Hippocampal 인슐린 Microinjection 및 생체에 Microdialysis

본 절차의 전반적인 목적은 행동 테스트 중 해마의 대사를 측정하는 것입니다. 이는 숙련된 동물의 뇌에 미세투석 가이드 캐뉼라를 외과적으로 삽입하여 준비함으로써 달성됩니다. 테스트 당일, 미세투석 프로브를 캐뉼라에 삽입하고 PERFUSE 여덟 방향의 흐름을 확인합니다.

다음으로, 동물이 제어 챔버 내에 머무는 동안 프로브가 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 최종적으로, 예를 들어 포도당 산화효소, NADP, N-A-D-P-H 반응 및 형광 분석과 같은 적절한 분석 방법을 사용합니다. 포도당 측정은 테스트 기간 동안의 대사 수준 또는 신경 화학 물질의 방출 정도를 나타내는 데 사용됩니다. 이 기술에서 가장 까다로운 점 중 하나는 미세투석 튜브 취급 시 주의가 필요하다는 것이며, 주의를 기울이지 않으면 동물이 튜브를 씹거나 라인이 엉키는 경우가 자주 발생합니다.

제가 대학원 과정 중에 행동 테스트 중 해마 미세투석법을 처음 사용했을 때는, 기존의 포도당 공급 모델이 포도당에 의한 기억력 향상과 관련된 알려진 심리학적 데이터와 실제로 일치하는지 확인하고자 했습니다. 이 방법론을 통해 우리는 사실 뇌에 적용된 기존의 포도당 모델들이 완전히 틀렸다는 것을 보여줄 수 있었습니다.

표준 수술 절차에 따라 동물을 준비하고, 두개골을 노출시킨 후 캐뉼라 삽입을 위한 구멍을 뚫습니다. 미리 정해진 좌표에 캐뉼라를 삽입한 다음, 표적 깊이까지 천천히 내립니다. 정확한 위치에 배치되면 치과용 시멘트로 캐뉼라를 고정합니다.

필요한 경우 멸균 외과용 봉합사를 사용하여 상처 부위를 봉합합니다. 마지막으로, 캐뉼라의 개통성을 유지하기 위해 스타일을 사용합니다. 다음으로, 미세투석에 사용할 PERFUSE 8을 준비합니다.

최적의 결과를 얻기 위해서는 정확한 유체 조성이 필수적이라는 점에 유의해야 합니다. 테스트 당일에 bovine serum albumin BSA를 첨가하여 완전히 용해시켜야 합니다. 준비가 완료되면, PERFUSE eight를 0.2 micron 필터로 여과해야 합니다.

다음으로, 준비된 A ECF의 분주액을 사용하여 뇌에 투여할 처리제(있는 경우)를 준비합니다. 여기서는 해마로 전달될 인슐린을 준비합니다. 신선한 미세투석 프로브와 라인은 테스트 전날에 준비해야 합니다.

유입구와 유출구를 위해 두 개의 별도 라인을 만듭니다. PE 50 튜빙을 사용하여 1m 길이의 FEP 튜빙 두 개를 연결하고, 라인 사이의 데드 스페이스가 최소화되도록 합니다. PE 50 커넥터에 쉽게 삽입할 수 있도록 튜빙의 끝부분을 그림과 같이 사선으로 절단합니다.

멸균 여과된 탈이온수로 채워진 1 mL Hamilton 주사기에 유입 튜브를 연결하고, 측정 중에 동물이 자유롭게 움직일 수 있도록 반대쪽 끝에 프로브를 부착합니다. 유입 및 유출 라인을 2채널 스위벨에 연결합니다. 다음으로, 유출 튜브를 펌프에 연결하고 프로브의 유출 튜브에서 탈이온수가 나오는 것이 보일 때까지 1.5 µL/min의 속도로 펌프를 작동시킵니다.

펌프 전원을 끄고 유출 튜브와 시료 수집 튜브 사이에 다른 라인을 연결합니다. 튜브를 통해 5 mL를 흘려보낸 후, 프로브 팁이 항상 젖어 있도록 주의하며 멸균 탈이온수가 담긴 바이알에 프로브를 넣어 하룻밤 동안 둡니다. 테스트 24시간 전에 더미 스타일렛을 제거하고 이 목적 전용으로 사용되는 미세투석 프로브를 삽입하여 피험자를 사전 처리합니다.

그 후 10분 동안 더미 스타일을 교체하고 쥐를 케이지로 돌려보냅니다. 또는, 이 단계에서 새 프로브를 사용하고 측정 시까지 제거하지 않은 채 그대로 둡니다. 다음 날.

마이크로투석 당일에 필터링된 A ECF로 Hamilton 시린지와 신틸레이션 바이알을 채우고, 펌프가 한 시간 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 필요한 경우, 준비된 처리액으로 두 번째 Hamilton 시린지를 채워 시린지 펌프에 장착하십시오. 이 절차의 성공 핵심은 침착함을 유지하고 동물을 매우 세심하게 다루는 것입니다.

따라서 침착함을 유지하고, 천천히 그리고 정확하게 움직이며, 무엇보다 충분히 연습하십시오. 평형화가 완료되면 더미 스타일렛을 제거하고, 평형화된 미세투석 프로브를 캐뉼라를 통해 쥐의 뇌에 부드럽게 삽입하십시오. 쥐를 쥐가 평소 사용하던 바닥재가 들어 있는 투명 플라스틱 상자에 넣으십시오.

