Name: 섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 배우세요 토끼 무릎 관절의 골 연골 결함을 치료하기 위한 동종 간엽 줄기 세포 주입법을. 섬유소 혈전을 이용한 이 표준화된 기술은 조직 공학 및 정형외과 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 독일 연구 협회 (부여 HE 4578/3-1)에 의해 부분적으로 FP7 유럽 연합 (EU) 프로젝트 &quot;감바&quot;NMP3-SL-2010-245993에 의해 투자되었다.

중간 엽 줄기 세포의 분리에 대한 기증자 토끼의 A. 준비 (수술실) <ol><li> 세포는 남성 4개월의 나이에 뉴질랜드 화이트 (NZW) 토끼와 약 3kg의 체중에서 격리됩니다. </li><li> 프로포폴 (10 ㎎ / ㎏ 체중 IV)로 마취를 유도하고 나트륨 pentobarbital (100 ㎎ / ㎏ 체중 IV)를 희생. </li><li> 전기 어선과 뒷다리, 뒤 및 아랫배의 털을 면도 모피를 진공. </li><li> 70 % 에탄올로 깨끗이 면도 영역을 소독. </li><li> 조직과 인대에 대한 무딘 집게, 날카로운 가위 (또는 메스)과 뼈 절단기를 사용합니다. </li><li> 다리와 종아리의 두개골 표면을 따라 절개를합니다. </li><li> 하나 날카 롭거나 무딘 절개하여 피부와 피하 조직을 반영합니다. </li><li> 별도의 근육과 경골과 대퇴골의 인대. 깨끗한 절개를 만들기 위해 가능한 한 뼈에 가깝게 커트를 유지합니다. 이 시점에서 경골에서 대퇴골을 분리하지 마십시오. </li><li> THR 컷ough 비구에서 대퇴골의 머리를 분리하는 고관절. </li><li> 경골 - 대퇴골 복합 상승. </li><li> 뼈에 남아있는 연부 조직을 긁어 또는 멸균 천 조직과 뼈를 문질러 메스 블레이드를 사용합니다. 이 시점에서, 대퇴골 및 경골은 여전히​​ 연결되어 있습니다. </li><li> 절단에 의해 슬개골을 제거한 후 마지막으로 별도의 뼈 무릎 관절 인대를 잘라. </li><li> 스프레이 70 % 에탄올과 뼈를 분리, 공기가 건조 세포 배양 배지 (DMEM +는 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep의)) 그 축축한 유지하기로 50 ML의 원심 분리기 튜브에 각각 골을 배치 할 수 있습니다. </li><li> 지금 무균 세포 배양 층류 후드 아래에서 전환합니다. </li></ol> B.는 (세포 배양 후드) 뼈와 확장에서 토끼 MSC의 플러싱 <ol><li> 관에서 뼈를 수집하고 멸균 집게를 사용하여 150mm 접시에 배치합니다. </li><li> 두 뼈 새로운 150mm 접시에 무균 본 및 이동 조각 끝을 제거합니다. </li><li> 메디와 함께 10 ML의 주사기를 채우십시오음 (DMEM), 18 게이지 바늘을 연결하고 골수 구멍에 삽입합니다. </li><li> 그런 다음 접시에 골수를 플러시 매체와 골수 구멍을 씻어. 가능하면 그 후, 다른 쪽 끝에서 린스. 필요한 경우, 끝에서 더를 보았다. 뼈가 파손되었을 경우에, 다만 뼈의 내부를 씻어. </li><li> 주사기로 세포 매체 현탁액을 기음과 서스펜션 골수 구멍과 골수 혈전이 나타납니다 더 이상 뼈를 통해 무료로 부동 때까지 반복적으로 골수를 씻어. </li><li> 일단 골수는 골수 대단히 짧은 시간이 18 게이지 바늘을 통과하여 중단, 모든 뼈에서 수집 된 기능 : 바늘 부착 된 주사기를 작성하고 중간에 강제로. </li><li> 그 후, 50 ML 튜브에 세포의 필터를 통해 현탁액을 필터링합니다. 세포의 손실을 방지하기 위해, 10 ㎖의 배지로 배양 접시에 배를 세척뿐만 아니라 필터링합니다. </li><li> RT에서 5 분 500 XG에 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 Resuspend 세포 펠를 제거등 10 ㎖ 배지에서 (DMEM + 1 % 펜 / Strep의). </li><li> Biocoll 분리 솔루션을 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 별도의 혈액 세포. </li><li> Biocoll는 15 ML 튜브에 솔루션을 분리 5 mL를 입력하고 조심스럽게 RT에서 20 분 (브레이크없이)에 대한 800 XG에 상단과 원심 분리기에 세포 현탁액의 5 ML을 추가합니다. </li><li> PBMC 및 중간 엽 줄기 세포가 인터페이스에 남아있는 동안 Biocoll, 아래로 적혈구 침전 이상이기 때문에 밀도 : 가능한 결과는 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 조심스럽게 15 ML 튜브에 인터페이스를 제거하고 5 ML PBS로 세척한다. </li><li> 로 22 단계에 설명 된 5 ML PBS에 resuspend을 원심 분리하고 2 배를 반복합니다. </li><li> 그런 다음, 실온에서 10 분 (브레이크) 350 XG에서 다시 원심 분리기. </li><li> 10 ML 매체에 resuspend을하고 혈구의 세포를 계산합니다. </li><li> 150mm 요리 약 5 × 10 6의 초기 시딩 밀도에 플레이트 세포. </li><li> 2~3일 후, 다시비 부착 세포를 이동합니다. 