Name: 세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 학습하세요 인간 유방 상피 세포를 분리하여 오르가노이드를 배양하는 방법을. 효소 소화와 여과를 통해 상피 구조를 풍부하게 하여 장기 배양이 가능합니다. 이 기술은 정상 상피 세포 생물학 및 암 발생 연구에 활용됩니다.

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말, JCG, 그리고 부인은 NIA (R00AG033176 및 R01AG040081)와 연구실 감독 연구 및 개발, # DE-AC02-05CH11231 에너지 계약의 미국 부서에서 지원됩니다.

1. 조직 가공 소화 <ol><li> 수술 절차의 폐기 소재로 인간의 유방 조직을 얻습니다. 감소 mammoplasties는 정상 또는 양성 세포를 제공 할 수 있습니다, fibroadenomas과 gynecomastias는 양성 세포를 제공, 비 종양이 유방 절제술의 조직은 (주변 장치 또는 종양에 contralateral, 또는 피하) 일반의 포함 microtumors에 양성으로 다양 할 수 있습니다 세포를 제공합니다. 적절한 IRB 승인 전에 폐기 자료를 확보하기 위해 존재 확인하십시오. 모든 자료는 bloodborne 병원균 규정에 따라 처리해야합니다. </li><li> 버퍼 나 미디어를 포함하는 멸균 용기 (예 : 1시 1분 Dulbecco의 수정 된 이글의 매체와 햄의 F-12)에서 개최 재료는 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 5 μg / ML Fungizone, 50U/ml polymyxin B와 보충 4에 연구실로와 10 % 태아 소 혈청 및 전송 ° C. 감소 mammoplasty 조직이 크게 쓰에 영향을주지 않고 72 시간에 대해 4 ° C에 보관하거나 배송 될 수 있습니다bsequent 세포 생존 능력. 비 감소 mammoplasty 조직의 작은 조각 더 프롬프트 처리를 요구할 수 있습니다. </li><li> 멸균 메스, 집게와 가위의 조합을 사용하여 지방 조직, 결합 조직 및 혈관의 stromal 매트릭스에서 상피 영역을 분리합니다. 대형 유리 무균 접시에 가위와 장소가있는 조직의 조각 (예를 들어, 150mm)를 자른다. 부드럽게 필수적인 지방산 물질을 멀리 밀고 자료와 메스를 잡아 포셉을 사용하여 yellower stromal 매트릭스에 포함 된 흰색 가닥으로 표시 상피 영역을, 나가 해부. 소화를 촉진하기 위해 50 ML 테스트 튜브에 반대 메스와 장소를 사용하여 ~ 3-4밀리미터의 작은 조각으로 상피 조직을 잘라. 조직의 대량 처리되는 경우, 신선한 메스 블레이드가 필요 할 수 있습니다. 기관 규정에 따라 폐기 음식에서 지방산 물질을 제거합니다. <ol class="lalpha"><li> 크게 섬유 조직에서 (예를 들어, 피하 매스심한 fibrocystic 질환이있는 tectomies), 더 흰색, 비 상피 재료가있을 것입니다. 여기에는 섬유 매트릭스에서 상피 세포를 해부하기 어려울 수 있습니다. 섬유 소재의 대형 조각이 지역에 ~ 1-3mm 광장 있으며, 별도의 소화 작은 조각으로 절단 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 튜브의 양의 더 큰 것보다 세째을 포함하는 조직을 원추형 원심 분리기 튜브 (50 ML 또는 15 ML)로 해부하는 상피 조직을 배치합니다. 조직 소화 혼합물을 (DME/F-12 또는 동급, 10 μg / ML 인슐린, 위 등의 항생제, 10의 최종 농도 사용하여 회전하는 동안 혼합 할 수 있도록하기 위해 단지 작은 공기 공간을두고 전체 볼륨에 관을 올려 % FCS, 200 U / ML 원유의 collagenase 및 100 U / ML hyaluronidase. </li><li> 장소 HulaMixer 관 회선 근에 튜브 37에서 밤 8 rpm으로 360 °를 회전 ° C. </li><li> 5 분 600 XG에 튜브를 원심 분리기. 폐기 조약 표면에 뜨는 지방과 중간을 삭제 하시겠습니까기관 규정에 들죠. </li><li> 중간에있는 펠릿의 작은 나누어지는을 diluting하여 소화 완료를 확인합니다. 소화는 현미경 검사가 첨부 된 기질 (그림 1A)에서 무료로 부드러운 게재, ductal 폐포, 또는 ductal - 폐포 구조와 세포의 clumps을 (organoids)이 표시되면 완료된 것입니다. 감소 mammoplasty의 조직은 일반적으로 여전히 밤새 소화 한 후 첨부 된 기질을 보여줍니다 및 추가 소화 시간이 필요합니다. <ol class="lalpha"><li> 또 다른 4-12 시간에 37 ° C에서 회전 신선한 조직 소화 혼합하고 다시 배양에서 불완전하게 소화 펠렛을 Resuspend. 단계 1.6 1.7를 반복합니다. 소화가 여전히 불완전한 경우, 다시 37 ° C 하룻밤에 회전 펠렛을 다시 부화 소화 혼합물을 추가합니다. 효소의 농도는 하루 아침에 오버 소화을 방지하기 위해 감소 될 수있다. </li></ol></li><li> 소화가 완료되면 5 분에 600 XG에 튜브를 원심 분리기, 다이제스트를 대기음약 15 ml/50 ML 튜브, 5 ml/15 ML 튜브의 중간 플러스 항생제의 이온 혼합, resuspend 펠렛. </li></ol> 2. 