Name: 사용하여 DNA의 손상 세키의 연구 Xenopus 달걀 압축을 풉니 다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 Xenopus 달걀 추출물을 이용한 DNA 손상 체크포인트 연구 방법입니다. MMS 및 UV 처리로 손상된 정자 염색질을 준비하고 면역블롯팅으로 체크포인트 활성화를 분석하여 유전체 안정성 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 샬롯 노스 캐롤라이나 대학 교수 우수성 Wachovia 기초 기금, 그리고 NIGMS (R15GM101571)에서 교부금에 의해 제공 자금에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. LSE 준비 <ol><li> 여성 개구리 (Xenopus laevis)는 계란 수집을 위해 두 번 주입하고 있습니다. 첫 번째 주입 (프라이밍)는 개구리 당 100 U PMSG (임산부 마레 세럼 생식샘 자극 호르몬)입니다. 유도 난자 놓고 중이오 개구리가 2 주에 사용할되기 전에 개구리는 최소한 이틀 중이오해야합니다. 주요 개구리에게, 3 ML의 주사기 27 G 바늘을 사용하여 등쪽 림프 주머니에 피하 주사 PMSG. </li><li> 누워있는 달걀을 유도하기 위해 27 G 바늘을 사용하여 등쪽 림프 주머니에 피하 중이오 개구리 당 500 U hCG (인간 Chorionic Gonadotrophin)을 주입. 1X 마크의 수정 벨소리의 솔루션 (MMR) 2 리터를 포함하는 별도의 물통에 주입 개구리를 품다. 수집하기 전에 알을 낳기 위해 개구리에게 14-20 시간을 허용합니다. </li><li> 버킷에서 개구리를 제거하고 약 100 ML가 왼쪽 때까지 MMR 솔루션을 부어. 250 ML의 비커에 달걀을 전송하여 양동이에서 알을 얻습니다. </li><li> 2 % 시스테인의 100 ML (조정을 추가하여 Dejelly 달걀10 M 코와 7.8에 PH). 역 유리 파스퇴르 pipet (직경 0.7 cm) 약 매 30 초와 부드럽게 소용돌이 계란을. 가만히 따르다과 부화하는 동안 두 번 신선한 시스테인로 교체하십시오. 달걀 비커의 맨 아래에있는 더 압축 된 층을 형성 할 때 dejellying 과정은 5-15 분 정도에 완료됩니다. </li><li> 시스테인 솔루션을 무시하고 0.25x MMR과 계란을 세 번 씻는다. 유리 pipet하여 솔루션의 소용돌이 계란합니다. &quot;나쁜&quot;달걀은 간단한 육안 검사에 의해 결정 및 외관의 &quot;띵띵 한&quot;하얀 있습니다. &quot;나쁜&quot;달걀은 회전 후 비커의 중심에 축적됩니다. 파스퇴르 pipet으로 &quot;나쁜&quot;계란을 제거합니다. </li><li> 달걀 용해 버퍼 (ELB) 세 번에 알을 씻으십시오. 파스퇴르 pipet하여 추가 &quot;나쁜&quot;계란을 제거합니다. 14 ML 팔콘 튜브에 달걀을 넣어. </li><li> 달걀을 압축 스윙 버킷 로터로 CL2 IEC 임상 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 188 XG (1,100 RPM)에서 55 초 동안 매 관을 봐. 에서 초과 버퍼를 제거계란 층의 꼭대기. Aprotinin / 류 펩틴 주식의 0.5 μl와 콤팩트 달걀 ML 당 Cytochalasin B 주식의 0.5 μl를 추가합니다. </li><li> 4에 15 분에 16,500 XG (10,000 RPM)에 달걀을 원심 분리기 ° C HB6 스윙 버킷 로터로 Sorvall RC6 플러스 빠른 속도의 원심 분리기를 사용합니다. 원심 분리 한 후, 계란은 관 3 층에 fractionated입니다 각각 지질, 추출 및 난황 / 위로부터 아래로 안료,. 21 G 바늘로 중간 추출물 층의 낮은 부분에 구멍 팔콘 튜브의 측면을. 