당신은 세포 파편을 제거하기 위해 PBS 먼저 씻어해야 할 수도 있습니다. 신선한 완전 배지를 추가 (DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FCS) + 1 % 펜 / Strep의) 후. </li><li> 세포에게 매 3-4 일 (그림 2)를 공급합니다. </li><li> 후에 5-10 일 처음으로 통과 세포. </li></ol> 체외에서 섬유소 혈전의 C. 준비 <ol><li> 이식 날에, 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 3 분 노출에 의해 플라스크 / 접시에서 자기편 세포를 놓습니다. 완전 배지를 추가하여 트립신을 중지합니다. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브에 세포를 배포하고 PBS로 두 번 씻어 내십시오. </li><li> 판 블루 염색에 의한 세포 생존과 번호를 확인합니다. </li><li> 50,000 세포 / microcentrifuge 관을 추가하고 RT에서 5 분 500 XG에서 원심 분리하여 펠렛을 수집합니다. 필요에 따라 적어도 하나 이상의 혈전에 대한 mastermix를 준비합니다. </li><li> 17 μl의 PBS에 세포 펠렛을 resuspend을하고 TISSU의 피브리노겐 구성 요소의 25 μl를 혼합이 17 μL MSC 서스펜션이 장착 된 COL-KIT. </li><li> 생체 내에서 드릴 구멍 (그림 3)에 따라 사전 뚫고 구멍 (3x3.6 mm)와 멸균 플레이트를 가져 가라. </li><li> 첫째, 42 μL 피브리노겐-세포 현탁액와 상단에 다시 4 μl의 트롬빈 용액을 즉시 첨가하여 하나의 구멍에 4 μL 트롬빈 용액 (500 IU / ㎖) 접종. 피펫 팁의 응고를 방지하기 위해 정지를 혼용하지 마십시오. 첫째, 피펫 피브리노겐-세포 현탁액의 50 μl의 볼륨이 표면 장력으로 인해 녹는없이 사전 뚫고 구멍의 가장자리를 돌출됩니다. 그러나 완전한 응고 후 (60 분 후) 응고가 계약하고 사전 뚫고 구멍에 맞습니다. </li><li> 조심스럽게 PBS와 microcentrifuge 관에 무딘 포셉과 장소를 사용하여 혈전을 제거합니다. 2 혈전 / 동물을 준비합니다. </li><li> 수술 방에 혈전을 가져 가라. </li></ol> 섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 D.의 주입<ol><li> 프로포폴의 정맥 주사 (10 mg / kg 체중)에 의해 토끼 (5-6 개월 NZW, 남성, 3.5-4.0 kg 체중)로 마취를 유도. </li><li> 전기 어선 및 진공 모피에서 운영되는 무릎을 면도. 전에 이름이 모든 절차는 수술실 무균 환경의 오염을 방지하기 위해 수술 준비실에서 수행됩니다. </li><li> 삽관 후 1.5 ㎎ / ㎏ / min의 propofol의 0.05 ㎎ / ㎏ / 정맥 분 펜타닐로 마취를 유지합니다. 호 기말 이산화탄소 분압, 산소 포화도와 맥박수를 사용하여 마취를 모니터링합니다. </li><li> 철저하게 면도 무릎을 소독 및 멸균 드레싱 토끼의 나머지 부분을 커버한다. </li><li> 슬개골을 만져 및 슬개골 내측 피부 절개를 수행합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 중간 parapatellar arthrotomy하여 무릎 관절을 엽니 다. 어떤 작은 표재성 혈관을 절단하지 않도록하십시오. </li><li> (그림 4) 측면 슬개골을 치환. </li><li> inspe 후모든 수반 연골 병변이나 관절 이상을위한 무릎 관절의 ction의가 정지 장치 살균 공기 작동 전원 드릴 활차 홈에서 두 골 연골 결손 (깊이 3mm, 여덟 모양의 그림) (직경 3.6 mm)를 생성 (그림 5). </li><li> 결함을 청소하고 멸균 생리 식염수로 헹구어. </li><li> 주입에 앞서, 결함에 섬유소 접착제의 20 μl를 작성하고 결함의 바닥에 균등하게 배포 할 수 있습니다. </li><li> 그런 혈전을 이식 압입 그림 8 - 모양의 결함에. </li><li> 응고 후, 활차 홈에서 슬개골의 위치를​​ 변경하고 몇 번을 구부리고 무릎 스트레칭. </li><li> 옆으로 다시 한번 슬개골을 치환하고 피브리노겐-세포 혈전은 아직도 그 자리에 있는지 확인합니다. </li><li> 다시 슬개골을 교체하고 (모두 흡수 봉합사로 하나의 버튼 봉합사 (4-0 Vicryl)와 지속적인 피부 봉합 (4-0 Monocryl)와 레이어 상처 폐쇄 작업을 완료자료). </li><li> 마지막으로, 수증기 침투성 드레싱 스프레이로 상처를 밀봉하십시오. </li><li> 수술 후 케어, 상처은 7 일 동안 매일 검사합니다. 토끼는 수술 후 진통제 Carprofen 4 밀리그램 / kg SC 매 24 시간 (4 일)와 Buprenorphin 0.03 ㎎ / kg SC 매 12 시간 (2.5 일)에 대해받을 수 있습니다. 무릎의 안정화 (예 : 드레싱)가 필요하지 않습니다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