여과 및 소화 물질의 동결 <ol><li> 멸균 50 ML 튜브를 통해 멸균 100 μm의 스트레이너에 resuspended 펠릿의 aliquots을 전송합니다. 관에있는 매체 배수하자 다음 매체로부터 2-3 ML로 가기 1 - 배 시간에 organoids을 rewash. resuspended 펠렛의 모든 전송 될 때까지 반복합니다. 너무 많은 필터에 organoids 및 매체가 더 이상 쉽게 배수되지가있는 경우, 나머지 재료 새 필터 (들)을 사용합니다. 조심스럽게 또 다른 멸균 튜브의 상단에있는 필터 (들)을 회전시키면서 더 많은 매체 튜브에 organoids을 씻는다. 이 100 μm의 organoid 풀 수 있습니다. </li><li> 원래 50 ML 튜브로 배수 자료를 가지고 대부분 폐포 구조를 포함 40 μm의 organoid 풀을 얻기 위해, 40 μm의 스트레이너를 사용하여 2.1 프로세스를 반복합니다. 일에 배수 재료전자 튜브 중간 엽과 상피 세포와 vasculature의 작은 조각 / 단일 작은 clumps를 포함하는 여과 풀을 구성합니다. </li><li> 5 분 600 XG의 펠렛은 100 μm, 40 μm, 그리고 여과 풀. </li><li> 표면에 뜨는, reconstitute에게 포장 펠릿 0.1 ML 당 CPMII의 약 1 ML을 사용하여 CPM II (DME/F-12 또는 44% FCS와 6% DMSO와 이에 상응하는 금액)의 각 튜브를 대기음. 4 ° C.에 보관 </li><li> 아래 3.2에서와 같이 드롭하여 35mm 조직 문화 플라스틱 접시 드롭에 resuspended 소재의 0.1 ML를 삽입 시드 2 organoid 수영장위한 테스트 요리를. 여과 풀 직접 섬유 아세포 매체 (10 μg / ML의 인슐린와 10 % FBS와 DME/F-12 또는 동급)를 조직 배양 플라스틱에 놓는 할 수 있습니다. </li><li> Nunc 형 동결 ampoules (1 ML / 2 ML의 앰풀)로 나누어지는이 남아있는 resuspended 자료. -80 ° C에서 밤새 고정 후 액체 질소에 저장 장치에 즉시 전송할 수 있습니다. 우리는 생존의 상당한 손실을 관찰하지 않은오리지널 ampoules에 저장된는 후반 1970 년대부터 고정. </li></ol> 3. 냉동 Organoids과 차 문화의 하위 문화을 퍼 뜨리고 <ol><li> 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 organoids을 포함하는 냉동 앰풀을 해동. 앰풀의 organoids의 수의 시각적 평가에 따라 2-10 (보통 ~ 6) 60mm 요리, 또는 1-3 100mm 요리에 씨 organoids합니다. 60mm 요리 당 놓는 약 20-40 organoids는 최적입니다. </li><li> 해동 organoids는 신중하게 배치되어 organoids의도 배포 1 ML 피펫 또는 파스퇴르 피펫으로 요리 표면에 드롭하여 놓습니다. Organoids 가까운 곳에는 하위 문화 또는 동결에 대한 이하의 셀에 상승을 제공, 가지에 대한 공간이 제한됩니다 놓았다. (세포가 지난 긁힌 표면을 성장하지 않는 경향) 요리 표면을 긁는하지 마십시오. organoids 첨부 한 후 천천히 organoids (예를 들면 2-3 ml/60 mm 요리) dislodging 방지하기 위해 성장 매체를 추가 할 수 있습니다 1-2 분 기다립니다. 나는37 번 ° C humidified CO 2 인큐베이터에서 ncubate. 다음은 주요 문화입니다. 현재 가장 강력한 HMEC 성장 (그림 2)에 대한 M87A + 옥시토신 (X) 매체를 사용합니다. </li><li> 1 일 이내에, organoids가 연결되어 있는지 확인하십시오. 추가 매체 (예 : 2-3 ml/60 mm 요리)를 추가합니다. organoids에서 셀 마이그레이션 심는 후 48-72 시간 (그림 1B, C)으로 24-48 시간, 그리고 mitotic의 가지로 볼 수 있습니다. 때때로 첨부 파일은 특히 나이 많은 여자에서 overdigested organoids 또는 organoids을 도금하는 경우, 24 시간 후에는 가난하지만, 대부분의 준비는 72 시간 내에 첨부합니다. vasculature의 작은 조각은 첨부 섬유 아세포 세포 가지 (그림 1D)에 상승을 줄 수 있습니다. </li><li> 문화에게 최소 3 회 일주일에 먹이. M87A 형 미디어에서 재배 세포가 시딩의 밀도에 따라, 5-8 일 이내에 근처 합류로 성장합니다. </li><li> 에 따라 큰 섬유 아세포 성장, 차동 Trypsinization (DT)는,이있는 경우표면 플라스틱에서 섬유 아세포의 급속한 이탈은 섬유 아세포를 제거하는 필요합니다. 상피 패치 STE (생리, 0.05 % 트립신, 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 기음 대형, 기음 미디어, 세탁 요리 (예, 1-2 ml/60 mm 요리)가되면 실온에서 신선한 0.5 ML의 STE을 추가하고 떠나 연속 현미경 관찰 1 주변 분을위한. 