펑 쳐링 바늘은 플라스틱에 의해 가려 수 있으므로 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 추출물을 수집 할 수있는 주사 사이트에 1 ML의 주사기에 부착 된 새로운 21 G 바늘을 삽입합니다. 천천히 지방질과 난황 / 안료 레이어 기포 및 오염을 방지하기 위해 주사기로 추출물을 대기음. </li><li> 차가운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 추출물를 놓습니다. 계란 추출물의 각 밀리리터를 들어,에서 다음 화학 주식 솔루션을 추가dicated 최종 농도 (괄호에 표시) : (1) 10 μl Cycloheximide (100 μg / ML), (2) 1 μl Aprotinin / 류 펩틴 (10 μg / ML 각), (3) 1 μl Cytochalasin B (5 μg / ML ), (4) 1 μl Dithiothreitol (1 MM) 및 (5) 0.33 μl Nocodazole (3 μg / ML). 계란이 부드럽게 적어도 10 배의 압축을 풉니 반전. 이 신선한 만들어 4 시간 이내에 사용하셔야합니다 LSE입니다. LSE의 품질은 4 시간이나 동결 - 해동 후 손상됩니다. </li></ol> 2. DNA 손상 접근법과 정자 염색질의 치료 <ol><li> 이전 13 설명한 방법에 따라 정상적인 정자 염색질을 준비합니다. </li><li> MMS - 처리 정자 염색질을 준비 <ol><li> 0.5 ML 버퍼 X.에서 정상적인 정자 염색질을 Resuspend </li><li> 100 mm의 최종 농도에 염색질을 resuspended 500 μl에 MMS의 ~ 5.5 μl (재고 9.1 M)을 추가합니다. </li><li> 회전 30 분 동안 실온에서 microcentrifuge 관 정자 염색질을 품다. </li><li> m을 돌려스윙 버킷 회 전자와 튜브 어댑터와 IEC CL2 임상 원심 분리기를 사용하여 실온에서 10 분에 686 XG (2,100 RPM)에서 icrocentrifuge 관. </li><li> 표면에 뜨는 취소하고 버퍼 X 플러스 BSA (3 %), DTT (0.1 ㎜) 및 Aprotinin / 류 펩틴 (10 μg / ML 각)의 0.5 ML에서 펠렛을 resuspend. </li><li> 단계 (4) 반복 (5) 두 번 정자 염색질을 씻어합니다. </li><li> hemocytometer로 정자 염색질의 농도를 결정하고 100,000 정자 / μl로 희석. 자세한 사용을위한 -80 ° C의 냉동고에 5 μl aliquots를 저장합니다. </li></ol></li><li> UV-처리 정자 염색질을 준비 <ol><li> Parafilm의 한 부분의 표면에 정상적인 정자 염색질의 원하는 금액을 (예 : 10 μl)를 추가합니다. </li><li> UV crosslinker로 Parafilm를 놓습니다. 실험에 따라 원하는 에너지 매개 변수를, 설정하고 UV 빛을 통해 정자 염색질을 손상하기 시작한다. 예를 들어, 1000 J / m 2에 도달하기 약 21 초 정도 소요됩니다. </li><li> UV irra 후diation, UV-처리 정자 염색질은 즉시 계란 추출물에 추가해야합니다. </li></ol></li></ol> 3. DNA 손상 -​​ 모방 구조의 준비 (AT70) <ol><li> 이 합성 oligonucleotides를 해산 폴리 - (다) 각각 70 (A70으로 지정) 및 폴리 (DT) 70 (T70로 지정) 2 μg / μl의 농도로 물에. </li><li> 한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 A70의 100 μl와 T70 100 μl를 추가합니다. heatblock에서 95시 5 분 ° C에 혼합 합성 oligo 솔루션을 끓일. </li><li> 건조 목욕 블록 아웃을 (거기에 혼합 AT가 포함 된 튜브 사용) 해,하고 실험실 벤치에 실내 온도로 식혀 보자. 