사용하여 DNA의 손상 세키의 연구 Xenopus 달걀 압축을 풉니 다

Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 xip 난자 추출물을 모델 시스템으로 사용하여 DNA 손상 체크포인트를 조사하는 것입니다. 먼저 xip 알에서 저속 추출물을 준비합니다. 그런 다음 MMS 및 자외선과 같은 DNA 손상 접근 방식으로 손상된 정자 염색질을 준비합니다.

또한 구조를 모방하는 DNA 손상을 준비합니다. A T 70은 손상된 정자 염색질 또는 T 70으로 LSE에서 DNA 손상 체크포인트를 트리거합니다. 궁극적으로, 블롯의 결과는 xenopus 난자 추출물의 TR check one 매개 DNA 손상 체크포인트에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

저기 안녕하세요. UNC 샬럿 생물학과의 CH Y입니다. 오늘 우리는 고름 추출물이 손상 기술 포인트 신호를 조사하기 위한 모델 시스템으로 사용되는 방법을 보여 드리겠습니다.

이 방법은 D 손상 체크포인트가 활성화되는 방법과 같은 동적 불안정 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 opus egg 추출물 및 DNA 손상 체크포인트 유도 시약의 준비와 DNA 손상 체크포인트 및 xap 분석을 위한 것입니다. 이러한 기술은 4개의 NQO 및 에토포시드를 포함한 다양한 DNA 손상 접근 방식에 적용할 수 있습니다.

DNA 손상 체크포인트에 대해 자세히 알아보기 위해 시작하겠습니다. 개구리의 암컷 xap을 피하로 프라이밍하려면 등쪽 림프낭에 PMG 100단위를 주입합니다. 프라이밍 유도 알을 낳은 후 최소 이틀을 기다린 후, 프라이밍된 각 개구리에 500단위의 인간 융모성 성선 자극 호르몬을 등쪽 절뚝 색소폰에 피하 주입하고, 주입된 개구리를 2리터의 Marx modified ringer solution이 들어 있는 별도의 버킷에서 14-20시간 동안 배양합니다.

양동이에서 개구리를 제거하고 약 100밀리리터가 남을 때까지 MMR 용액을 붓습니다. 그런 다음 양동이에서 계란을 250 밀리리터 비커 de 젤리 100 밀리리터의 2 % 시스테인 pH 7.8을 약 30 초마다 추가합니다. 직경 0.7cm의 거꾸로 된 유리 목초지 피펫으로 계란을 부드럽게 휘젓고 디캔팅하고 신선한 시스테인으로 두 번 교체합니다.

세부 사항 프로세스는 약 5분에서 15분 안에 완료됩니다. 계란이 비이커 바닥에 더 응축 된 층을 형성하면 시스테인 용액을 버린 후 0.25 XMMR 용액으로 계란을 3 번 씻습니다. 유리 피펫으로 달걀을 휘젓고 비커 중앙에 쌓이는 경향이 있는 푹신한 흰색 나쁜 달걀이 있는지 검사합니다.

목초지 피펫으로 나쁜 계란을 제거하십시오. 다음으로 난자 용해 완충액으로 난자를 세 번 씻습니다. 더 이상 나쁜 계란을 제거한 다음 계란을 14ml 매 튜브에 붓습니다.

188회씩 55초 동안 원심분리로 난자를 압축합니다.G. 스윙 버킷 로터가 있는 임상 탁상용 원심분리기를 사용하여 난자 층 위의 여분의 복어를 제거합니다. 이제 압축된 난자 1밀리리터당 10밀리그램 0.5마이크로리터의 아프로티닌, 렙틴 또는 AL과 사이토카인 B 또는 사이토 B의 밀리리터당 5밀리그램 0.5마이크로리터를 첨가하여 16, 500배 G에서 섭씨 4도에서 15분 동안 난자를 원심분리합니다. HB 6 스윙 버킷 로터와 함께 Sarva RC six plus super speed centrifuge를 사용하여 원심분리 ex 튜브 지질 추출물과 난황 안료의 3 층으로 각각 분별 한 후 위에서 아래로 각각 21 게이지 바늘로 중간 추출물 층의 하부에있는 팔콘 튜브 측면에 구멍을 뚫습니다.

구멍을 뚫는 바늘이 플라스틱으로 막힐 수 있으므로 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 1ml 주사기에 부착된 새 21게이지 바늘을 천자 부위에 삽입합니다. 추출물을 수집합니다.

추출물을 천천히 흡인하여 기포와 지질 및 노른자 색소 층으로 인한 오염을 피하십시오. 추출물을 냉각된 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 계란 추출물 1 밀리리터당 10 밀리리터 씩 10 마이크로 리터를 첨가하십시오.

