세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

이 프로토콜은 유선의 상피 부분을 관련 유방 기질 세포가 없는 상태로 분리하는 것을 목표로 합니다. 효소 분해를 사용하여 상피 구조를 풍부하게 하기 위해 외과적 폐기 물질의 누적 절개부터 시작합니다. 기저막 외부의 기질 물질로부터 상피 오가노이드를 분리합니다.

그런 다음 고정된 공극 크기의 세포 스트레이너를 통해 분해된 오가노이드를 처리하여 농축된 분획을 얻습니다. 즉각적인 배양을 위해 오가노이드를 파종하거나 나중에 사용할 수 있도록 재고를 동결합니다. 궁극적으로, 상피 오가노이드는 정상적인 인간 유방 상피 세포의 장기 배양을 생성하는 데 사용됩니다.

저는 1970년대 후반에 인간 상피 세포 생물학 및 발암 분야를 발전시키기 위해 이 방법을 처음 개발했습니다. 정상적인 인간의 기억 조직에서 풍부한 외과적 폐기 물질을 사용할 수 있었습니다. 필요한 것은 이 벌크 이종 물질을 순수 상피 세포 배양 및 배지에 적합하게 처리하여 장기적인 성장을 지원하는 방법이었습니다.

이 방법의 시각적 시연은 특히 조잡한 해부를 수행하는 방법을 기록하는 데 도움이 됩니다. 적절하게 소화된 오가노이드는 어떤 모습인가요? 오가노이드를 여과하고 배양을 위해 오가노이드를 도금합니다.

이 기술의 장점은 기질에 대해 깨끗한 상피 분획을 제공하고 상피 세포가 손상되지 않은 상태로 유지된다는 것입니다. 우리가 발견한 오가노이드는 최상의 초기 성장을 제공하고 얻을 수 있는 세포의 수를 최대화합니다. 로렌스 버클리 국립 연구소 (Lawrence Berkeley National Laboratory)의 두 과학자 인 제임스 가비 (James Garvey)와 마크 르바지 (Mark LeBarge)는 이제 수술 절차의 버려진 재료에서이 절차를 시연 할 것입니다.

섭씨 4도에서 완충액 또는 완전한 배지와 항생제가 들어 있는 멸균 용기에서 인간 유방 조직을 채취합니다. 티슈 조각을 잘라 큰 유리 멸균 접시에 넣으십시오. 상피 영역을 지방 조직, 결합 조직 및 혈관의 기질 기질에서 분리합니다.

더 황갈색 기질 기질에 박혀 있는 상피 영역의 흰색 가닥을 부드럽게 해부합니다. 집게로 재료를 잡고 메스로 지방이 많은 재료를 긁어냅니다. 그런 다음 반대쪽 메스로 상피 조직을 약 4mm 조각으로 잘라 소화를 용이하게 합니다.

절개된 상피 조직을 섬유질이 많은 조직에서 50 또는 15ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 더 단단한 흰색 비 상피 물질이 있을 것입니다. 이러한 섬유질 매트릭스에서 상피 세포를 해부하기 어려운 경우.

조직은 1-3mm 정사각형 조각으로 절단하고 별도로 소화할 수 있습니다. 조잡한 콜라겐 분해 효소와 높은 alur days를 포함하는 소화 매체로 튜브를 채우고 회전 중에 혼합할 수 있도록 작은 공간을 남겨 둡니다. 분해 후 섭씨 37도의 360도 회전기에서 8RPM으로 하룻밤 동안 샘플을 배양합니다.

5분 동안 600G의 원심분리로 샘플을 펠렛화합니다. 상층액 지방과 배지는 인체 조직 폐기에 대한 제도적 지침에 따라 폐기합니다. 조직 소화를 모니터링하기 위해 펠릿의 작은 Eloqua를 배지로 희석하고 완전히 소화된 오가노이드에서 현미경으로 검사하면 부착된 기질이 나타납니다.

조직이 순수한 오가노이드로 완전히 소화될 때까지 효소 분해를 반복합니다. 하룻밤 사이에 두 번째 소화가 필요한 경우, 과도한 소화를 방지하기 위해 효소 농도를 줄여야 할 수도 있습니다. 적절하게 소화된 오가노이드는 부착된 기질이 없는 매끄럽게 보이는 관 폐포 또는 관 폐포 구조를 보여줍니다.

분해가 완료되면 resus는 최종 펠릿을 중간 위치에 있는 항생제에 현탁시킵니다. 분해된 샘플을 쿼트에 담아 멸균된 100미크론 여과기를 멸균된 50ml 튜브 위로 통과시킵니다. 배지가 튜브로 배출된 후 3ml의 배지로 오가노이드를 세척합니다.

재현탁된 펠릿이 모두 옮겨질 때까지 반복합니다. 그런 다음 필터를 멸균 튜브 위로 조심스럽게 뒤집고 더 많은 매체를 사용하여 오가노이드를 튜브로 세척합니다. 이것은 100미크론 오가노이드 풀입니다.

이제 원래의 50 밀리리터 튜브로 배출된 물질을 40 미크론 여과기에 통과시켜 단일 세포의 여과액 풀과 중간엽 및 상피 세포의 작은 덩어리 및 작은 혈관 조직 조각에서 폐포 구조를 분리합니다. 100 미크론, 40 미크론 및 여과액 풀을 600G에서 5분 동안 원심분리합니다. 1ml의 ccpm을 사용하여 각 샘플을 재구성합니다.

포장된 입천장 0.1ml당 2개의 동결 용액. 섭씨 4도를 유지하십시오. 두 개의 오가노이드 풀 각각을 0.1ml씩 조심스럽게 놓습니다.