이 온도 조정은 45-60 분 주위에 걸립니다. </li><li> 냉각 혼합물은 2 μg / μl의 최종 농도에 AT70입니다. 자세한 사용을위한 -20 ° C의 냉동고에 AT70 aliquots의 스토어 10 μl. </li></ol> 4. 손상된 정자 염색질 또는 DNA의 손상과 LSE에서 DNA의 손상 세키가 실행- 모방 구조 <ol><li> 손상된 정자 염색질과 LSE에 DNA 손상 검사 점을 유도 <ol><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 LSE의 50 μl를 추가하고 에너지 혼합물의 1 μl 및 손상된 정자 염색질 (최종 농도 ~ 4,000 정자 / μl 반응) 2 μl로 보완합니다. </li><li> 90 분 동안 실온에서 반응 관을 배양하고 관마다 10 분 버려야지. </li><li> 30 분 부화 후 핵 염색 솔루션의 1 μl를 보충 현미경 슬라이드에 반응 혼합물의 1 μl을 투여. 반응 혼합물을 통해 커버 슬립을 놓고 형광 현미경을 통해 핵 형성을 확인합니다. 일반적으로 둥근 핵은 DNA 복제가 시작했습니다 나타내는 부화 후 30 분 이후에 형성됩니다. </li><li> 샘플 버퍼의 90 μl로 반응 혼합물 10 μl보십시오. 샘플을 방지 Chk1 P-S344 또는 안티 Chk1 항체를 사용하여 immunoblotting을 통해 분석하고 있습니다. </li></ol></li><li> 와 LSE에 DNA 손상 검사 점을 유도AT70 <ol><li> 에너지 혼합물의 1 μl와 Tautomycin 주식의 1.6 μl를 보충 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 LSE의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 각 반응에 미리 만든 AT70 (2 μg / μl) 또는 물 (대조군) 중 1.25 μl를 추가합니다. 90 분 동안 실온에서 반응을 품다. 반응 관마다 10 분 영화. </li><li> 샘플 버퍼의 90 μl로 반응 혼합물 10 μl를 추가합니다. 샘플을 방지 Chk1 P-S344 또는 안티 Chk1 항체를 사용하여 immunoblotting을 통해 검토하고 있습니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 - 모방 구조는 Xenopus 계란 추출물 시스템에서 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다. MMS는의 지표 Ser344에서 Chk1 인산화 (Chk1 P-S344)를 유도하는 그림 2A 쇼는 ATR의 키나제의 활성화. 그림 2B는 AT70, DNA 등의 손상 - 모방 stru 보여줍니다cture도 Chk1 인산화를 트리거합니다. 총 Chk1 샘플은 두 예에서 컨트롤을로드로 사용됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> 1 그림. DNA 손상 검사 점 신호의 다이어그램. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> 그림 2. Chk1 인산화는 MMS 또는 Xenopus 달걀 추출물의 AT70 치료에 의해 ​​유도된다. (A) MMS-손상된 정자 염색질 (MMS) 또는 일반 정자 염색질 (절약)가 90 분에 계란 추출물에 incubated 수 있습니다. Chk1 Ser344의 인산화 (Chk1 P-S344)과 계란 추출물의 총 Chk1는 immunoblotting을 통해 조사하고 있습니다. (B) AT70 또는 물 (절약) 각각, 달걀 추출물에 추가됩니다. 샘플도 (A)에서와 같이 immunoblotting을 통해 분석하고 있습니다.