최근 몇 년 동안, 복잡한 관절 연골 결손 치료의 가능성 - 같은 osteochondritis의 dissecans, 괴사와 외상으로 인한 것과 같은이 - 조직 공학 방법으로는 더 매력적되었다. 앞서 언급 한 병리 기관에서 조직 손상은 연골 뼈까지 확장 서로 다른 고유의 치유 능력 1 특징으로 두 개의 조직을 포함한다. 연골 관절 손상 11,23의 병원성 프로세스 연골 하골의 역할에 대한 관심이 증가가 있습니다. 관절 연골 및 지원 뼈의 기능 조건은 밀접하게 연결되어 있습니다. 어느 조직의 부상에 악영향 기계뿐만 아니라 환경 전체 공동 24의 항상성 균형에 영향을 미칩니다. 관절 운동의 기계적 장애, 성체 형성, 참여 구획 기계 마모 및 마멸을 통해 연골 단위 변경표면을 반대하는 것은 골관절염 1,11의 초기 발병과 발전으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 골 연골 결손의 재생을위한 조직 공학 방법은 호스트 조직 2를 주변에 효과적인...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>0401</td><td></td></tr><tr><td>프로포폴(Propofol)</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin)</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2210</td><td>0.9% NaCl 내 1,000 units/10 &amp;mu;g/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (70%)</td><td>Merck KGaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 용액 (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll 분리 용액</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td>등장성 용액 밀도: 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>펜타닐(Fentanyl)</td><td>DeltaSelectGmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 용액 (0.9%)</td><td>BBraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (Injekt)</td><td>BBraun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>바늘 (Sterican)</td><td>BBraun</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>포셉 (둔단/예단)</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Feather Safety Razor Co</td><td>02.001.30.022</td><td></td></tr><tr><td>연구용 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>골절단기</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>배양 면적 60.1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147.8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>원심분리 튜브 (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>감마 멸균</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 인큐베이터</td><td>Forma Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양용 층류 후드 Hera Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 톱</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 Megafuge 2.0 R</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계수기</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauer</td></tr><tr><td>공압식 전동 드릴</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno</td><td>Baxter</td><td>2546648</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스프레이 드레싱 (OpSite)</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>수증기 투과성</td></tr></tbody></table>