하나 또는 2 개의 35mm 접시에 균일 한 방울 떨어뜨립니다. 오가노이드가 부착되도록 몇 분 후에 접시 표면을 긁지 마십시오. 오가노이드가 빠지지 않도록 성장 배지를 천천히 추가합니다.

그런 다음 1차 배양물을 섭씨 37도의 가습된 CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 또한 0.1ml의 여과액 풀을 섬유아세포 배지가 있는 조직 배양 플라스틱에 직접 파종합니다. 1차 배양물을 섭씨 37도의 가습 CO2 인큐베이터에서 배양합니다.

24-48시간 후 오가노이드에서 세포 이동을 확인하고 2-3일 후에 유사분열 성장 배양을 모니터링합니다. 세포는 거의 합류하여 2-3일마다 배지를 보충합니다. 혈관 구조의 작은 조각이 부착되어 섬유아세포 증식을 일으킬 수 있습니다.

섬유아세포가 크게 성장하는 경우. 큰 상피 패치에서 섬유아세포를 제거하기 위해 차등 트리핀화를 수행합니다. STE 완충액에서 세포를 한 번 세척합니다.

그런 다음 새로운 0.5ml STE를 추가하여 지속적인 현미경 관찰과 단단한 표면에 접시를 부드럽지만 날카롭게 두드려 접시를 덮습니다. 상피 세포가 아직 부착 통로를 유지하고 있는 동안 섬유아세포 박리를 찾습니다. 상피 외성장의 패치가 합류에 가까워 졌을 때의 기본 배양.

1차 배양을 유지하고 여러 2차 배양을 생성하려면 부분 트립신을 사용합니다. STE 버퍼에서 세포를 한 번 씻은 다음 새 STE를 추가하여 접시를 덮습니다. 셀의 약 50%가 분리되었는지 모니터링합니다.

그런 다음 성장 배지를 함유한 혈청 2ml를 추가하고 세포를 수확합니다. 그런 다음 두 번 세척한 후 세포를 멸균된 15ml 튜브로 옮깁니다. 수확된 세포를 모으고 배양: 부분화는 약 4회에서 8회 정도 반복할 수 있으며, 1차 접시에서 양호한 세포 재성장과 하대배양 또는 동결된 2차 배양에서 동등한 장기 성장

첫 번째 부분 트립신 삽입의 세포는 보관을 위해 동결하고 두 번째 PT의 세포를 계대배양에 사용하는 것이 좋습니다. 조직이 적절하게 소화되고 여과되면 오가노이드가 나타나고 유관 및 폐포 구조가 부착된 기질이 없는 매끄러운 가장자리로 볼 수 있습니다. 과소 소화되면 물질이 부착되고 더 많은 섬유아세포 오염이 발생하며, 과도하게 소화되면 가장자리가 거칠어지고 오가노이드 부착 후 부착 효율성이 떨어집니다.

상피 성장은 48시간에서 72시간 이내에 48시간에 시작됩니다. 72시간까지 가시적 유사분열을 동반한 활발한 세포 분열은 아직 없습니다. 유사분열(mitosis)이 더 눈에 띄게 되어야 합니다.

혈관 구조의 작은 조각은 4일 후에 중간엽 세포 증식의 원인이 될 수 있습니다. 상피 외성장은 형태학적으로 이질적인 개체군을 나타내며, 여기에서 케라틴 14 및 케라틴 19에 대한 항체로 염색하면 녹색 K 19 양성 내강 및 빨간색 K 14 양성 근상피 계통과 노란색 K 14 양성 K 19 양성 전구 세포를 표시합니다. HMEC는 다양한 배지 제형에서 배양할 수 있습니다.

콜레라 독소와 옥시토신이 보충된 M 87 a와 같은 저스트레스 매체는 정상적인 사전 정지 HMEC의 우수한 장기 성장과 여러 HMEC 계통의 성장을 지원합니다. 사실 분석 결과는 배양되지 않은 오가노이드와 네 번째 통로에서 M 87, A 배지에서 배양된 HMEC의 계통 다양성을 보여줍니다. 여기서, 내강 및 근상피 개체군은 내강 마커, EPCA 및 CD 2 27 및 근상피 마커 CD 49 F 및 CD 10 재플레이팅의 발현에 의해 식별됩니다.

네 번째 통로, HMEC. 이전의 내강 및 근상피 마커에 대해 풍부한 사실은 케라틴 K 14 및 K 19 HMEC에 대한 면역 형광 분석을 사용하여 계통을 확인했습니다. 플라스틱에서 배양하여 4 계대는 내강 세포와 근상피 세포의 계통 관계와 같은 생체 내에서 조직화 된 구조를 형성 할 수 있으며, 적절한 CD 2, 27 및 CD 10에 배치되면 이러한 두 계통을 농축하는 데 사용됩니다.

HMC는 근상피 세포 내부에 있는 루미날 세포가 있는 마이크로 패턴의 3D 마이크로 웰에서 적절한 3D 세포 조직을 형성하는 능력을 유지합니다. 사실이 풍부한 전구 세포는 또한 마트리겔에 도금될 때 관상 및 폐포 구조를 모방한 견고한 3D 구조를 형성할 수 있습니다. Matrigel의 3D 구조는 또한 적절한 3D 자기 조직화를 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 관련 유선 기질이 없는 유선의 상피 부분을 정화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 2-3일 동안 수행할 수 있습니다. 조직 처리 기술은 일반적으로 간단합니다.

올바른 지점에서 소화를 멈추는 것을 기억하는 것이 중요하다.