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR%3A+an+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li>
<li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li>
<li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li>
<li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li>
<li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li>
<li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li>
<li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li>
<li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claspin%2C+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li>
<li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li>
<li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891(2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Xenopus 계란 추출물을 사용하여 DNA 손상 검사 점을 연구의 몇 가지 장점이 있습니다. 계란 추출물의 사용은 세포주기의 계면에서 동기화 셀 - 무료 추출물 대량를 제공합니다. 계란 추출물 쉽게 저렴한 비용으로 만들 수 있습니다. 이 DNA 나 염색질을 손상하고 계란 추출물에서 대상 단백질을 immunodepleting 후 DNA 손상 검사 점의 결함을 나타 내기 위해 상대적으로 쉽습니다. 그 후, 잠재적 인 기능 결함은 야생 유형 또는 돌연변이 재조합 단백질의 addback하여 &quot;구조&quot;가 될 수 있습니다. 따라서, Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점의 구조와 기능 분석을위한 강력한 모델 시스템입니다. LSE 준비는 이전에 14 시연,하지만 우리 프로토콜은 일부 수정이되었습니다. hCG 주사 (18 ° C) 한 후 개구리 잠복기의 온도는 누워있는 계란 매우 중요합니다. 개구리를 처리하고 ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 안티 Chk1 P-S344 항체 </td><td> 셀 시그널링 </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> 안티 Chk1 항체 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> 시그마 </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> 시그마 </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-시스테인 </td><td> 시그마 </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> 류 펩틴 </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> 메틸 methanesulfonate (MMS) </td><td> 시그마 </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> 시그마 </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 버퍼 </td><td> 시그마 </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> 와코 화학 USA </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 누워있는 계란에 대한 버킷 </td><td> Rubbermaid 상용 제품 </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> 스윙 버킷 회와 CL2 IEC의 원심 분리기 </td><td> 열 과학 </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 스윙 버킷 회 </td><td> 열 과학 </td><td> 11,860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 플러스 빠른 속도의 원심 분리기 </td><td> 열 과학 </td><td> 46,910 </td><td></td></tr><tr><td> UV crosslinker </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 </td></tr><tr><td> 1X MMR </td><td></td><td></td><td> 100 MM NaCl, 2 MM KCl, 0.5 MM MgSO 4, 2.5 MM CaCl 2, 5 MM HEPES는 10 M NaOH를 7.8로 pH를 조정 </td></tr><tr><td> Aprotinin / 류 펩틴 재고 </td><td></td><td></td><td> 10 MG / ML 각 물 인치 -80 ° C.에 20 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> 버퍼 X </td><td></td><td></td><td> 0.2 M의 자당, 80 MM KCl, 15 MM NaCl, 5 MM MgCl 2, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM의 HEPES는 HCL에서 7.5으로 pH를 조정 </td></tr><tr><td> Cycloheximide 재고 </td><td></td><td></td><td> 1물에 0 MG / ML. -20 ° C.에 저장 한 ML의 aliquots </td></tr><tr><td> Cytochalasin B 주식 </td><td></td><td></td><td> DMSO 5 MG / ML. -20 ° C.에 20 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) 주식 </td><td></td><td></td><td> 물에 1 M. -20 ° C.에 저장 한 ML의 aliquots </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25 M의 자당, 1 MM DTT, 50 μg / ML cycloheximide, 2.5 MM MgCl 2, 50 MM KCl, 10 MM의 HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole 주식 </td><td></td><td></td><td> DMSO 10 MG / ML. -80 ° C.에서 5 μl aliquots를 저장 </td></tr><tr><td> 에너지 혼합 </td><td></td><td></td><td> 375 밀리미터 크레아틴 인산, 50 MM ATP, 25 MM MgCl 2. Aliquots는 -80 ° C.에 저장됩니다 </td></tr><tr><td> 핵 염색 솔루션 </td><td></td><td></td><td> 0.4 μg / ML Hoechst 33258, 25 % 글리세롤(V / V)에 1X PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin 재고 </td><td></td><td></td><td> DMSO 100 μM. -80 ° C.에서 10 μl aliquots를 저장 </td></tr></tbody></table>