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

연골 관절 결함의 치료는 몇 년 동안 의사를 도전하고있다. 최근 몇 년 동안 관절 연골과 연골 하골의 상호 작용의 이해는 전체 연골 단위의 복원으로 증가 관심을 이끌어 냈다. chondral 병변에 비해 골 연골 결손의 재생은 훨씬 더 복잡하고 훨씬 더 큰 수술 및 치료 도전입니다. 손상된 조직은 표면 연골 층뿐만 아니라 연골 하골에 포함되지 않습니다. 이 osteochondrosis의 dissecans로 예를 들면 발생할 때 깊은 골 연골 손상, 결함의 전체 두께는 접합면을 복원하기 위해 교체해야합니다. 자격 치료 절차는 서로 다른 고유의 치유 잠재력 2이 두 개의 서로 다른 조직을 고려해야합니다. 지난 수십 년 동안 여러 가지 수술 적 치료 옵션이 등장하고 이미 임상 3 설립되었습니다 -6. 자가 또는 동종 골 연골 이식은 관절 연골과 연골 하골의 구성 및 전체 골 연골 장치의 교체를 할 수 있습니다. 결함 표면 3,7,8 덮여 합동 유리 모양의 연골을 제공하는 것을 목표로 원통형의 골 연골 이식으로 채워집니다. 단점 사용할 이식, 공여부 이환율 (자가 이식)과 표면의 부조화의 제한되며 따라서이 방법의 응용 프로그램은 특히 큰 결함이 제한됩니다. 조직 공학 분야에서 새로운 접근이 재생 연골 치료에 유망한 가능성을 열었다. 자가 연골 세포의 이식은 전층 연골 병변의 치료를위한 첫 번째 셀을 기준으로 생물학적 접근 방식을 표시하고 현재 전세계도 10~20년 주입 9,10 후에 좋은 임상 결과와 함께 설정됩니다. 그러나 다에테이 기술은 연골 뼈 11을 포함하는 깊은 결함으로 병변의 모든 종류의 치료에 적합하지 않습니다. 샌드위치 기술은 조직 공학 5,6에서 현재의 접근 방식에 이식 뼈를 결합합니다. 이 조합은 혼자 연골 이식에서 보이는 한계를 극복 할 수있을 것 같습니다. 연골 결손 영역에 이식자가 골 후,자가 연골 세포와 시드 막 위 봉합 및 부상 사이트에 이식 토폴로지에 맞게 용이합니다. 물론, 이전의 뼈 재건은 추가 수술 시간과 자주도 추가 수술이 필요합니다. 또한, 현재까지 장기간 데이터가 12이 없습니다. 이식 추가 골없이 조직 공학 이식 세포의 연골 및 골 형성 가능성 인디언 관절 연골의 복잡한 구조와 특성을 복원하는 것을 목표로하고있다. HoweveR은 다시, 그것은 일반적으로 더 많거나 적은 재생에만 연골 조직이다. 추가 골 연골 손상은 특정 추가 처리가 필요합니다. 동종 /자가 세포를 파종 골 연골 결손의 다층 구조의 재생을 달성하기 위하여, 입체 조직 설계 제품은 좋은 재생 능력 11 제공 할 수 있습니다. 자가 연골 옆에 중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 전층 연골 조직의 개발을위한 매력적인 대안이 될 것으로 보인다. 다수의 전임상 시험 관내 (in vitro)과 생체 내 연구에서, 중간 엽 줄기 세포는 뛰어난 조직 재생 가능성 13,14을 표시했다. 특히 연골 결손의 치료를위한 중간 엽 줄기 세포의 중요한 장점은 골 세포뿐만 아니라 연골 세포의 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. 따라서, 그들은 잠재적 D의 다중 재생을 허용EFECT. 최근 몇 년 동안, 연골 재생 잠재력을 가진 여러 비계 따라서 개발되어 예비 결과에게 1,15-18을 약속으로 평가. 또한, 휴대 캐리어와 같은 섬유소 접착제 실험 연골의 기본 기술 중 하나가되었고 이미 성공적으로 여러 동물 연구에서 19-21, 심지어 최초의 인간 실험 22 사용되었습니다. 다음 프로토콜은 세포 배양의 후속 증식과 섬유소 세포 혈전에 대한 체외 모델에서 표준을 준비, 토끼의 골수에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하는 실험 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 토끼의 무릎 관절의 인공 연골 결손에 미리 설정된 섬유소 세포 혈전 주입하는 기술을 설명한다.

