Name: 성장 Axons 함께 손쥐 Schwann 세포 개발 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 배우세요 성장하는 축삭을 따라 슈반 세포가 이동하는 과정을 관찰하는 방법을. 마우스 상경부 신경절을 콜라겐 매트릭스에 배양하고 NGF로 처리하여 시간 경과 이미징으로 정량적 분석을 수행합니다.

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우리는 우수한 기술 지원을위한 콜라겐 프로토콜과 Jutta 페이와 우르술라 Hinz을 공유 Urmas의 Arumae 감사드립니다. 아울러 우리는 친절 비디오 shoting에 도움을 기독교 F. Ackermann, Ulrike 엥겔과 하이델베르크 (Heidelberg) 대학에서 니콘 이미징 센터와도 요아킴 Kirsch 감사드립니다. 작품은 부분적으로 독일 Forschungsgemeinschaft (SFB 592)를 통해 기금을 마련했다.

1. 콜라겐 젤의 작성 <ol><li> 455 μl 10X 가상, 112 μl 7.5 % NaHCO 3, 50 μl 글루타민과 NaOH를 포함 주식 매체를 준비합니다. 농도와 NaOH의 양이 쥐 꼬리 콜라겐 준비 (1.2 참조), 1,000 μl되는 주식 매체의 마지막 볼륨에 따라 달라집니다. </li><li> Ebendal (1)에 따라 쥐 - 꼬리 콜라겐을 준비합니다. 4 ° C.에있는 콜라겐 솔루션을 저장 콜라겐 솔루션의 저하가 관찰 할 수 없습니다. 새로운 배치의 준비 후에 (1.1 참조) 주식 매체에 필요한 NaOH 농도를 추정. NaOH의 양 및 농도의 적정을위한 매체의 pH-표시기를 사용합니다. 800 μl 산성 쥐 - 꼬리 콜라겐은 재고 매체의 210 μl를 혼합 할 때 붉은 색의 그늘을 돌려해야합니다. NaOH의 농도가 너무 낮 으면 콜라겐 솔루션은 매체의 산도 표시기로 인해 노란색으로 바뀝니다. 찌르다없이 매체와 혼합에 콜라겐을 추가거품 ucing. 얼음에서 다음 단계를 수행합니다. 중합은 콜라겐 솔루션과 재고 매체가 혼합 된 후 2 시간 이내에 발생하고 새로운 솔루션은 37 ° C.에 incubated 수 있습니다 실험을 시작하기 전에이 작업을 테스트합니다. 1.3) 재고 매체의 210 μl (1.2 참조)과 콜라겐 솔루션 800 μl를 섞는다. 8 잘 챔버 슬라이드의 우물이 솔루션의 장소 100 μl. 37 슬라이드를 길러 ° C, 5 % CO 2 및 세포 문화 인큐베이터에서 습기 조건. 세포 배양 벤치 및 무균 조건 하에서 콜라겐 젤을 준비합니다. 콜라겐은 2 시간 이내에 gelatinizes. </li></ol> 2. 배아 SCGs의 해부 <ol><li> 시간이 임신 자궁의 쥐 (E16-18) 및 추가 필요 할 때까지 PBS에 보관 수확의 배아. </li><li> 양막에서 하나 배아를 해부. 쇄골의 수준의 배아 꼬리 목을 벨. &quot;곤충 - 바늘 &#39;로 실리콘 바닥 요리에 머리를 수정합니다. 머리의 복부 측면 여러분에게 직면하는당신은 턱밑 지역을 볼 수 있습니다 싶네요. 고정 쉽게 준비 할 수 있습니다. </li><li> 왼쪽 및 오른쪽 턱밑 지역의 피부를 제거하고 하위 피부 결합 조직과 함께. </li><li> 목 뿔뼈, infrahyoidal 근육과 목 빗근에보기를 삭제하려면 자신의 위치에서 턱밑 침샘을 제거합니다. </li><li> 후두 및 기관에보기를 삭제하려면 신중하게 이러한 근육을 제거합니다. 기도와 후두를 제거합니다. 경동맥 동맥는 prevertebral 근육의 양쪽에 볼 수 있습니다. SCG는 경동맥 동맥의 분기에 위치하고 있으며, 타원형 모양을 갖추고 있습니다. 조심스럽게 신경절을 제거하고 PBS에 배치합니다. 그들이 지키는 경우 분해 도구 부드럽게 신경절을 제거합니다. 이 집게뿐만 아니라 SCG 제거 &quot;곤충 바늘 &#39;로 장착 바늘 홀더를 사용하여 유용합니다. </li><li> 당신이 enou를 해부 할 때까지 한 번에 PBS에 PBS에 실온에서 신경절을 저장GH 신경절. 그런 다음 혈관과 결합 조직에서 신경절을 청소하십시오. 층류 벤치에서 위치 해부 현미경으로 SCG 해부 및 청소를 수행합니다. </li><li> 마지막으로, 쉽게 처리 할 수​​있는 주사기에 장착 주사기 바늘의 도움으로 gelatinized 콜라겐 젤에 explanted 신경절를 놓습니다. </li><li> 5 % CO 2와 습기 조건, 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 gelatinized 콜라겐의 SCG explants를 품다. </li></ol> 3. SCG Explants의 치료 <ol><li> 1-2 시간의 배양 후, B27 보충제, 글루타민과 항생제를 포함하는 100 μl Neurobasal 세포 배양 매체와 SCG explant가 포함 된 콜라겐을 다룹니다. 이제 챔버 슬라이드 우물 200 μl (100 μl 젤과 100 μl 매체)의 볼륨을 포함하고 있습니다. , 매체의 또 다른 200 μl를 추가하지만 지금은 axonal 성장을 촉진하기 NGF를 (60 NG / ML) 포함. 