뇌 조직의 만성 Optogenetic의 자극을위한 광섬유 주입

다음 실험의 목적은 깨어 있고 행동하는 쥐에서 장기간 신경 회로를 활성화하고 연구하는 것입니다. 이 방법은 원래 Sparta etal에서 설명한 개념에서 채택되었습니다. 이것은 먼저 광학 회전 조인트를 광섬유 임플란트에 연결하는 광섬유 커플 코드를 조립함으로써 달성됩니다.

다음으로, 광섬유는 관심 있는 뇌 조직 위에 이식되어 빛이 뉴런을 발현하는 채널로 직접 이동할 수 있는 통로를 만듭니다. 마지막으로, 광원은 광학 회전 관절에 연결되어 광원에서 뇌 조직까지 직렬로 연결된 경로를 만듭니다. 궁극적으로, 채널 redsin 발현 뉴런의 광 유도 발사는 생체 내, 전기 생리학 및 행동 연구를 기반으로 평가할 수 있습니다.

가이드 캐뉼러와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 광섬유의 반복적인 삽입 및 제거로 인한 뇌 조직의 손상을 최소화한다는 것입니다. 이 방법은 신경 회로 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 특정 유형의 신경 장애의 기저에 있는 시냅스 및 회로 의존 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다.

이식 단계는 마스터하기 어렵기 때문에 사소해 보이는 각 단계는 방법의 전반적인 안정성과 신뢰성에 크게 기여합니다. 먼저 100미크론 코어가 있는 125미크론 직경의 광섬유 35mm를 절단하여 쐐기 팁 카바이드 스크라이브를 광섬유에 수직으로 배치하고 단일 단방향 동작으로 광섬유를 채점한 다음 똑바로 당겨 빼냅니다. 이제 직경 127 미크론의 볼록한 면이 바이스로 향하는 볼록한 면이 있는 lc 세라믹 야성을 삽입한 다음 광섬유 조각을 야성에 삽입합니다.

광섬유는 부드럽게 미끄러져 들어가야 하며 야생의 볼록한 끝 부분 너머로 약간 돌출되어야 합니다. 다음으로 갓 준비한 열경화 광섬유 에폭시 한 방울을 야생의 평평한 끝 부분에 바르고 에폭시에 히트 건을 바릅니다. 에폭시는 가열될 때 야생을 채워야 하고 검게 변할 때 경화되어야 합니다.

경화 후 야생의 측면에서 에폭시를 청소한 다음 lc 광섬유 연마 디스크를 사용하여 원형 회전 패턴을 만들어 4 가지 감소 등급의 연마 패드에서 산화 알루미늄 연마 시트의 볼록한 끝을 연마합니다. 그런 다음 평평한 끝의 광섬유를 관심 영역을 대상으로 하는 적절한 길이로 자릅니다. 광택 처리된 광섬유를 테스트하려면 임플란트의 광택 처리된 끝을 커플러의 슬리브에 삽입합니다.

반대편 야생동물과의 직접적인 접촉이 느껴질 때까지 불량 임플란트는 광섬유 팁 근처의 초점이 약한 반면, 좋은 임플란트는 출력 없이 부드러운 동심원 빛을 투과합니다. 최대 10밀리와트의 출력은 완성된 임플란트를 사용할 때까지 거품에 저장합니다. 이 단계를 시작하여 200미크론 코어가 있는 220미크론 직경의 광섬유를 측정한 다음 점수를 매겨 마우스가 자유롭게 움직일 수 있지만 마우스가 섬유를 씹을 수 없도록 합니다.

그런 다음 내경이 광섬유보다 약간 크고 길이가 약간 짧은 퍼레이션 튜빙 조각에 광섬유를 삽입합니다. 이제 광섬유의 한쪽 끝에서 약 25mm를 벗겨내고 다중 모드 FC MM 야생 어셈블리의 금속 끝에 삽입합니다. 직경이 230미크론인 보어가 멈출 때까지 광섬유는 야생 끝을 통해 튀어나와야 합니다.

다음으로, 금속 끝에서 시아노아크릴레이트로 연결을 고정하고 커넥터로 연결을 덮습니다. 방금 시연한 것처럼 FC 연마 디스크로 야생 끝을 연마합니다. 광섬유의 다른 쪽 끝을 벗겨낸 후 볼록한 끝 원위만 있는 lc 세라믹 야성체에 삽입합니다. 그런 다음 평평한 끝 부분에 에폭시 한 방울을 바르고 방금 설명한 대로 경화될 때까지 가열합니다.