설명 수술 기술은 인공 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포를 성공적으로 분리 및 주입을 허용합니다. 실험 장치는 주변 연골에 임플란트의 성공적인 통합 결과. 결함 주변의 연골에 비해 유사한 역학적 특성과 유사한 내구성 수리 조직에 의해 채워졌다. 섬유소 셀 리넨은 연골 결손 (그림 3)과 같은 크기를 가지고 사전 뚫고 구멍을 가진 살균 접시에 체외에서 제조 하였다. 그 결과로, 이식 섬유소 응고 및 조기 변성 또는 박리 (그림 6)에 대한 위험 요소가 될 것입니다 주변 연골 사이에 갈라진 틈이 없었다. 수리 조직의 기초 치료는 연골 뼈에 침투했기 때문에 보장하고, 따라서 전단에 근무했습니다. 또 다른 중요한 측면은 스티 플러했다수리 조직의 fness는 어떤 그것에 부하가 증가하고 가능한 조기 변성을 피하기 위해 건강한 주변의 연골 조직과 일치해야합니다. 우리의 예비 실험 (데이터 표시되지 않음)에서, ...

토끼의 무릎 관절 연골 결손의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포의 이식은 조직 공학 분야의 유망한 개발을 제공합니다. 섬유소 세포 혈전의 준비<em&gt; 체외에서</em&gt; 주입하기위한 표준화 된 방법을 제공합니다.

골연골 관절 결손의 치료는 수년간 의사들에게 어려운 과제였습니다. 관절의 상호작용에 대한 더 깊은 이해는...