따라서 최종 NGF 농도는 30 NG / ML입니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> SC 이전의 발병을 조사하기 위해 체외 0 (DIV0)에 일에 직접 추가 요소를 추가 할 수 있습니다. 필요한 더블 농도 (2) NGF가 포함 된 미디어의 요소를 분해. </li><li> 이미 axons 따라 이주 시작 SCS에 미치는 영향을 분석하기 위해, DIV4 (실험의 잠재적 정류장)까지 D​​IV3에서 추가 요소를 추가 할 수 있습니다. 이를 위해 신중하게 DIV3에서 솔루션 180 μl를 제거 200 μl 새로운 매체에 포함 된 NGF와 더블 농도 (2)에 대한 관심의 추가 요소를 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 시간 경과 영상 분석을위한 역 현미경을 사용하십시오. 다양한 목표를보기 및 확대의 필드를 정의 할 수 있습니다. SCG explants의 이미지는 유리 슬라이드와 콜라겐을 통해 수행되기 때문에 하나의 중요한 측면은 그러나, 사용 목적의 작동 거리입니다젤. 1/10-30 분 녹화 프레임 속도는 좋은 결과 (2) 보여 주었다. 그러나이 점은 과학 질문에 대한 조정되어야한다. 일반 CCD 카메라는 이미지 수집에 사용할 수 있습니다. 시간 경과 영상에 대한 세포 배양 배양 챔버는 현미경의 무대에 첨부되어야한다. 5 % CO 2와 습기 조건, 37 ° C에서 영상 동안 조직을 품다. 영상이 시작되기 전에 부화 시스템하다 시간을 시작합니다. 이 챔버 슬라이드를 포함하여 현미경 부품 (예 : 목표)의 온도에 적응 할 수 있으며, 온도 유도 앉를 방지 할 수 있습니다. 현미경 소프트웨어의 도움과 SCG explants에 다른 적용 조건의 동시 분석을위한 소프트웨어 제어 동력 단계 (multiposition 설치)에 분석의 특정 영역 (explant에 내 서로 다른 explants 사이) 정의합니다. 사용할 수있는 시간 경과 영상 wildtype 조직뿐만 아니라 유전자 변형 동물의 조직에 대한(3) : SCS (GFP s100b)을 표시. 영상 fluorophores를 들어 형광등 광원 micropscope 설정에서 구현해야합니다. 표준 필터를 사용합니다. 5. SC 마이그레이션 거리의 정량화 <ol><li> 끝 지점 (예를 들어 DIV4)에, 3-4 시간의 챔버 슬라이드에 4% PFA과 콜라겐 젤을 해결할 수 있습니다. 연속 PBS로 10 분의 콜라겐 젤 다섯 번 씻는다. immunocytochemistry (2)에 대한 표준 프로토콜을 적용합니다. 당신은 SCGs의 준비에 새로하는 경우, 티로신 hydroxylase에 대한 immunohistochemistry에 의해 교감 신경절 (TH) catecholaminergic 세포를위한 공통의 마커로 신경절의 신원을 확인합니다. immunohistochemistry 동안 (주 항체 후), 젤을 세정에 도움이되는 더 큰 볼륨을 가지고 24 잘 접시에 explant 포함 콜라겐 젤을 전송할 수 있습니다. </li><li> immunohistochemistry 후, 유리 슬라이드에 콜라겐 젤을주의 깊게 배치합니다. 주의하여나머지 솔루션을 제거하고 콜라겐이 건조 / 2 크기로 축소 보자. 이 거리를 (2) 쉽게 측정 할 수 있습니다. 이 후, 샘플을 탑재합니다. </li><li> 마지막으로, 피지 (NIH) 소프트웨어의 도움으로 마이그레이션 거리를 측정합니다. 특별한 플러그인이 끝 부분에 필요하지 않습니다. μm의 정확한 측정을 허용하려면 올바른 이미지 메타 데이터 및 피지 아래의 설정, 이미지와 규모를 확인합니다. 세포의 정량화에도 피지를 사용하십시오. </li></ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
<li>Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience.+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).</li>
<li>Levi-Montalcini, R., Booker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXCESSIVE+GROWTH+OF+THE+SYMPATHETIC+GANGLIA+EVOKED+BY+A+PROTEIN+ISOLATED+FROM+MOUSE+SALIVARY+GLANDS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).</li>
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<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
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<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
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<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

