2012년 12월 31일
우리는 stomatal 차별화를 문서화, 개발 며칠 동안 표피의 공 촛점 이미징을위한 식물 cotyledons를 고정하기 위해 챔버 슬라이드 및 미디어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 형광 태그 단백질은 세포 분열과 세포 형 차별화 중에 가능한 역할의 이해를 증가 표현과 subcellular 지방화에 의해 동적으로 추적 할 수 있습니다.
다음 실험의 목적은 세포 수준에서 종자 발아 후 표피 발달의 초기 이벤트를 시각화하는 것입니다. 이것은 두 번째 단계로 코신을 명확하게 볼 수 있도록 먼저 종자 코팅을 제거함으로써 달성됩니다. 코신(kosin)은 한천 배지(agar media) 층 아래에 장착되어 고정되어 고정되고 발달을 지원하며, 다음 타임랩스 이미징은 생체 내에서 표피 세포의 성장과 분열을 관찰하기 위해 며칠에 걸쳐 수행됩니다.
가시적 형광을 기반으로 역동적인 유전자 발현과 단백질 국소화를 보여주는 결과를 얻었습니다. Gus 염색 또는 GFP 융합의 정지 이미지와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포 분열 및 분화 중에 단백질의 역동적인 움직임을 보여준다는 것입니다. 이 실험을 위한 애기장대 씨앗은 가정용 표백제 33%와 트리톤 X 0.1%로 만든 씨앗 살균 용액에서 살균하고, 1.7ml 튜브에 원하는 형광 리포터 구조 및 유전자형을 담은 씨앗 100개를 놓고 1ml의 살균 용액을 바르고 15분 동안 돌연변이체에서 배양합니다.
멸균 후드에서 피펫을 사용하여 씨앗을 남기고 튜브에서 멸균 용액을 제거합니다. 1ml의 멸균수로 헹굽니다. 네 번째 헹굼 후 4회 반복합니다.
섭씨 4도에서 이틀 이상 배양합니다. 챔버 슬라이드 매체를 준비하려면 200 밀리리터 플라스크에 0.5 % 용액 20 밀리리터를 물에 넣고 한천에 넣고 녹을 때까지 전자 레인지에 혼합합니다. 용액을 끓일 때 주의하십시오.
용액을 약 섭씨 60도라고 합니다. 용액이 너무 뜨겁거나 너무 빨리 적용되면 접착제가 녹거나 챔버 슬라이드의 유리가 깨질 수 있습니다. 한천 용액이 충분히 식으면 피펫으로 1ml를 모아 즉시 챔버 슬라이드 내부의 커버 유리에 천천히 바릅니다.
두 번째 한천 용액을 두 번째 밀리리터 추가합니다. 이제 한천 미디어가 챔버 슬라이드의 바닥을 완전히 덮을 것입니다. 이 최소한의 매체는 수분을 유지하고 가스 확산을 허용하여 4-5일 동안 저장된 영양분을 포함하는 식물 올레인의 발달을 지원하기에 충분합니다.
챔버가 벤치 탑에 덮인 슬라이드를 호출합니다. 이 절차를 시작하려면 섭씨 4도 보관소에서 멸균 종자 튜브를 제거하십시오. 해부 현미경의 무대에 종이 티슈를 놓고 물로 적셔 매끄러운 표면을 만들도록 조정합니다.
조직은 해부 중에 씨앗을 안정화하는 데 사용됩니다. 튜브에서 조직으로 20-30 개의 씨앗을 피펫으로 넣고 해부 범위의 시야에 조심스럽게 놓습니다. 공동 리드인을 해부하는 것은 이 절차에서 가장 어려운 측면입니다.
낮은 배율과 날카로운 집게를 사용하고 매우 조심하면 날카로운 집게를 사용하여 성공적인 해부를 보장하는 데 도움이 됩니다. 내부 묘목에서 종피를 조심스럽게 제거하고 외부 및 내부 외피를 모두 제거해야 합니다. 다음으로, 메스를 사용하여 요람 리드인에서 하이퍼 코틀과 라디칼을 제거합니다.
이미징을 위해 하이퍼 콧과 라디칼을 제거하는 것이 유익한데, 그대로 있으면 하이퍼 콧이 극적으로 곧게 펴지고 길어지기 때문입니다. Koss Leadin을 타임랩스 시야 밖으로 이동 view, 해부된 cos leadin을 물에 잠긴 상태로 유지하십시오. 원하는 Olean 수에 도달할 때까지 종자 해부를 반복합니다.
챔버 슬라이드에 올린을 장착하기 전에 15-20회의 성공적인 해부가 권장됩니다. 코탄 장착을 위해 챔버 슬라이드를 준비하려면 작은 커버 슬립을 사용하여 한천 매체를 절단하고 챔버의 유리 바닥에서 전체 층을 들어 올립니다. 피펫은 홀딩 튜브에서 챔버로 최소한의 물로 코탄
을 밀어 절개했습니다.들어 올려진 한천 층 아래로 미끄러집니다. 한천을 세딘 위로 부드럽게 내립니다. 물이 과도하게 남아 있으면 티슈로 적셔 버리십시오.
장착이 완료되면 세딘을 방해하지 않도록 주의하십시오. 표본이 더 이상 쉽게 움직이지 않습니다. 챔버 슬라이드에 덮개를 놓고 슬라이드를 현미경 스테이지로 옮깁니다.