섬유 아세포가 분리하지만 상피 세포가 부드럽게 여전히 자기편이지만 급격히 섬유 아세포를 제거하기 위해 하드 표면에 대한 요리의 측면을 잃었하고 신속하게 기음합니다. PBS로 한 번 씻어, 다시 대기음. 크게 섬유 아세포로 오염 된 문화는 추가 DT가 필요할 수 있습니다. </li><li> 대형 상피 패치가 존재 차 문화를 하위 문화 있지만, 합류하기 전에. organoid 심는 및 첨부 파일의 밀도는 필요한 시간에 영향을 미칠 것입니다. 주 문화를 유지하고 시간이 지남에 따라 간격을두고 여러 차 문화를 생성하기 위해 일부 Trypsinizations (PT)을 수행합니다. </li><li> 기음 미디어는 요리에 0.5 ML 신선한 STE을 추가, 1-2 ML의 STE와 60mm 요리를 씻는다. 셀 부대를 홍보 할 수있는 요리의 부드럽게 두드리는 소리와 함께 1-5 분 동안 실온에서 현미경으로 세포 부대를 관찰. Trypsinization은 세포 ~ 50 %가 분리했을 때 중지해야합니다. 조기 포인트는 일반적으로 빠른 세포 손상이 있습니다. 모든 세포가 빨리 내려 올 수 있으므로 나중에 포인트를 들어, 세포는, 조심 모니터링, 빠른 분리를 위해 37 ° C에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 접시에 혈청 함유 미디어의 2 ML을 추가 repipette는 세척 및 살균 15 ML 튜브로 전송합니다. 관에 빨래를 추가, 다른 ~ 1-2 ML 미디어와 함께 배를 반복합니다. 기본 요리를 Refeed와 보육로 돌아갑니다. 혈구와 튜브에 세포를 계산합니다. 한 번 subcultured, 세포 모르겠지만이없고, 포인트는 subcultured 또는 냉동 예비 (제 2 통로 세포가 예비라고의 기본 요리와 이에 상응하는 장기적인 성장의 좋은 세포 regrowth을 8-4 주위에 번 반복 할 수 있습니다nger의 예비 선거). 일단 organoid 물질이 차 문화에 존재는 더 이상 없다 subcultured 예비 장기 인구 복제 가능성의 감소를 보여줍니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 예비으로 하위 문화를 들면, 종자 세포에 직접 요리에 관에서. 이러한 M87A + X와 같은 강력한 매체에 1-2 × 10 5 cells/100 mm 요리를 심는 것은 4~7일에 합류 될 것입니다. 우리는 proliferative 가능성을 높이기 위해 제 2 통로에있는 매체에 콜레라 독소를 추가, 그것은 organoids에서 multilayered 세포 가지로 연결하기 때문에 콜레라 독소는 차 문화에 생략됩니다. </li><li> 냉동의 경우 예비로, 펠릿 관 10 6 세포 / ML의 최종 밀도 CPMII에서 5 분, 그리고 resuspend 600 XG에서. 나누어지는이 Nunc 형 동결 ampoules에 세포를 resuspended -80시 야간 고정 ° C 한 후 액체 질소에 저장 장치에 즉시 전송할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 그것은 보관에 대한 첫 번째 태평양 표준시에서 세포를 고정하는 것이 좋습니다, 그리고 수 있습니다하위 문화에 대한 두 번째 태평양 표준시의 세포를 사용합니다. 추가 포인트는 나중에 사용하기 위해 냉동 보관하실 수 있습니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 인간의 유방 조직 처리 방법은 인간의 가슴속에 세포 유형의 이기종 혼합물에서 순수한 유방 상피 세포를 획득 할 수 있습니다. 고정 크기의 구멍을 통해 여과 소화 stromal 매트릭스에서 유선의 다른 분수 (예를 들어, ductal 및 ductal - 폐포 대 폐포)의 분리 할 수 있습니다. Isogenic 유방 섬유 아세포는 상피 세포와 일치하도록 얻을 수 있습니다. 냉동 소화 물질은 30 년 좋은 생존은 그대로 남아 있습니다. 이 방법은 모든하지만 매우 섬유 유방 조직에 성공적으로 일을하고, 수행 할 수 간단했다. 유방 조직 처리의 다른 변형은 가능한 깨끗하고, 또는 분리 된 상피 분수를 제공하지 않는 존재합니다. 같은 M87A의 낮은 스트레스를 유도하는 매체와 문화에 처리 organoids의 위치는 여러 계보 (Lineage) 마커와 HMEC의 장기 성장을 할 수 있습니다. 플라스틱 배양 된 HMEC는 여전히 장군에게 능력을 보유생체 같은 혈통 관계의 정상적인있는 테 3D 구조. 