴 간격 및 분절 긴 간격에 대한 실리콘 A FM 프로브를 사용하여 간헐적 접촉 모드에서 원자력 현미경을 실행합니다. 콜라겐 파이는 접촉 모드에서 원자력 현미경을 실행하고 최상의 결과를 위해 FM 프로브인 실리콘 아질산염을 사용합니다. 콜라겐 샘플에서 최소 두 개의 다른 영역을 확인하여 초기 스캔이 대표적인지 확인합니다.

FM의 높은 공간 분해능은 이 비디오에 설명된 다양한 콜라겐 제제를 특성화하는 데 이상적입니다. 천연 콜라겐 섬유, 섬유질 긴 간격 콜라겐 및 분절 긴 간격 콜라겐을 쉽게 구별할 수 있으며, 미분 간섭 대조 현미경 검사와 같은 광학 현미경 기술은 FIS를 보여주지만 이러한 방법으로 제조된 세 가지 유형의 콜라겐을 구별하는 나노미터 규모의 특징은 표시할 수 없습니다. 일반적인 샘플에서 FM에 의한 무작위 100 x 100 마이크로미터 정사각형 스캔은 5-50미크론 길이의 원섬유가 개별적으로 분리되어 있음을 보여줍니다.

콜라겐 파이는 이 단계에서 쉽게 식별할 수 있으며, 10마이크로미터 정사각형 스캔 크기로 확대하면 모든 파이가 밴드로 묶여 있음을 알 수 있습니다. 밴딩 주기를 정확하게 측정하려면 2x2마이크로미터 정사각형 스캔 크기로 확대하는 것이 가장 좋습니다. 10 x 10 마이크로미터 정사각형 스캔 크기로 확대하면 모든 원섬유가 띠로 되어 있음을 알 수 있습니다.

밴딩 주기를 정확하게 측정하려면 2x2마이크로미터 정사각형 스캔 크기로 확대하는 것이 가장 좋습니다. 밴딩 기간은 콜라겐이 긴 간격 콜라겐 절차에 따라 준비될 때 증가하여 섬유 길이를 따라 270나노미터 반복을 생성합니다. 일반적인 샘플에서 FM에 의한 무작위 100 x 100 마이크로미터 정사각형 스캔은 적어도 몇 개의 원섬유를 보여줍니다.

밴딩 주기는 10 x 10 마이크로미터 정사각형 스캔으로 확대하여 볼 수 있으며 2 x 2 마이크로미터 정사각형 스캔으로 쉽게 측정할 수 있습니다. 마지막으로, 분절 긴 간격의 콜라겐은 섬유를 전혀 형성하지 않고 개별 분절을 형성합니다. 일반적인 샘플에서 FM에 의한 무작위 100 x 100 마이크로미터 정사각형 스캔은 많은 개별 점을 보여줍니다.

더 가까운 10 x 10 마이크로미터 정사각형 스캔은 여러 SLS 결정암을 보여주고 2 x 2 마이크로미터 정사각형 스캔은 SLS 결정 빛의 더 미세한 구조를 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 시중에서 판매되는 콜라겐 단량체로부터 균일하고 성숙한 천연 FLS 및 SLS 콜라겐 구조를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 콜라겐은 세포와 조직을 성장시키기 위한 기질 또는 골격으로 유용한 생체 적합성 물질입니다.

이 절차를 통해 이러한 응용 프로그램 및 다른 응용 프로그램에 대해 바람직한 콜라겐 구조로 시작할 수 있습니다.