방금 시연한 대로 야생의 볼록한 끝을 연마한 후 야생이 슬리브의 중간 지점에 도달할 때까지 lc 야생 슬리브를 야생의 볼록한 끝 부분 위로 밉니다. 그런 다음 ation 튜브와 슬리브 위에 열 수축 튜브를 놓고 열 수축 튜브를 가열하여 연결을 고정하고 보호합니다. 마지막으로, 야생을 레이저 소스에 연결한 다음 분광 광도계로 커플러를 통해 출력되는 광을 측정하여 테스트하고, 레이저 출력과 측정된 커플러 출력 사이의 광 손실은 수술을 시작하기 전에 30%를 초과해서는 안 됩니다.

isop 프로필 알코올과 클로르헥시딘 용액으로 수술 부위를 소독합니다. 다음으로, 마우스를 입체 리그에 놓고 두개골이 수평이 되도록 머리를 고정합니다. 건조함과 수술 후 통증을 예방하기 위해 동물의 눈에 안과 연고를 바르십시오.

이제 두피의 정중선을 절개하여 안와에서 람다 봉합사까지 두개골을 노출시킵니다. 세라핀 클램프를 사용하여 피부를 억제하고 두개골에 대한 접근을 유지하십시오. 그런 다음 치과 픽을 사용하여 두개골 표면 전체에 체크 무늬 패턴을 에칭합니다.

생성된 파편을 멸균 식염수로 씻어냅니다. 충분히 건조시킨 후 면봉을 사용하여 노출된 두개골에 약 2-3초 동안 3%의 과산화수소를 바르면 미세 기공이 생성됩니다. 그런 다음 더 멸균된 식염수로 두개골을 여러 번 씻고 철저히 말리십시오.

바둑판 패턴을 두개골에 에칭, 세척 및 건조시킨 후 다시 광섬유 야생 임플란트를 프로브 홀더에 삽입한 다음 입체 암에 연결합니다. bgma 및 lambda로 보정된 정위 아틀라스를 사용하여 버 홀 위치를 결정합니다. 그런 다음 회전식 치과 드릴을 사용하여 관심 영역보다 직경이 1mm 미만인 작은 구멍 개두술을 만들고 경막이 부러지거나 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.

입체성 팔을 사용하여 임플란트를 관심 영역 바로 위에 배치하고 야생은 주변 두개골 조직에 놓여야 합니다. 이제 멸균 이쑤시개를 사용하여 갓 준비한 치과 시멘트의 얇고 균일한 층을 두개골을 가로질러 임플란트의 아래쪽 부분에 적용합니다. 동물의 피부에 닿지 않도록 주의하면서 치과 시멘트의 기저층은 두개골의 표면적을 최대한 많이 덮어야 합니다.

이 절차의 가장 어려운 점은 치과 시멘트가 덩어리 피부에 닿지 않도록 적용하는 것입니다. 성공을 보장하려면 한 번에 소량의 시멘트를 얇은 층으로 바르고 각 층이 완전히 마를 때까지 기다렸다가 다음 층을 추가하십시오. 치과용 시멘트를 균일하게 바르고 두개골 위와 임플란트 주위에 작은 둔덕을 형성합니다.

방해받지 않는 부드러운 연결을 허용하기 위해 시멘트를 깨끗하게 청소하는 볼록한 끝의 3-5 밀리미터를 남겨 두십시오. 그런 다음 치과 시멘트 더미와 임플란트 주위에 두피를 봉합하면 봉합 후 추가 바인딩을 위해 수의사 접착 접착제를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 국소 진통제와 항생제를 봉합사 피부와 임플란트 바닥 주변에 바르고 수술 후 회복을 위해 마우스를 케이지에 넣습니다.

광섬유 임플란트와 커플러를 적절하게 조립하면 관심 영역에서 광원과 광섬유 끝 사이의 광자 손실이 최소화됩니다. 광택이 나는 광섬유는 이 이미지에서 볼 수 있듯이 신중한 이식 및 봉합을 통해 여기에 표시된 원과 유사한 균일한 동심원으로 빛을 투과해야 하지만, 임플란트는 마우스에 눈에 띄는 자극을 일으키지 않으며 광섬유의 심각한 저하 또는 투과되는 빛의 양 없이 장기 연구를 위해 제자리에 남아 있을 수 있습니다.깨어 있는 마우스의 기능적 행동 분석은 자극의 직접적인 반응을 보여줍니다. 이에 의해 입증된 바와 같이 운동 피질에 이식된 광섬유를 통해 생체 내 전기생리학 비디오 데이터는 임플란트를 통한 표적 뉴런의 활성화와 뇌 자극 중 동물의 행동 반응을 보여줍니다. 이 절차에 따라, 표적 세포와 관련된 회로 연결 패턴은 무엇입니까?

이 비디오를 시청한 후에는 광섬유 임플란트 및 커플러 코드를 조립하는 방법과 광유전학적 포터를 발현하는 뇌 조직에 이식하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.