사용하여 dna의 손상 세키의 연구<em&gt; xenopus</em&gt; 달걀 압축을 풉니 다

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

매일, 세포 내생과 환경 모욕 다양한를 받게됩니다. 이러한 모욕을 방지하기 위해, 세포가 DNA 손상에 DNA 손상 및 직접 세포 반응을 감지 할 수있는 감시 장치로 신호 DNA 손상 검사 점을 발전시켜 왔습니다. DNA 손상 검사 점 신호 (그림 1)에 참여 센서, 트랜스 듀서 및 effectors라는 단백질의 여러 그룹이 있습니다. 이 복잡​​한 신호 경로에서 ATR (ATM 및 Rad3 관련)은 DNA 손상 및 복제 스트레스에 응답 할 수있는 주요 kinases 중 하나입니다. 활성화 ATR은 Chk1 아니라 그 하류 기판 (세키 키나제 1) phosphorylate 할 수 있습니다. 따라서, phosphorylated 및 세포주기 체포, 전사 활성화, DNA 손상 수리 및 apoptosis 또는 노화 (그림 1)을 포함하여 DNA 손상 검사 점의 여러 다운 스트림 효과 Chk1 리드를 활성화. DNA가 손상되면 unrep에서 DNA 손상 검사 점 결과를 활성화하기 위해 실패방송 손상과, 이후, 게놈 불안정성. DNA 손상 검사 점의 연구는 세포 게놈 무결성을 유지하는 방법 명료하게하다와 같은 암 등 인간의 질병이 개발 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. Xenopus laevis 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점의 연구에 강력한 셀 - 무료 추출 모델 시스템으로 등장하고 있습니다. 저속 추출물 (LSE)가 처음 Masui 그룹 1에 의해 설명되었다. DNA 한 번 세포주기 당 semiconservative 방식으로 복제 핵 형성에 LSE 결과 demembranated 정자 염색질의 추가. ATR/Chk1-mediated 검사 점 신호 경로는 DNA가 손상되거나 복제 스트레스를 2로 실행됩니다. DNA 손상 접근 방식과 DNA 손상 - 모방 구조 3 : 두 가지 방법은 현재 DNA 손상 검사 점을 유발하는 데 사용됩니다. DNA 손상은 자외선 (UV) 조사, γ-방사선, 메틸 나게 의해 유도 될 수esulfonate (MMS), 미토 마이신 C (MMC), 4 nitroquinoline-1-산화물 (4 NQO) 또는 aphidicolin 3, 4. MMS는 DNA 복제를 억제하고 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점은 4-7 활성화 alkylating 요원입니다. UV 조사는 또한 ATR/Chk1-dependent DNA 손상 검사 점 8 트리거합니다. DNA 손상 -​​ 모방 구조 AT70 두 oligonucleotides 폴리 (DA) 70 폴리 (DT) 70 annealed 복잡합니다. AT70 시스템은 빌 Dunphy의 연구실에서 개발 된 널리 9-12 ATR/Chk1 검사 점 (Checkpoint) 신호를 유도하는 데 사용됩니다. 여기, 우리는 (2) DNA 손상 - 모방 구조를 준비하기 위해 두 개의 서로 다른 DNA 손상 방식 (MMS와 UV), (3) Xenopus의 정자 염색질을 치료하는 세포 무료 달걀 추출물 (LSE)를 준비하는 프로토콜은 (1) 설명 AT70, 그리고 (4) 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 -​​ 모방 구조 LSE에 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다.

Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.

사용하여 DNA의 손상 세키의 연구<em&gt; Xenopus</em&gt; 달걀 압축을 풉니 다

세포는 매일 다양한 내인성 및 환경적 손상에 노출됩니다. 이러한 손상에 대응하기 위해 세포는 DNA 손상...