이 HMEC 문화는 정상적인 HMEC 행동과 노화와 변화를 추진하거나 억제 할 수 있습니다 요인의 높은 처리량을 포함한 광범위한 실험 조사, 적합합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 유리 페트리 접시 15cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> 가위 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> 집게 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> 일회용 메스 </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 시그마 </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / 스트렙토 마이신 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> 생명 기술 </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymixin B 황산 </td><td> 생명 기술 </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 생명 기술</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> 트립신 0.05 % 100 ML </td><td> 생명 기술 </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 생명 기술 </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> 생명 기술 </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 100 μm </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 40 μm </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 튜브 15 ML </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> 튜브 50 ML </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC 요리 10cm </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC 요리 6cm </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> 극저온 튜브 </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> 하우저 과학 </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf 모델 </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

세포 배양을위한 인간 감소 mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

실험 정상적인 인간의 유방 상피 세포 (HMEC) 행동의 검사 방법과 정상 세포 이상 속성을 취득은 체외 문화 시스템에 의해 촉진 될 수 생체 생물학에 더 정확하게 모델입니다. 세포 차별화를 공부 인간의 유래 물질의 사용은 노화, 노화, 그리고 불멸화 1-2 인간과 일반적으로 활용 쥐 세포 사이의 이러한 속성에서 많은 중요한 분자의 차이 주어진 특히 바람직하다. 정상과 비정상 조직의 대량는 감소 mammoplasty과 유방 절제술의 수술의 주파수로 인해 사용할 수 있기 때문에 유방 세포는 편리한 모델 시스템을 제시한다. 유선은 많은 서로 다른 세포 유형, 예를 들어, 상피, 지방, 중간 엽, 내피의 복잡한 혼합물로 구성되어 있습니다. 상피 세포는 젖 분비의 차별화 된 유방 기능을 할 책임이 있습니다또한 인간 유방암의 대부분의 출처입니다. 우리는 순수한 상피 구성 요소로뿐만 아니라 중간 엽 세포에게 3 유선 수술 폐기 조직을 처리하는 방법을 개발했습니다. 처리 자료는 무한정 냉동 보관 또는 기본 문화에 시작 할 수 있습니다. 외과 폐기 자료는 실험실로 이송하고 수동 상피 포함하는 조직에 풍부하게 해부하고 있습니다. 해부 조직의 후속 소화은 지하 막에있는 상피 조직에서 collagenase와 hyaluronidase 스트립 stromal 자료를 사용합니다. 상피 나무의 결과 작은 조각 (organoids)는 고정 기공 크기의 멤브레인에 연속 여과하여 소화 기질로부터 분리 될 수있다. 기공 크기에 따라 분수가 큰 폐포 / ductal 조각, 작은 폐포 클러스터, 또는 stromal 세포로 구성된 얻을 수 있습니다. 문화는 비밀입니다으로보다는 organoids로 시작하는 경우 우리는 뛰어난 성장을 관찰 한sociated 단일 세포. 낮은 스트레스를 유발 미디어를 사용 문화에 organoids의 위치는 여러 계보 (Lineage) 유형 (myoepithelial, luminal, 전구) 4-5의 마커와 일반 HMEC의 장기적인 성장을 지원합니다. 세포의 충분한 숫자는 높은 처리량 modalities를 사용하여 표준화 된 셀 배치뿐만 아니라 심문을 사용하여 다양한 실험 시험을 허용 한 개인의 조직에서 얻을 수 있습니다. 양식 HMEC는 성장, 분화, 노화, 그리고 노화, 어떻게 이러한 일반적인 프로세스가 불멸과 악성 변화 4-15,16 동안 변경 아르에 관한 일반적인 과정을 조사 연구 다양한 고용되었습니다. 세포 외 기질 재료, 다른 세포 유형, 및 / 또는 3D 문화의 존재 성장의 효과는 플라스틱 5,15의 성장과 비교 될 수있다. 양식 HMEC는 정상 세포로 시작, 그 요인을 검토하는 실험적으로 다루기 쉬운 시스템을 제공인간의 노화와 발암을 추진하거나 방지 할 수 있습니다.