본 절차의 전반적인 목표는 골연골 재생 분야의 실험적 줄기세포 연구를 위한 표준화된 방법을 제시하는 것입니다. 이를 위해 먼저 토끼의 골수에서 중간엽 줄기세포를 분리합니다. 두 번째 단계에서는 분리된 줄기세포를 배양하여 증식을 촉진합니다.다음으로, 피브린 세포 혈전(fibrin cell clots)을 인비트로(in vitro) 방식으로 제조합니다. 마지막으로, 미리 제작된 피브린 세포 혈전을 토끼 무릎 관절의 인공 골연골 결손 부위에 이식합니다. 최종적으로 12주간의 인비보(in vivo) 분석 후 무릎의 육안적 분석을 수행하면, 수복 조직이 단단한 질감과 함께 균일하고 온전한 표면을 나타내는 것을 확인할 수 있습니다.이 기술의 함의는 실험 동물 환경에서의 연골 병변 치료로 확장되며, 이는 연골 손상 치료를 위한 동종 중간엽 줄기세포의 통합 및 재생 능력에 대한 in vivo 분석을 가능하게 합니다. 수술실에서 전기 이발기를 사용하여 안락사시킨 토끼의 뒷다리 뒤쪽과 배 부분의 털을 깎고, 70% ethanol로 삭모 부위를 철저히 소독한 후 동시에 털을 진공 흡입하여 제거합니다. 다리와 종아리의 앞쪽 표면을 따라 절개한 다음, 예리한 박리를 통해 피부와 피하 조직을 젖힙니다.다음으로, 깔끔한 해부를 위해 절개 부위를 뼈에 최대한 가깝게 유지하며 경골과 대퇴골에서 근육과 인대를 분리합니다. 그런 다음 고관절을 절개하여 대퇴골두를 비구에서 분리하고 경골-대퇴골 복합체를 들어 올립니다. 이제 메스 날을 사용하여 뼈에 남아 있는 연조직을 긁어내어 제거합니다.그런 다음 슬개골과 무릎 관절 인대를 절단하여 다리뼈를 완전히 분리합니다. 분리된 뼈가 자연 건조된 후 70% ethanol을 분무합니다. 각 뼈를 멸균된 세포 배양 상태에서 습기를 유지할 수 있도록 세포 배양 배지가 들어 있는 별도의 50 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다.층류 정화 작업대(Laminar flow hood). 멸균 핀셋을 사용하여 원심분리 튜브에서 수확한 뼈를 150 mm 접시로 옮깁니다. 그다음 멸균 톱을 사용하여 뼈의 양 끝단을 모두 제거하고, 분리된 조각들을 새로운 150 mm 접시로 옮깁니다.다음으로, 10 milliliter 주사기에 배지를 채웁니다. 여기에 18 gauge 바늘을 장착하고 바늘 끝을 뼈의 한쪽 끝을 통해 골수로 삽입합니다. 이제 배지로 골수강을 헹구어 골수를 접시 속으로 밀어냅니다.그런 다음 세포 현탁액을 시린지로 흡입하고, 현탁액이 골수강을 통해 자유롭게 떠다니며 더 이상 골수 덩어리가 나타나지 않을 때까지 골수를 반복해서 헹굽니다. 모든 뼈에서 골수를 수집한 후, 바늘을 통해 시린지에 골수 현탁액을 채우고 배지 속으로 골수 현탁액을 강하게 밀어내어 골수 덩어리를 분쇄합니다. 그 후, 세포 손실을 방지하기 위해 세포 필터를 통해 현탁액을 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.배양 접시를 10 milliliters의 배지로 두 번 세척하며, 매 세척 시마다 세척액을 필터에 통과시킵니다. 현탁액을 실온, 500 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 10 milliliters의 배지에 다시 현탁합니다.다음으로, 15 mL 튜브에 bio call 분리 용액 5 mL를 넣고, 그 위에 세포 현탁액 5 mL를 조심스럽게 층 분리하여 가합니다. 층 분리된 용액을 원심 분리하면 적혈구는 바닥에 가라앉고, PBMC와 중간엽 줄기세포는 인터페이스에 남게 됩니다. 인터페이스의 세포들을 15 mL 원추형 튜브로 옮기고, 5 mL의 PBS를 사용하여 수집된 PBMC와 중간엽 줄기세포를 2~3회 세척합니다.그다음 세포를 한 번 더 원심 분리하고 펠렛을 10 milliliters의 배지로 재현탁합니다. 마지막으로 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정한 후, 150 millimeter 디쉬에 초기 파종 밀도를 약 5 × 10⁶으로 하여 분주합니다. 2~3일 후, 부착되지 않은 세포를 제거하여 배양 상태를 유지합니다.