본 절차의 전반적인 목표는 xip 난자 추출물을 모델 시스템으로 사용하여 DNA 손상 체크포인트를 조사하는 것입니다. 먼저, xip 난자에서 저속 추출물을 준비하십시오. 그다음, MMS 및 UV 광선과 같은 DNA 손상 유도 방법을 통해 손상된 정자 염색질을 준비하십시오.또한 DNA 손상을 모방한 구조를 준비하십시오. 손상된 정자 염색질 또는 aT70을 사용하여 LSE에서 DNA 손상 체크포인트를 유발하도록 aT70을 진행합니다. 최종적으로, 블롯 결과는 제노푸스(xenopus) 난자 추출물 내의 aTR check one 매개 DNA 손상 체크포인트에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.안녕하세요. UNC 샬럿 생물학과(department biology)의 CH Y입니다. 오늘은 pus 추출물이 DNA 손상 체크포인트 신호 전달(damage tech point signaling)을 조사하기 위한 모델 시스템으로 어떻게 사용되는지 보여드리겠습니다.이 방법은 DNA 손상 체크포인트가 어떻게 활성화되는지와 같이 동적 불안정성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜은 Xenopus 난자 추출물과 DNA 손상 체크포인트 유도 시약의 준비, 그리고 DNA 손상 체크포인트 및 Xap의 분석을 위한 것입니다. 이러한 기술은 4-NQO 및 etoposide를 포함한 다양한 DNA 손상 유발 방식에 적용 가능합니다.DNA 손상 체크포인트를 연구하기 위해 실험을 시작하겠습니다. 암컷 Xenopus laevis 개구리를 피하 프라이밍하기 위해, 등쪽 림프낭에 PMSG 100 units를 주입하십시오. 프라이밍 후 최소 이틀을 기다린 다음, 프라이밍된 각 개구리의 등쪽 림프낭에 인간 융모성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin) 500 units를 피하 주입하여 산란을 유도하십시오. 주입 후 개구리들을 2L의 Marx modified ringer solution이 담긴 개별 버킷에서 14~20시간 동안 배양하십시오.버킷에서 개구리를 꺼내고 MMR 용액을 약 100 milliliters가 남을 때까지 따라냅니다. 그런 다음 버킷의 알을 250 milliliter 비커로 옮기고, 약 30초마다 2% cysteine pH 7.8 용액 100 milliliters를 첨가하여 알의 젤리층을 제거합니다. 직경 0.7 centimeters의 역방향 유리 파스퇴르 피펫으로 알을 부드럽게 저어준 뒤, 용액을 따라내고 새로운 cysteine 용액으로 두 번 교체합니다.탈단백 과정은 약 5분에서 15분 후에 완료됩니다. 알들이 비커 바닥에 더 조밀한 층을 형성하면 시스테인 용액을 버린 후, 0.25 XMMR 용액으로 알을 세 번 세척하십시오. 유리 피펫으로 알을 가볍게 섞어주며, 비커 중앙에 모이는 경향이 있는 부풀어 오른 흰색의 불량 알이 있는지 확인하십시오.파스퇴르 피펫을 사용하여 상태가 좋지 않은 알을 제거합니다. 다음으로, 알 용해 버퍼를 이용하여 알을 3회 세척합니다. 추가로 상태가 좋지 않은 알이 있는지 확인하여 제거한 후, 알을 14 mL 팔콘 튜브에 붓습니다.188 ×g에서 55초 동안 원심분리하여 난자를 응집시킵니다. 스윙 버킷 로터가 장착된 임상용 테이블탑 원심분리기를 사용하여 난자 층 위의 과잉 버퍼를 제거합니다. 이제 응집된 난자 1 mL당 10 mg/mL aprotinin, leptin 또는 AL 0.5 µL와 5 mg/mL 사이토카인 B(cytokine B) 또는 cyto B 0.5 µL를 첨가합니다. Sarva RC 6 plus 초고속 원심분리기와 HB 6 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 °C에서 16,500 ×g로 15분 동안 난자를 원심분리합니다. 원심분리 후 난자는 튜브 내에서 지질 추출물과 난황 색소 등이 위에서 아래로 각각 세 개의 층으로 분획됩니다. 21게이지 바늘을 사용하여 팔콘 튜브의 중간 추출층 하단부 측면을 뚫습니다.천자 바늘이 플라스틱에 의해 막혔을 수 있으므로 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 추출물을 수집하기 위해 1mL 주사기에 장착된 새로운 21 gauge 바늘을 천자 부위에 삽입하십시오.기포가 생기지 않도록 주의하며, 지질 및 난황 색소층에 의해 오염되지 않도록 추출물을 천천히 흡입하십시오. 추출물을 냉각된 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 난란 추출물 1 milliliter당 10 milligrams per milliliter 용액 10 microliters를 첨가하십시오.Cycloheximide 10 mg/mL 용액 1 µL, pronin leptin 5 mg/mL 용액 1 µL, cytokine B 1 M DTT 1 µL 및 10 mg/mL 용액 0.33 µL를 첨가합니다. 