사용하여 DNA의 손상 세키의 연구

본 절차의 전반적인 목표는 xip 난자 추출물을 모델 시스템으로 사용하여 DNA 손상 체크포인트를 조사하는 것입니다. 먼저, xip 난자에서 저속 추출물을 준비하십시오. 그다음, MMS 및 UV 광선과 같은 DNA 손상 유도 방법을 통해 손상된 정자 염색질을 준비하십시오.

또한 DNA 손상을 모방한 구조를 준비하십시오. 손상된 정자 염색질 또는 aT70을 사용하여 LSE에서 DNA 손상 체크포인트를 유발하도록 aT70을 진행합니다. 최종적으로, 블롯 결과는 제노푸스(xenopus) 난자 추출물 내의 aTR check one 매개 DNA 손상 체크포인트에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

안녕하세요. UNC 샬럿 생물학과(department biology)의 CH Y입니다. 오늘은 pus 추출물이 DNA 손상 체크포인트 신호 전달(damage tech point signaling)을 조사하기 위한 모델 시스템으로 어떻게 사용되는지 보여드리겠습니다.

이 방법은 DNA 손상 체크포인트가 어떻게 활성화되는지와 같이 동적 불안정성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜은 Xenopus 난자 추출물과 DNA 손상 체크포인트 유도 시약의 준비, 그리고 DNA 손상 체크포인트 및 Xap의 분석을 위한 것입니다. 이러한 기술은 4-NQO 및 etoposide를 포함한 다양한 DNA 손상 유발 방식에 적용 가능합니다.

DNA 손상 체크포인트를 연구하기 위해 실험을 시작하겠습니다. 암컷 Xenopus laevis 개구리를 피하 프라이밍하기 위해, 등쪽 림프낭에 PMSG 100 units를 주입하십시오. 프라이밍 후 최소 이틀을 기다린 다음, 프라이밍된 각 개구리의 등쪽 림프낭에 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) 500 units를 피하 주입하여 산란을 유도하십시오. 주입 후 개구리들을 2L의 Marx modified ringer solution이 담긴 개별 버킷에서 14~20시간 동안 배양하십시오.

버킷에서 개구리를 꺼내고 MMR 용액을 약 100 milliliters가 남을 때까지 따라냅니다. 그런 다음 버킷의 알을 250 milliliter 비커로 옮기고, 약 30초마다 2% cysteine pH 7.8 용액 100 milliliters를 첨가하여 알의 젤리층을 제거합니다. 직경 0.7 centimeters의 역방향 유리 파스퇴르 피펫으로 알을 부드럽게 저어준 뒤, 용액을 따라내고 새로운 cysteine 용액으로 두 번 교체합니다.

탈단백 과정은 약 5분에서 15분 후에 완료됩니다. 알들이 비커 바닥에 더 조밀한 층을 형성하면 시스테인 용액을 버린 후, 0.25 XMMR 용액으로 알을 세 번 세척하십시오. 유리 피펫으로 알을 가볍게 섞어주며, 비커 중앙에 모이는 경향이 있는 부풀어 오른 흰색의 불량 알이 있는지 확인하십시오.

파스퇴르 피펫을 사용하여 상태가 좋지 않은 알을 제거합니다. 다음으로, 알 용해 버퍼를 이용하여 알을 3회 세척합니다. 추가로 상태가 좋지 않은 알이 있는지 확인하여 제거한 후, 알을 14 mL 팔콘 튜브에 붓습니다.

188 ×g에서 55초 동안 원심분리하여 난자를 응집시킵니다. 스윙 버킷 로터가 장착된 임상용 테이블탑 원심분리기를 사용하여 난자 층 위의 과잉 버퍼를 제거합니다. 이제 응집된 난자 1 mL당 10 mg/mL aprotinin, leptin 또는 AL 0.5 µL와 5 mg/mL 사이토카인 B(cytokine B) 또는 cyto B 0.5 µL를 첨가합니다. Sarva RC 6 plus 초고속 원심분리기와 HB 6 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 °C에서 16,500 ×g로 15분 동안 난자를 원심분리합니다. 원심분리 후 난자는 튜브 내에서 지질 추출물과 난황 색소 등이 위에서 아래로 각각 세 개의 층으로 분획됩니다. 21게이지 바늘을 사용하여 팔콘 튜브의 중간 추출층 하단부 측면을 뚫습니다.

천자 바늘이 플라스틱에 의해 막혔을 수 있으므로 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 추출물을 수집하기 위해 1mL 주사기에 장착된 새로운 21 gauge 바늘을 천자 부위에 삽입하십시오.

기포가 생기지 않도록 주의하며, 지질 및 난황 색소층에 의해 오염되지 않도록 추출물을 천천히 흡입하십시오. 추출물을 냉각된 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 난란 추출물 1 milliliter당 10 milligrams per milliliter 용액 10 microliters를 첨가하십시오.