튜빙의 균형을 반드시 맞추십시오. 중력으로 인해 미세투석 라인이 꼬이지 않으면서도 너무 팽팽해지지 않도록, 물을 채운 1.6 milliliter 마이크로 원심분리 튜브를 케이지 외부의 튜빙에 부착하십시오. 프로브와 쥐가 2시간 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다.

이 단계의 시작 시점에 Perfuse eight의 흐름이 막히지 않았는지 확인하십시오. 이를 위해, 일정 기간 동안 PERFUSE eight의 유출액을 수집하고 샘플의 무게를 측정하여, 샘플을 수집하기 전에 예상되는 부피가 시스템 밖으로 배출되고 있는지 확인하십시오. 샘플 투석과 수집 사이의 상관관계가 정확하게 계산되었는지 확인하십시오.

여기서는 프로브와 수집 지점 사이의 부피가 30 µL이며, 유속은 1.5 µL/min입니다. 시료가 뇌에서 나와 수집될 때까지 20분의 지연 시간이 발생합니다. 평형 도달 기간 이후, 쥐가 홈 챔버 내에서 휴식하는 동안 최소 3개의 시료를 수집하십시오.

행동 테스트 전에 측정값의 안정적인 기저선을 설정하려면, 뇌에 투여될 약물의 전달 타이밍을 세심하게 계획하십시오. 따라서 주사기 팁과 동물의 뇌로 들어가는 프로브 사이에 30 µL의 부피가 있는 이 설정에서는, 약물이 해마에 도달하기 20분 전에 약물 주사기를 profuse eight 처리 용액으로 교체합니다.

유입 라인을 대조군 perfuse eight 시린지에서 분리하여 처리군 perfuse eight 시린지에 신속하게 연결하십시오. PERFUSE eight 흐름이 중단되지 않도록 이 작업은 5초 이내에 완료해야 합니다. 적절한 시간대에 효율성을 떨어뜨릴 수 있는 공기 방울이 유입되지 않도록 주의하십시오.

처치 완료 후, 쥐를 선택한 행동 테스트 장치로 조심스럽게 이동시킵니다. 본 실험에서는 전완 플러스 모양 미로(forearm plus shaped maze)를 사용하여 자발적 교대 행동을 측정합니다. 동물이 20분 동안 미로를 자유롭게 탐색하도록 합니다.

비디오 녹화를 이용하거나 수동으로 arm Aries의 순서와 타이밍을 기록하여 샘플을 수집하십시오. 이 기간 동안 유출 튜브를 새로운 수집 튜브로 옮기십시오. 5분마다 튜브가 자유롭게 움직일 수 있도록 유지하십시오.

쥐의 움직임을 방해하거나 동물 앞에서 움직여 주의를 분산시켜서는 안 되며, 사용자의 움직임이 쥐의 행동에 영향을 주지 않도록 정지 상태를 유지해야 합니다. 테스트가 끝나면 쥐를 미로에서 조심스럽게 꺼내어 제어 챔버로 복귀시킵니다. 과제 수행 후의 회복 기간을 포함할 수 있도록 최소 4개 이상의 샘플에 대해 마이크로다이얼리시스 샘플 수집을 계속합니다.

원하는 샘플을 수집한 후, 프로브를 동물의 머리에서 조심스럽게 제거하여 보관 바이알에 넣습니다. 동물을 원래의 케이지로 돌려보내고, 실험 후 건강 상태나 행동에 변화가 있는지 면밀히 관찰하십시오. 마지막으로, 미생물 증식을 방지하기 위해 catho 용액이 들어 있는 시린지로 교체하여 튜빙을 세척합니다.

이 예시는 과제 수행과 관련된 해마 ECF 포도당의 감소를 보여줍니다. 회색 상자는 동물이 미로에서 보낸 시간을 나타냅니다. 보라색 선은 미로 테스트를 거치지 않은 동물의 해마 포도당 수치를 나타내며, 빨간색 선은 전완 자발적 교대 과제를 수행하는 동물을 나타냅니다.

주황색 선은 이 과제의 더 쉬운 버전인 3-암(three arm) 버전을 수행하는 동물들의 측정값을 나타냅니다. 여기서 인슐린 투여 후 해마의 포도당 및 젖산 수치 변화를 확인할 수 있습니다. 이러한 변화는 행동 테스트 없이 관찰되었으며, 따라서 기저 상태에서 인슐린 단독 투여의 영향을 반영합니다.

이 절차를 수행할 때는 침착함을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 쥐는 실험자의 스트레스를 감지하여 불안해질 수 있으며, 이는 절차를 훨씬 더 어렵게 만들 뿐만 아니라 결과에 혼란을 줄 가능성이 있습니다. 이러한 기법들의 조합을 통해 행동 과정에 대한 정확한 신경화학적 조사가 가능해졌습니다.

유사한 기술들이 현재 인간 환자들에게도 사용되고 있습니다. 예를 들어, 발작 초점을 국소화하기 위해 전극을 이식한 뇌전증 환자에게 대사 측정을 가능하게 하는 미세투석 캐뉼라를 함께 이식할 수 있습니다.