난자 추출물을 최소 10회 이상 부드럽게 반전 혼합합니다. LSE의 품질이 저하될 수 있으므로, 저속 추출물은 4시간 이내에 사용해야 합니다.4시간 후 또는 완전히 해동된 후, 두 종류의 합성 올리고뉴클레오타이드를 2 µg/µL 농도의 물에 용해합니다. 각 올리고뉴클레오타이드 100 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 95 °C 가열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 올리고뉴클레오타이드 혼합물이 담긴 튜브를 드라이 배스 블록에서 꺼내 실온에서 냉각시킨 후, 10 µL씩 분주하여 -20 °C에서 보관합니다.AL 샘플은 이제 최종 농도가 2 $\mu$g/$\mu$L인 A T 70 듀플렉스 상태입니다. Tudor와 Walter가 설명한 방식에 따라 0.5 mL의 염색질에 대해 정상 정자 염색질을 준비하십시오. 9.1 M MMS 5.5 $\mu$L를 첨가하십시오.IE CCL two 임상 원심분리기의 스윙 버킷 로터와 튜브 어댑터를 사용하여, 샘플 튜브를 상온의 로테이터에 30분 동안 둡니다. 샘플을 상온에서 686 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 B-S-A-D-T-T-A proin 및 leptin이 포함된 0.5 mL의 버퍼 X로 펠렛을 세척합니다.이 과정을 세 번 반복하고 펠릿을 0.5 milliliters Buffer x에 재부유합니다. 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 정자 염색질의 농도를 측정합니다.그 후 샘플을 µL당 100,000개의 정자가 되도록 희석하고 5 µL씩 분주하여 -80 °C에서 보관합니다. 파라필름 조각 표면에 원하는 양의 정상 정자 염색질을 추가하고 샘플을 UV 가교 장치(UV crosslinker)에 넣습니다. 원하는 에너지 파라미터를 설정하고 UV 광선을 통해 정자 염색질에 손상을 줍니다.준비된 저속 추출물(low speed extract)에서 DNA 손상 체크포인트를 유도하기 위해, UV 처리된 정자 염색질을 즉시 사용하십시오. 50 µL의 LSE, 1 µL의 에너지 혼합물 및 2 µL의 손상된 정자 염색질을 혼합합니다. 반응물을 실온에서 90분 동안 배양하며, 최소 30분이 지난 후부터는 10분마다 튜브를 가볍게 튕겨 섞어주십시오.배양 후, 1 µL의 반응 혼합물을 현미경 슬라이드 위에 분주하고 1 µL의 nuclear dice 용액을 첨가합니다. 커버 슬립을 덮고 형광 현미경을 통해 핵 형성 여부를 확인합니다. 일반적으로 배양 30분 후에 둥근 핵이 형성되며, 이는 DNA 복제가 시작되었음을 나타냅니다.또한, anti check one 항체를 이용한 면역 블로팅으로 반응 혼합물 10 µL를 평가하십시오. 마이크로 원심분리 튜브에 LSE 50 µL, 에너지 혼합물 1 µL 및 toto mycin 스톡 1.6 µL를 혼합하십시오. 그런 다음 2 µg/µL 농도의 T 70 DNA 이중나선 1.25 µL 또는 음성 대조군을 위한 물 1.25 µL를 첨가하십시오.반응물을 상온에서 90분 동안 배양하고, 10분마다 반응 튜브를 가볍게 쳐주십시오. 이제, check one 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 위해 반응 혼합물 10 µL를 90 µL의 샘플 버퍼에 첨가합니다. 대조군인 MMS 유도 조건과 비교했을 때, 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 모사 구조는 xop 난자 추출 시스템에서 a TR check one 매개 DNA 손상 체크포인트를 효과적으로 활성화합니다.TR kinase 활성화의 지표인 Syrian 3 44의 check one 인산화를 확인하십시오. 이와 유사하게, DNA 손상을 모방하는 구조인 T 70 또한 check one 인산화를 유도합니다. LSE 준비 과정에 숙달되면 약 1시간 내에 완료할 수 있습니다.추출물의 품질이 약 4시간 후에 저하되므로, 신속함과 효율성이 필수적입니다. 이러한 방법들은 다른 접근 방식과 결합하여 DNA 손상 체크포인트 신호 전달에 관한 중요한 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 예를 들어, 표적 단백질이 DNA 손상 체크포인트에 필요한지 테스트하기 위해 면역 결핍법(immuno depletion)을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후, 여러분은 pus 추출물을 모델 시스템으로 사용하여 D 손상 체크포인트를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에서 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