적절하게 organoids에 소화와 문화에 배치 조직에 ​​대한 대표 수치는 그림 1에 표시됩니다. 불완전하게 소화 조직 물질이 이러한 구조의 외부에 부착하고, 가능성이 DT 제거 요구, 기본 문화에 fibroblastic 세포 성장을해야합니다 표시됩니다. Overdigested 조직 적은 부드러운 외부 경계를 표시하고, 기본 문화에 첨부하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 상피 가지가 48-72 시간 (1B, C)에서 시작해야합니다. vasculature (1D)의 작은 조각은 중간 엽 세포 가지의 소스가 될 수 있습니다. 상피 outgrowths는 myoepithelial, 전구, 그리고 luminal lineages (1E, 3C-E)와 관련된 마커와 세포의 혼합물을 포함 proliferative 인구, morphologically 이기종 인구를 보여줍니다. 콜레라 독소와 옥시토신과 보충 등 M87A의 낮은 스트레스 미디어의 성장은 우수한 장기를 지원합니다일반 사전 스테이 시스 HMEC의 성장은 이전 미디어 공법 (그림 2)에 비교했다. 이후, 대부분의 세포는 myoepithelial 계보 (Lineage) 마커를 표시, M87A 타입의 미디어도 4-8 (그림 3C-E, 4) 통로를 통해 luminal 및 전구 세포의 성장을 지원합니다. 플라스틱 배양 HMEC는 myoepithelial 세포 (그림 4A, B)에 내부 luminal 셀과 micropatterned 3D microwells에 자기 조직 적절한 3D를 형성하는 능력을 유지 할 수 있으며, Matrigel (4C, D)에 도금 할 때 조직 구조를 형성 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. HMEC organoids 및 기본 문화. (A) Organoid은 소화하고 여과 한 후 ductal - 폐포 구조를 보여주고 있습니다. (B, C) 이일 차 문화에 배치 한 후 ductal와 폐포 구조를 나타낸 Organoids는, 시작 셀 outgr에 유의owth (흰색 화살표). (D) 작은 혈관이와 B, C.와 동일한 문화에서 섬유 아세포 가지를 시작으로 첨부 사일 후 기본 organoid 문화에서 (E) 상피 세포 가지. Lineages는 K14 (빨간색)와 K19 (녹색)에 항체와 얼룩에 의해 식별되며, 핵은 DAPI (파란색) 물들되었습니다. Luminal (K14-/K19 +, 녹색), myoepithelial (K14 + / K19-, 빨강) 및 전구 (K14 + / K19 +, 노란색) 세포 볼 수 있습니다. 흠없는 세포는 불완전 항체 침투로 인해 organoid 코어에서 관찰됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 한 사람, 표본 184에서 얻은 다양한 미디어 공법에 HMEC 문화의 성장. Organoids는 다른 미디어 공법을 사용하여 기본 문화에 시작되었다. 최고의 장기적인 성장은 우리의 가장 최근의 수립, M87A + 옥시토신 (X) 4를 사용하여 얻어진다. 이 매체는 또한 지원여러 HMEC lineages의 성장 (그림. 1E 참조). 이전 미디어 수립, MM 3 적은 강력한 성장을 제공하는 동안 혈청이없는 미디어, MCDB170 (상업용 MEGM) 신속한 cyclin 키나제 억제제 p16 INK4A의 유도와 7,11,13 비정상 세포에 대한 선택에서 17 리드. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> 그림 3. (A) EpCAM와 CD49f/alpha 6 인테그린의 표현, 그리고 (B) CD227/Muc1에 대한 교양, 효소 dissociated organoid 4 일 통과. (A, B) FACS 분석에서 교양 organoids과 교양 HMEC의 계보 (Lineage) 다양성의 비교 그리고 CD10/CALLA. (C, D) FACS의 (C) EpCAM 및 CD49f/alpha 6 인테그린의 표현을위한 제 4 회 통로 사전 스테이 시스 HMEC의 분석, 그리고 (D) CD227/Muc1 및 CD10/CALLA. 