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주변 신경 시스템의 개발은 흥미로운 과정이다. 개발이 완료되면, axons는 인간에 자주 이상 100cm 할 수 있습니다 전체 길이를 따라 SCS에 의해 ensheathed 있습니다. 이를 위해 필요한 SCS의 정확한 숫자는 개발 중에 설립 할 수 있으며 SCS는 전체 axonal 범위를 확인하기 위해 주변에 확장 axons을 따라 이동해야합니다. 이 myelinated뿐만 아니라에 대한 unmeylinated axons에 대한 진정한 보유하고 있습니다. 두 경우 모두 모든 axons은 SCS와 접촉하고 그들의 지원에 따라 달라집니다. SC 개발을 공부하고, assays이 계정에 axonal 구획을하기 때문에 스크래치 assays보다 정도 (5)에 생체 개발을 모방하는 필요, Boyden의 assays (6) 또는 챔버 assays는 할 수 있습니다. 일부 assays에서 axonal 구획은 이미 고려되었습니다. 예를 들어 좌골 신경의 섹션은 마이그레...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 10X 가상 </td><td> Gibco </td><td> 21,430 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 (7.5 %) </td><td> Gibco </td><td> 25,080 </td><td></td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 머크 </td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> 로슈 </td><td> 1058231 </td><td> R &amp; D # 556-NG-100 </td></tr><tr><td> Neurobasal 중 </td><td> Gibco </td><td> 21,103 </td><td></td></tr><tr><td> B27 보충 </td><td> Gibco </td><td> 17,504 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 </td><td> Gibco </td><td> 15,640 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 14,040 </td><td></td></tr><tr><td> 곤충 바늘 </td><td> FST </td><td> 26002-20 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 바늘 </td><td> 브라운 </td><td></td><td> BD # 300013 </td></tr><tr><td> 8 잘 챔버 슬라이드 </td><td> 랩 테크 </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