시클로헥시미드 1마이크로리터 밀리리터당 10밀리그램. 프로닌 렙틴, 1 밀리리터 당 5 밀리그램 1 마이크로 리터 사이토 카인 B 1 몰 DTT 1 마이크로 리터 및 0.33 밀리리터 밀리리터 10 밀리리터. 올레는 난자 추출물을 최소 10회 이상 부드럽게 뒤집어 혼합하지만, 저속 추출물은 LSE의 품질이 저하되므로 4시간 이내에 사용해야 합니다.

4시간 또는 자유 해동 후 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드를 마이크로리터당 2마이크로그램의 물 농도에 용해시킵니다. 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 각 올리고 100마이크로리터를 넣고 섭씨 95도의 열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 앳 올리고 혼합물이 들어있는 튜브로 건식 수조 블록을 제거하고 섭씨 영하 20도에서 보관하기 위해 실온 부분 10 마이크로 리터 분취액으로 냉각하도록 설정하십시오.

AL 샘플은 이제 마이크로리터당 2마이크로그램의 최종 농도에서 A T 70 듀플렉스입니다. 튜더(Tudor)와 월터(Walter)가 설명한 대로 정상적인 정자 염색질을 0.5ml의 염색질로 준비합니다. 5.5마이크로리터의 9.1몰 MMS를 추가합니다.

스윙 버킷 로터 및 튜브 어댑터가 있는 IE CCL 2개의 임상 원심분리기를 사용하여 샘플 튜브를 실온의 회전기에 30분 동안 놓습니다. 실온에서 10분 동안 686회 G로 샘플을 회전시킵니다. 상등액을 버리고 B-S-A-D-T-A 프로인과 렙틴을 함유한 0.5ml의 완충액 X로 펠릿을 세척합니다.

이 과정을 세 번 반복하고 펠릿을 0.5밀리리터로 재현탁합니다. 버퍼 x. 혈류 세포 분석기로 정자 염색질의 농도를 측정합니다.

그런 다음 샘플을 마이크로리터당 100, 000개의 정자로 희석하고 섭씨 영하 80도에서 5마이크로리터 분취액을 저장합니다. param 조각의 표면에 원하는 양의 정상 정자 염색질을 추가하고 샘플을 UV crosslinker에 넣습니다. 원하는 에너지 매개변수를 설정하고 자외선을 통해 정자 염색질을 손상시키기 시작합니다.

UV 처리된 정자 염색질을 즉시 사용하여 제조된 저속 추출물에서 DNA 손상 체크포인트를 유도합니다. 50마이크로리터의 LSE, 1마이크로리터의 에너지 혼합물 및 2마이크로리터의 손상된 정자 염색질을 결합합니다. B 실온에서 90분 동안 반응을 배양하고 최소 30분 후에 10분마다 튜브를 튕겨야 합니다.

배양, 1마이크로리터의 반응 혼합물을 현미경 슬라이드에 분배하고 1마이크로리터의 핵 주사위 용액을 추가합니다. 커버 슬립을 놓고 형광 현미경을 통해 핵 형성을 확인합니다. 일반적으로 배양 30분 후에 둥근 핵이 형성되며 이는 DNA 복제가 시작되었음을 나타냅니다.

또한, 반응 혼합물 10 microlit를 anti check one 항체를 이용한 immuno blotting으로 평가한다. 50마이크로리터의 LSE, 1마이크로리터의 에너지 혼합물 및 1.6마이크로리터의 토토 마이신 스톡을 마이크로 원심분리기 튜브에 결합합니다. 그런 다음 마이크로리터당 2마이크로그램의 1.25마이크로리터, T 70 DNA 듀플렉스 또는 음성 대조군을 위한 물을 추가합니다.

실온에서 90분 동안 반응을 배양하고 10분마다 반응 튜브를 튕깁니다. 이제 10마이크로리터의 반응 혼합물을 90마이크로리터의 샘플 버퍼에 추가하여 하나의 단백질의 서양 혈액 분석을 수행합니다. 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 모방 구조는 대조군 MMS와 비교하여 xop 난자 추출물 시스템에서 TR 검사 단일 매개 DNA 손상 체크포인트를 효과적으로 트리거합니다.

TR 키나아제 활성화의 지표인 Syrian 3 44에서 하나의 인산화를 확인합니다. 유사하게, DNA 손상 모방 구조로서의 T 70도 체크 원 인산화를 유발합니다. 일단 마스터하면 LSE 준비는 약 1시간 안에 완료할 수 있습니다.

약 4시간이 지나면 추출물의 품질이 떨어지기 때문에 속도와 효율성이 필수적입니다. 이러한 방법은 중요한 질문 및 DNA 손상 체크포인트 신호에 답하기 위해 다른 접근 방식과 결합할 수 있습니다. 예를 들어, DNA 손상 체크포인트에서 표적 단백질이 필요한지 테스트하기 위해 면역 고갈을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 고름 추출물을 모델 시스템으로 사용하여 D 손상 체크포인트를 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.