신상 Populations는 LEP (luminal 마커 EPCAM 또는 CD227을 표현), MEP (myoepithelial 마커 CD49f 또는 CD10을 표현) 또는 음식물 (CD49f + / EPCAM + 인구 풍부)로 표시됩니다. EpCAM 및 CD49f 변경의 문화 규제에 적응하는 동안 교양 organoids에 비해합니다. (E) 정렬되지 않은 HMEC과 4 번째 통로에서 FACS 강화 LEP 및 MEP는 혈통 식별을 확인하기 위해 각질 K14 (MEP 마커)와 K19 (LEP 마커)의 immunofluorescence 분석 얼룩이. DAPI로 핵의 스테인드 파란색 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> 4 그림. 양식 HMEC 적절한 microenvironments에 배치 생체 같은 혈통 관계에서와 조직 구조를 형성 할 수 있습니다. (A) 사전 스테이 시스 4 일 통과 HMEC는 FACS 강화 나였다n 인물 luminal LEP 및 myoepithelial MEP의 lineages은 (표시되지 않음) K14와 K19의 표현에 의해 확인이 lineages과 CD227과 CD10에 대한 마커를 사용합니다. (B) micropatterned microwells에서 함께 혼합하면, 배양 세포는 외부와 LEP 내부에 MEP와 bilayers에 자기 조직 할 수 있었다 [샹송 외에서 적응. 5]. 휘황 표시 LEP (녹색)와 MEP는 (빨간색) microwells (위쪽)에 추가 한 후 공 촛점 0 시간에 현미경, 24 시간, 48 시간으로 이미징했다. 제어 HMEC은 임의로 빨간색 또는 녹색 형광 라벨 (아래)으로 분류되었다. (C) FACS 강화 전구 세포의 시야 이미지 (cKit +) 3D (Matrigel) 문화에 도금 18 일 성장. 결과 구조는 폐포 morphogenesis을 전시 할 수 있습니다. (D) 구조는 Matrigel에서 추출되어 K14 및 K19를 감지 할 수 물들 된, 핵은 DAPI로 counterstained했다. Immunofluorescent 분석은 올바른 luminal 및 기초 폴라와 조직 구조를 보여줍니다rity.

인간의 유방 수술 폐기 자료를 처리하는 방법이 설명되어 있습니다. organoids의 형태로 처리 조직은, 무기한 정지 또는 장기 성장 문화에 배치 저장할 수 있습니다. 이 방법은 실험 정상적인 인간 내피 세포 생물학의 심사 및 외인성 섭동의 효과를 수 있습니다.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

이 프로토콜은 유선의 상피 부분을 관련 유방 기질 세포가 없는 상태로 분리하는 것을 목표로 합니다. 효소 분해를 사용하여 상피 구조를 풍부하게 하기 위해 외과적 폐기 물질의 누적 절개부터 시작합니다. 기저막 외부의 기질 물질로부터 상피 오가노이드를 분리합니다.그런 다음 고정된 공극 크기의 세포 스트레이너를 통해 분해된 오가노이드를 처리하여 농축된 분획을 얻습니다. 즉각적인 배양을 위해 오가노이드를 파종하거나 나중에 사용할 수 있도록 재고를 동결합니다. 궁극적으로, 상피 오가노이드는 정상적인 인간 유방 상피 세포의 장기 배양을 생성하는 데 사용됩니다.저는 1970년대 후반에 인간 상피 세포 생물학 및 발암 분야를 발전시키기 위해 이 방법을 처음 개발했습니다. 정상적인 인간의 기억 조직에서 풍부한 외과적 폐기 물질을 사용할 수 있었습니다. 필요한 것은 이 벌크 이종 물질을 순수 상피 세포 배양 및 배지에 적합하게 처리하여 장기적인 성장을 지원하는 방법이었습니다.이 방법의 시각적 시연은 특히 조잡한 해부를 수행하는 방법을 기록하는 데 도움이 됩니다. 적절하게 소화된 오가노이드는 어떤 모습인가요? 오가노이드를 여과하고 배양을 위해 오가노이드를 도금합니다.이 기술의 장점은 기질에 대해 깨끗한 상피 분획을 제공하고 상피 세포가 손상되지 않은 상태로 유지된다는 것입니다. 