Cycloheximide 10 mg/mL 용액 1 µL, pronin leptin 5 mg/mL 용액 1 µL, cytokine B 1 M DTT 1 µL 및 10 mg/mL 용액 0.33 µL를 첨가합니다. 난자 추출물을 최소 10회 이상 부드럽게 반전 혼합합니다. LSE의 품질이 저하될 수 있으므로, 저속 추출물은 4시간 이내에 사용해야 합니다.

4시간 후 또는 완전히 해동된 후, 두 종류의 합성 올리고뉴클레오타이드를 2 µg/µL 농도의 물에 용해합니다. 각 올리고뉴클레오타이드 100 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 95 °C 가열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 올리고뉴클레오타이드 혼합물이 담긴 튜브를 드라이 배스 블록에서 꺼내 실온에서 냉각시킨 후, 10 µL씩 분주하여 -20 °C에서 보관합니다.

AL 샘플은 이제 최종 농도가 2 $\mu$g/$\mu$L인 A T 70 듀플렉스 상태입니다. Tudor와 Walter가 설명한 방식에 따라 0.5 mL의 염색질에 대해 정상 정자 염색질을 준비하십시오. 9.1 M MMS 5.5 $\mu$L를 첨가하십시오.

IE CCL two 임상 원심분리기의 스윙 버킷 로터와 튜브 어댑터를 사용하여, 샘플 튜브를 상온의 로테이터에 30분 동안 둡니다. 샘플을 상온에서 686 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 B-S-A-D-T-T-A proin 및 leptin이 포함된 0.5 mL의 버퍼 X로 펠렛을 세척합니다.

이 과정을 세 번 반복하고 펠릿을 0.5 milliliters Buffer x에 재부유합니다. 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 정자 염색질의 농도를 측정합니다.

그 후 샘플을 µL당 100,000개의 정자가 되도록 희석하고 5 µL씩 분주하여 -80 °C에서 보관합니다. 파라필름 조각 표면에 원하는 양의 정상 정자 염색질을 추가하고 샘플을 UV 가교 장치(UV crosslinker)에 넣습니다. 원하는 에너지 파라미터를 설정하고 UV 광선을 통해 정자 염색질에 손상을 줍니다.

준비된 저속 추출물(low speed extract)에서 DNA 손상 체크포인트를 유도하기 위해, UV 처리된 정자 염색질을 즉시 사용하십시오. 50 µL의 LSE, 1 µL의 에너지 혼합물 및 2 µL의 손상된 정자 염색질을 혼합합니다. 반응물을 실온에서 90분 동안 배양하며, 최소 30분이 지난 후부터는 10분마다 튜브를 가볍게 튕겨 섞어주십시오.

배양 후, 1 µL의 반응 혼합물을 현미경 슬라이드 위에 분주하고 1 µL의 nuclear dice 용액을 첨가합니다. 커버 슬립을 덮고 형광 현미경을 통해 핵 형성 여부를 확인합니다. 일반적으로 배양 30분 후에 둥근 핵이 형성되며, 이는 DNA 복제가 시작되었음을 나타냅니다.

또한, anti check one 항체를 이용한 면역 블로팅으로 반응 혼합물 10 µL를 평가하십시오. 마이크로 원심분리 튜브에 LSE 50 µL, 에너지 혼합물 1 µL 및 toto mycin 스톡 1.6 µL를 혼합하십시오. 그런 다음 2 µg/µL 농도의 T 70 DNA 이중나선 1.25 µL 또는 음성 대조군을 위한 물 1.25 µL를 첨가하십시오.

반응물을 상온에서 90분 동안 배양하고, 10분마다 반응 튜브를 가볍게 쳐주십시오. 이제, check one 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 위해 반응 혼합물 10 µL를 90 µL의 샘플 버퍼에 첨가합니다. 대조군인 MMS 유도 조건과 비교했을 때, 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 모사 구조는 xop 난자 추출 시스템에서 a TR check one 매개 DNA 손상 체크포인트를 효과적으로 활성화합니다.

TR kinase 활성화의 지표인 Syrian 3 44의 check one 인산화를 확인하십시오. 이와 유사하게, DNA 손상을 모방하는 구조인 T 70 또한 check one 인산화를 유도합니다. LSE 준비 과정에 숙달되면 약 1시간 내에 완료할 수 있습니다.

추출물의 품질이 약 4시간 후에 저하되므로, 신속함과 효율성이 필수적입니다. 이러한 방법들은 다른 접근 방식과 결합하여 DNA 손상 체크포인트 신호 전달에 관한 중요한 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 예를 들어, 표적 단백질이 DNA 손상 체크포인트에 필요한지 테스트하기 위해 면역 결핍법(immuno depletion)을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 pus 추출물을 모델 시스템으로 사용하여 D 손상 체크포인트를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.