이식 당일에 PBS로 플레이트를 헹구어 세포 잔해를 제거하고, 세포에 신선한 완전 배지를 공급합니다. 먼저 부착 세포를 0.25%trypsin EDTA에 3분 동안 노출시킵니다. 완전 배지를 첨가하여 트립신화를 중단합니다.그 다음 분리된 중간엽 줄기세포를 50 milliliter 원심 분리 튜브로 옮기고 PBS로 두 번 세척합니다. trypan blue 염색을 통해 세포 수와 생존율을 확인한 후, n=4를 위해 필요한 최소 한 개 이상의 클롯 분량으로 마스터 믹스를 준비합니다. 200,000개의 세포를 마이크로 원심 분리 튜브에서 원심 분리한 다음, 침전물을 68 microliters의 PBS와 조직 응고 키트의 fibrinogen 성분 100 microliters에 다시 현탁합니다.다음으로, 미리 구멍을 뚫은 멸균 플레이트의 한 구멍에 트롬빈 용액 4 µL를 접종합니다. 즉시 피브리노겐 세포 현탁액 42 µL 전량을 추가한 다음, 세포 현탁액 위에 트롬빈 용액 4 µL를 더 얹습니다. 초기에는 표면 장력으로 인해 피펫팅한 50 µL 부피의 피브리노겐 세포 현탁액이 미리 뚫어 놓은 구멍의 가장자리 위로 돌출됩니다.하지만 한 시간 후면 혼합물이 완전히 응고되어 미리 뚫어놓은 구멍에 맞게 수축될 것입니다. 이제 둔단 포셉을 사용하여 응고물을 조심스럽게 제거한 후, PBS가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣으십시오. 제모한 무릎을 소독한 후, 슬개골 부위를 충분히 촉진하고 슬개골의 내측으로 피부 절개를 실시하십시오.다음으로, 무균 조건 하에 슬개골 내측 절개술(medial para patella arthrotomy)을 통해 무릎 관절을 열고, 슬개골을 외측으로 전위시킵니다. 이제 직경 3.6 millimeter 드릴 비트와 스토퍼가 장착된 멸균 공압식 전동 드릴을 사용하여 활차구(trochlea groove)에 깊이 3 millimeter의 8자 모양 골연골 결손 부위를 두 곳 생성합니다. 그 후, 결손 부위를 멸균 식염수로 헹구고, 접착제가 마르기 전에 20 microliters의 피브린 글루를 결손 부위 바닥에 빠르게 균일하게 도포합니다.압착 적합시킨 응고물을 8자 모양의 결손 부위에 이식합니다. 응고 후, 슬개골을 활차구 내로 다시 위치시키고 무릎을 몇 차례 굽혔다 펴줍니다. 그런 다음 슬개골을 다시 외측으로 전위시켜 피브리노겐 세포 응고물이 여전히 제자리에 있는지 확인합니다.슬개골을 다시 제자리에 위치시킨 후, single button 4-0 Vicryl 봉합사로 층별로 상처를 폐쇄하고, 4-0 Monocryl 봉합사로 피부를 연속 봉합합니다. 마지막으로 수증기가 투과되는 스프레이 드레싱으로 상처 부위를 밀봉합니다. 본 실험에서 결손 부위는 주변 연골과 유사한 생체역학적 특성 및 내구성을 가진 수복 조직으로 채워졌습니다.이 피브린 세포 응고물은 골연골 결손 부위와 동일한 크기로 미리 구멍이 뚫린 멸균 플레이트 위에서 인비트로(in vitro)로 준비되었습니다. 그 결과, 이식된 피브린 응고물과 주변 연골 사이에 틈이 생기지 않았으며, 이러한 틈은 조기 퇴행이나 박리의 위험 요인이 될 수 있습니다. 하골(subchondral bone)을 관통하여 전단력에 저항하도록 처리함으로써 수복 조직의 기초 고정이 보장되었습니다.또 다른 중요한 측면은 수복 조직의 강성이었으며, 이는 관절에 가해지는 부하 증가와 잠재적인 조기 퇴행을 방지하기 위해 주변의 건강한 연골 조직과 일치해야 합니다. 또한, 이식물의 표면이 온전하고 균질하게 형성되어, 개발 후 전단 응력과 잠재적인 임플란트 손상이 감소한 것으로 나타났습니다. 이 기술은 정형외과 줄기세포 연구 분야의 연구자들이 골연골 결손에 대한 치료 옵션과 실험 동물 모델을 탐색하는 길을 열어줄 수 있을 것입니다.일부 동물 준비 및 무릎 수술 기법에 대한 더 자세한 시연을 위해, 저희의 보조 JoVE 논문인 토끼 모델에서의 연골 결손 리모델링 및 복구를 위한 기질 보조 자가 연골 세포 이식(matrix assisted autologous chondrocyte transplantation)을 반드시 시청하시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