우리가 발견한 오가노이드는 최상의 초기 성장을 제공하고 얻을 수 있는 세포의 수를 최대화합니다. 로렌스 버클리 국립 연구소 (Lawrence Berkeley National Laboratory)의 두 과학자 인 제임스 가비 (James Garvey)와 마크 르바지 (Mark LeBarge)는 이제 수술 절차의 버려진 재료에서이 절차를 시연 할 것입니다.섭씨 4도에서 완충액 또는 완전한 배지와 항생제가 들어 있는 멸균 용기에서 인간 유방 조직을 채취합니다. 티슈 조각을 잘라 큰 유리 멸균 접시에 넣으십시오. 상피 영역을 지방 조직, 결합 조직 및 혈관의 기질 기질에서 분리합니다.더 황갈색 기질 기질에 박혀 있는 상피 영역의 흰색 가닥을 부드럽게 해부합니다. 집게로 재료를 잡고 메스로 지방이 많은 재료를 긁어냅니다. 그런 다음 반대쪽 메스로 상피 조직을 약 4mm 조각으로 잘라 소화를 용이하게 합니다.절개된 상피 조직을 섬유질이 많은 조직에서 50 또는 15ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 더 단단한 흰색 비 상피 물질이 있을 것입니다. 이러한 섬유질 매트릭스에서 상피 세포를 해부하기 어려운 경우.조직은 1-3mm 정사각형 조각으로 절단하고 별도로 소화할 수 있습니다. 조잡한 콜라겐 분해 효소와 높은 alur days를 포함하는 소화 매체로 튜브를 채우고 회전 중에 혼합할 수 있도록 작은 공간을 남겨 둡니다. 분해 후 섭씨 37도의 360도 회전기에서 8RPM으로 하룻밤 동안 샘플을 배양합니다.5분 동안 600G의 원심분리로 샘플을 펠렛화합니다. 상층액 지방과 배지는 인체 조직 폐기에 대한 제도적 지침에 따라 폐기합니다. 조직 소화를 모니터링하기 위해 펠릿의 작은 Eloqua를 배지로 희석하고 완전히 소화된 오가노이드에서 현미경으로 검사하면 부착된 기질이 나타납니다.조직이 순수한 오가노이드로 완전히 소화될 때까지 효소 분해를 반복합니다. 하룻밤 사이에 두 번째 소화가 필요한 경우, 과도한 소화를 방지하기 위해 효소 농도를 줄여야 할 수도 있습니다. 적절하게 소화된 오가노이드는 부착된 기질이 없는 매끄럽게 보이는 관 폐포 또는 관 폐포 구조를 보여줍니다.분해가 완료되면 resus는 최종 펠릿을 중간 위치에 있는 항생제에 현탁시킵니다. 분해된 샘플을 쿼트에 담아 멸균된 100미크론 여과기를 멸균된 50ml 튜브 위로 통과시킵니다. 배지가 튜브로 배출된 후 3ml의 배지로 오가노이드를 세척합니다.재현탁된 펠릿이 모두 옮겨질 때까지 반복합니다. 그런 다음 필터를 멸균 튜브 위로 조심스럽게 뒤집고 더 많은 매체를 사용하여 오가노이드를 튜브로 세척합니다. 이것은 100미크론 오가노이드 풀입니다.이제 원래의 50 밀리리터 튜브로 배출된 물질을 40 미크론 여과기에 통과시켜 단일 세포의 여과액 풀과 중간엽 및 상피 세포의 작은 덩어리 및 작은 혈관 조직 조각에서 폐포 구조를 분리합니다. 100 미크론, 40 미크론 및 여과액 풀을 600G에서 5분 동안 원심분리합니다. 1ml의 ccpm을 사용하여 각 샘플을 재구성합니다.포장된 입천장 0.1ml당 2개의 동결 용액. 섭씨 4도를 유지하십시오. 두 개의 오가노이드 풀 각각을 0.1ml씩 조심스럽게 놓습니다.하나 또는 2 개의 35mm 접시에 균일 한 방울 떨어뜨립니다. 오가노이드가 부착되도록 몇 분 후에 접시 표면을 긁지 마십시오. 오가노이드가 빠지지 않도록 성장 배지를 천천히 추가합니다.그런 다음 1차 배양물을 섭씨 37도의 가습된 CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 또한 0.1ml의 여과액 풀을 섬유아세포 배지가 있는 조직 배양 플라스틱에 직접 파종합니다. 1차 배양물을 섭씨 37도의 가습 CO2 인큐베이터에서 배양합니다.24-48시간 후 오가노이드에서 세포 이동을 확인하고 2-3일 후에 유사분열 성장 배양을 모니터링합니다. 세포는 거의 합류하여 2-3일마다 배지를 보충합니다. 혈관 구조의 작은 조각이 부착되어 섬유아세포 증식을 일으킬 수 있습니다.섬유아세포가 크게 성장하는 경우. 