study-of-the-dna-damage-checkpoint-using-xenopus-egg-extracts

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어...

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

방법은 Xenopus의 계란 추출물 및 단백질 분해의 저분자 변조기에 대한 고 처리량 스크리닝을 위해 그 적응 방사성 표지와 루시퍼 라제 융합 단백질을 이용하여 단백질 분해 분석에 대해 설명한다.

β-catenin의 저하의 재구성<em&gt; Xenopus의</em&gt; 계란 추출

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

고도로 압축된 유사분열 염색질의 축합의 분자 메커니즘은 잘못 정의되어 있습니다. 당사는 HeLa 세포와 Xenopus laevis 난자 추출물에서 분리한 유사분열 염색질 클러스터를 기반으로 in vitro에서 응축 과정을 충실하게 재구성하는 cell-free 분석을 제시합니다.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

우리는 Xenopus laevis 알에서 희석되지 않은 세포질 추출물의 제조 및 라이브 이미징 방법을 설명합니다.

제노푸스 라에비스 동적 세포질 조직을 시각화하기 위한 계란 추출물 준비 및 라이브 이미징 방법

이 프로토콜의 목적은 Drosophila 난소에서 세포 극체 구조의 국소화 및 역학에 산화 손상의 효력을 시각화하기 위하여 살아있는 화상 진찰을 사용하는 것입니다.

라이브 이미징을 사용하여 Drosophila 계란 챔버에 산화 손상의 효과 시각화

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

난모세포 게놈 무결성을 유지하는 것은 결과 배아에서 유전적 충실도를 보장하는 데 필요합니다. 여기에서 우리는 포유류 암컷 생식 세포에서 DNA 이중 가닥 절단을 검출하기 위한 정확한 프로토콜을 제시합니다.

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

학습하세요 Xenopus 달걀 추출물을 이용한 DNA 손상 체크포인트 연구 방법입니다. MMS 및 UV 처리로 손상된 정자 염색질을 준비하고 면역블롯팅으로 체크포인트 활성화를 분석하여 유전체 안정성 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

사용하여 DNA의 손상 세키의 연구

더 많은 동영상 탐색