이미징하기 전에 도립 컨포칼 현미경을 설정하여 원하는 Fluor를 이미징합니다. LSM 700 매개변수는 488나노미터의 GFP 여기 및 수집을 위한 것입니다. 440 - 530나노미터의 대역 통과 필터와 555나노미터의 RFP 여기 및 수집용.
570 - 610나노미터의 대역 통과 필터와 20배 대물렌즈. ACO 도입부에 초점을 맞추고 목표를 챔버 중앙으로 이동합니다. 획득 모드에서 슬라이드하면 확대/축소를 0.5로, 프레임 크기를 48 x 48 픽셀로 변경합니다.
위치 확인란을 선택하고 개요 이미지를 스캔한 다음 수평 및 수직 타일 번호를 30에서 35로 늘립니다. 스캔 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 스캔이 완료되면 치수 탭 아래의 위치 버튼을 클릭하고 각 유아용 침대 리드인에 십자선을 배치하여 관찰합니다.
장착된 시편에 손상이 있는지 검사합니다. 이미징에 적합한 표본만 남기기 위해 손상된 coss leadin에 해당하는 위치를 삭제합니다. 다음으로, 모든 샘플의 coss leadin 표피를 포함하는 Z 시리즈를 설정합니다.
Zack 확인란을 클릭합니다. 위치 목록에서 각 위치를 선택하고 이동 버튼을 클릭합니다. 표피에서 cos lead의 최상부 평면에 초점을 맞추고 Zack 아래에 있는 첫 번째 설정 버튼을 클릭합니다.
표피가 유용하게 보이는 가장 낮은 위치에 초점을 맞춥니다. 그리고 마지막 설정 버튼을 클릭합니다. 최적 옆에 있는 버튼을 클릭하면 설정할 최상의 Z 슬라이스 두께가 표시됩니다.
각 kos lead-in을 확인하여 이러한 설정이 모든 샘플을 포함하는지 확인합니다.amples. Z 매개변수는 개별 위치에 대해 설정할 수 없습니다. 여기에 사용 된 Zen 2009 소프트웨어에서는 원하는 해상도와 3 일 동안 15-30 분의 길이 간격으로 시계열을 설정하면 표피 세포 분열의 단백질 역학에 효과적이지만 필요에 따라 간격을 변경할 수 있습니다.
텍스트 필드에 간격을 30으로 설정하고 풀다운 메뉴를 사용하여 MIN을 선택하여 XY, ZT 다중 위치 스캔을 시작하고 프레임 크기를 원하는 해상도로 변경하고 실험을 시작하여 원하는 이미지 수에 대한 시계열 설정 주기의 시계열 확인란을 클릭합니다. 위치 수는 스캔 사양에 의해 제한되어야 합니다. 총 스캔 시간이 원하는 간격보다 크면 시점이 정확하지 않습니다.
이 시스템을 사용하면 30분 간격으로 59 Z 슬라이스에서 GFP 및 RFP를 이미징할 때 최대 6개의 동시 위치가 가능합니다. 이 방법으로 수집된 정보 시점 집합의 예가 여기에 나와 있습니다. 세포막은 RFP로 표지되고 GFP는 천연 프로모터 아래에 극성 단백질을 융합합니다.
시리즈 A에 있는 이미지는 극지 GFP가 처음에 균등하게 배부된 후에 화살촉에 의해 나타난 불균형 분열 대략 2 시간 전에 나타나는 것을 보여줍니다. Polar GFP는 47시간에 화살촉으로 표시된 초기 비대칭 분열을 따라 시리즈 B의 초기 마이스터 OID의 위치에서 분리됩니다. 극성 GFP는 두 세포 모두에서 사라집니다.
meris oid에 의해 보호 모세포 상태로의 빠른 전환을 암시하며, 별표로 표시된 보호 모세포는 대칭적으로 분열하고 분화하여 기공 보호 세포를 형성하는 반면 cysto 세포는 아마도 나중에 비대칭 분열보다 먼저 극성 GFP 발현을 회복합니다. 여기에 표시된 것은 하나의 기공 전구 세포의 증폭 및 간격 중 극성 GFP 국소화에 대한 간소화된 등록 비디오입니다. 초기에 극성 GFP는 발아 후 39시간까지 세포에서 균일하게 나타납니다.
그것은 40 시간에 분열 직전에 강하게 분극하여 세포의 반대쪽 끝에 더 작은 하녀를 배치합니다. 오른쪽의 더 큰 세포도 기공 계통 정체성을 회복하고 45시간이 지나면 Polar GFP 국소화가 기공 전구체에 인접하게 이동합니다. 47 시간에 사단은 첫 번째 나 stamoid에서 왼쪽의 기존 나 stamoid에서 멀리 방향의 오른쪽에 새로운 스테로이드를 생산합니다.
최종 결과는 두 개의 장루가 하나의 세포로 분리되는 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 발아 공동 리드인의 장기 시간 경과를 사용하여 발달 중 표피의 유전자 발현 및 단백질 국소화를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 연구는 공초점 이미징을 위해 챔버 슬라이드와 아가르 배지를 사용하여 식물 싹잎을 고정시키는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 통해 세포 분열 동안 스토마의 분화와 형광 표지 단백질의 동적 추적이 가능합니다.
Long-term, high-resolution confocal time-lapse imaging of plant epidermal development enables mechanistic de-risking of target validation in plant-based biopharma discovery. By capturing dynamic protein localization and cell fate decisions over several days, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing. This approach addresses the need for longitudinal, quantitative data in systems where cellular events unfold slowly, improving translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing dynamic, quantitative readouts of cellular behavior in a disease-relevant system.