큰 상피 패치에서 섬유아세포를 제거하기 위해 차등 트리핀화를 수행합니다. STE 완충액에서 세포를 한 번 세척합니다.그런 다음 새로운 0.5ml STE를 추가하여 지속적인 현미경 관찰과 단단한 표면에 접시를 부드럽지만 날카롭게 두드려 접시를 덮습니다. 상피 세포가 아직 부착 통로를 유지하고 있는 동안 섬유아세포 박리를 찾습니다. 상피 외성장의 패치가 합류에 가까워 졌을 때의 기본 배양.1차 배양을 유지하고 여러 2차 배양을 생성하려면 부분 트립신을 사용합니다. STE 버퍼에서 세포를 한 번 씻은 다음 새 STE를 추가하여 접시를 덮습니다. 셀의 약 50%가 분리되었는지 모니터링합니다.그런 다음 성장 배지를 함유한 혈청 2ml를 추가하고 세포를 수확합니다. 그런 다음 두 번 세척한 후 세포를 멸균된 15ml 튜브로 옮깁니다. 수확된 세포를 모으고 배양: 부분화는 약 4회에서 8회 정도 반복할 수 있으며, 1차 접시에서 양호한 세포 재성장과 하대배양 또는 동결된 2차 배양에서 동등한 장기 성장이 가능합니다.첫 번째 부분 트립신 삽입의 세포는 보관을 위해 동결하고 두 번째 PT의 세포를 계대배양에 사용하는 것이 좋습니다. 조직이 적절하게 소화되고 여과되면 오가노이드가 나타나고 유관 및 폐포 구조가 부착된 기질이 없는 매끄러운 가장자리로 볼 수 있습니다. 과소 소화되면 물질이 부착되고 더 많은 섬유아세포 오염이 발생하며, 과도하게 소화되면 가장자리가 거칠어지고 오가노이드 부착 후 부착 효율성이 떨어집니다.상피 성장은 48시간에서 72시간 이내에 48시간에 시작됩니다. 72시간까지 가시적 유사분열을 동반한 활발한 세포 분열은 아직 없습니다. 유사분열(mitosis)이 더 눈에 띄게 되어야 합니다.혈관 구조의 작은 조각은 4일 후에 중간엽 세포 증식의 원인이 될 수 있습니다. 상피 외성장은 형태학적으로 이질적인 개체군을 나타내며, 여기에서 케라틴 14 및 케라틴 19에 대한 항체로 염색하면 녹색 K 19 양성 내강 및 빨간색 K 14 양성 근상피 계통과 노란색 K 14 양성 K 19 양성 전구 세포를 표시합니다. HMEC는 다양한 배지 제형에서 배양할 수 있습니다.콜레라 독소와 옥시토신이 보충된 M 87 a와 같은 저스트레스 매체는 정상적인 사전 정지 HMEC의 우수한 장기 성장과 여러 HMEC 계통의 성장을 지원합니다. 사실 분석 결과는 배양되지 않은 오가노이드와 네 번째 통로에서 M 87, A 배지에서 배양된 HMEC의 계통 다양성을 보여줍니다. 여기서, 내강 및 근상피 개체군은 내강 마커, EPCA 및 CD 2 27 및 근상피 마커 CD 49 F 및 CD 10 재플레이팅의 발현에 의해 식별됩니다.네 번째 통로, HMEC. 이전의 내강 및 근상피 마커에 대해 풍부한 사실은 케라틴 K 14 및 K 19 HMEC에 대한 면역 형광 분석을 사용하여 계통을 확인했습니다. 플라스틱에서 배양하여 4 계대는 내강 세포와 근상피 세포의 계통 관계와 같은 생체 내에서 조직화 된 구조를 형성 할 수 있으며, 적절한 CD 2, 27 및 CD 10에 배치되면 이러한 두 계통을 농축하는 데 사용됩니다.HMC는 근상피 세포 내부에 있는 루미날 세포가 있는 마이크로 패턴의 3D 마이크로 웰에서 적절한 3D 세포 조직을 형성하는 능력을 유지합니다. 사실이 풍부한 전구 세포는 또한 마트리겔에 도금될 때 관상 및 폐포 구조를 모방한 견고한 3D 구조를 형성할 수 있습니다. Matrigel의 3D 구조는 또한 적절한 3D 자기 조직화를 나타냅니다.이 비디오를 시청한 후에는 관련 유선 기질이 없는 유선의 상피 부분을 정화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 2-3일 동안 수행할 수 있습니다. 조직 처리 기술은 일반적으로 간단합니다.올바른 지점에서 소화를 멈추는 것을 기억하는 것이 중요하다.

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<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

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