프레 젠 테이션의 목표는 MR 영상과 시각 수있는 연골의 결함에 매트릭스 관련 줄기 세포 이식을 생성하는 높은 재현성 방법을 입증하는 것입니다. 줄기 세포는 아가로 오스와 혼합 FDA 승인 Ferumoxides, 연골의 결함에 심어 및 7T MR 스캐너와 함께 몇 군데으로 표시됩니다.

Ferumoxides의 이식은 연골의 결함에 인간 Mesenchymal 줄기 세포로 표시

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와...

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

토끼의 무릎 관절 chondral 결함의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 매트릭스 시드자가 연골 세포의 이식은 만족 장기적인 결과를 제공 관절 연골 병변의 개조 및 수리를위한 잘 받아 들여진 방법입니다. 매트릭스를 이용한자가 연골 세포 이식 (MACT)는 표준화 된 임상 설립 주입 방법을 제공합니다.

토끼 모델에서 Chondral 결함의 리모델링 및 수리를위한 매트릭스를 이용한자가 연골 세포 이식

동물 모델은 조직 공학 이식편을 평가하기 위한 중요한 도구입니다. 이 논문은 전방 십자 인대 조직 공학에 사용하기 위한 전기 방사성 생분해성 고분자 이식편을 준비하기 위한 프로토콜과 쥐 모델에 이식하기 위한 수술 프로토콜을 제시합니다.

엔지니어링 전방 십자 인대 이식의 평가 흉선 쥐 모델

이 연구의 목적은 microfractured 고 순화 된 지방 유래 줄기 세포를 사용 하 여 탈 러 스의 osteochondral 장애의 절경 치료에 대 한 프로토콜을 보고입니다.

헌 Microfractured 고 순화 된 지방 조직에서 탈 러 스의 Osteochondral 장애의 절경 관리에 대 한

이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가

이 문서 간단 분리와 뉴질랜드 백색 토끼 활 액 액체에서 중간 엽 줄기 세포의 정화에 대 한 간단 하 고 경제적인 프로토콜을 제공합니다.

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여기, 선물이 지방 조직 유래 stromal 혈관 분수와 인간의 골 관절염 환자에서 연골 같은 조직의 재생성 하 여 무릎 기능을 개선 하는 응용 프로그램을 생성 하는 프로토콜.

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중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

제안된 프로토콜은 다중 모드 분석을 사용하여 뼈 재생의 맥락에서 뼈 형성을 평가하기 위한 글로벌 접근 방식을 수반합니다. 새로운 뼈 형성에 대한 정성적 및 정량적 정보를 제공하여 기초 및 전임상 조사의 엄격성과 타당성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

Ex vivo 모델에서 조직 광물화의 포괄적인 특성 분석

여기서는 양 무릎에서 통제된 골연골 병변을 생성하는 통합 프로토콜을 제시하여 뼈 및 연골 조직 재생 연구에 적합한 실험 모델을 구축합니다. 프로토콜은 동물 복지에 미치는 영향과 결과 변동을 최소화하는 기법을 사용하여 대퇴골 과과에 전층 골연골 결손을 유도하는 방법을 제시합니다.

전층 골연골 결함의 양 모델 구축 및 평가

배우세요 토끼 무릎 관절의 골 연골 결함을 치료하기 위한 동종 간엽 줄기 세포 주입법을. 섬유소 혈전을 이용한 이 표준화된 기술은 조직 공학 및 정형외과 연구에 활용됩니다.

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

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