성장 axons 함께 손쥐 schwann 세포 개발 분석

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

주변 신경의 발달은 흥미로운 과정이다. 뉴런은 인간의 이상 100cm 거리에 신경의 소마에서 자주 구체적인 목표를 신경을 분포시키다하기 위해 axons을 보낼 수 있습니다. 개발하는 동안 Neuronal 생존이 목표 - 유래 성장 요인에뿐만 아니라 Schwann 세포 (SCS)의 지원에 따라 달라집니다. 시냅스 또는 신경 근육 접합부에 neuronal 소마 (또는 중앙에서 주변 신경계로의 전환)의 지역에서이를 SC의 ensheath의 axons 있습니다. Schwann 세포는 각각의 문장의 파생이며, 전체 축삭은 SCS으로 덮여 때까지 새로운 axons 함께 전구체로 마이그레이션됩니다. 이 주변 신경 시스템의 개발을위한 SC 마이그레이션의 중요성을 보여줍니다이 과정을 조사 할 필요성을 강조. SC 발전을 분석하기 위해, 설치는 이전에 자신의 생리 기판, 축삭을 포함하는 SCS 옆에있는 필요합니다. 자궁 개발로 인해 (뮤스 musculus) 마우스와 같은 태반 vertebrates에 적합하지 않을 수 있습니다. 이 우회하기 위해, 우리는 우수한 자궁 경부 신경절 (SCG) explant 기술을 적응. 신경 성장 인자 (NGF)와 치료 후 SCG의 explants은 신경절에서 주변에 axons 따라 이전 SC의 전구체 다음 axons을 확장합니다. 이 시스템의 장점은 SC는 SC 내생의 풀에서하고 동시에 성장하고 자신의 생리 axons 따라 마이그레이션이 파생된다는 것입니다. axons 따라 SC 개발이 SC 마이그레이션에 통찰력을 얻기 위해 더 가능성을 열어, 시간 경과 영상으로 분석 할 수 있기 때문에이 시스템은 특히 흥미로운입니다.

Axonal 성장은 NGF (4) (영화 체계 S1 그림 1 방식)과 치료에 explants를 SCG에서 용이하게되어 있습니다. 이 과정은 어떤 역 현미경을 이용하여 쉽게 볼 수 있으며 시간 경과 영상 (영화 S2)에 의해 다음 수 있습니다. 과학자 마우스 배아에서 SCG을 해부에 새로운이라면 강력 간단한 안티 - 티로신 hydroxylase (TH) immunohistochemistry에 의해 기술의 유효성 검사를하는 것이 좋습니다. TH는 라벨 axons (그림 2B) catecholaminergic 뉴런 (이 경우 교감 신경 뉴런)를위한 공통의 마커입니다하지 않습니다. 이 방법으로 axonal 길이는이 시스템 (2)에서 분석 할 수 있습니다. axonal 성장이 유도 된 후 중요한, 마이그레이션 세포의 물결은 (영화 S2 및 S3) 관찰 할 수 있습니...

여기 SCS는 확장 axons을 함께 개발 할 수 있습니다하는 Schwann 세포 (SC) 마이그레이션 분석을 설명합니다.

성장 Axons 함께 손쥐 Schwann 세포 개발 분석

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

다음 실험의 목적은 자연 서식지인 성장하는 축삭돌기를 따라 슈완 세포의 발달을 분석하는 것입니다. 이것은 두 번째 단계로 첫 번째 ex explan superior cervical ganglia 또는 마우스 배아의 S cgs를 콜라겐 매트릭스에 의해 달성됩니다. S cgs는 신경 성장 인자 또는 NGF로 치료되며, 이는 관상 방식으로 SCG 뉴런의 축삭 성장을 촉진합니다.X explan에서 축삭 성장 외에도 내인성 슈완 세포(endogenous schwan cell)가 확장된 축삭을 따라 주변부로 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다. 슈완 세포 발달은 타임 랩스 이미징과 고정 조직의 종말점 분석을 통해 분석할 수 있으며, 이를 통해 거리를 측정할 수 있습니다. 스크래치 이동 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 백조 세포의 자연 서식지가 이 분석에 포함된다는 것입니다.이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 콜라겐 메트릭의 올바른 조립과 SGS의 올바른 해부가 성공의 열쇠이기 때문입니다. 이 단계는 배우기가 특별히 어렵지 않습니다.그들은 먼저 연습이 필요합니다. 조직 배양에서 일하는 동안 후드는 얼음 위의 모든 솔루션으로 우리의 상태를 이해했습니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 스톡 배양 배지와 쥐 꼬리 콜라겐을 준비합니다.800 마이크로 리터의 쥐 꼬리 콜라겐과 210 마이크로 리터의 스톡 배지를 혼합합니다. 거품이 생기지 않으면 용액은 붉은 색으로 유지되어야 합니다. 용액이 노랗게 변하면 Ratal 콜라겐 용액이 너무 산성이므로 더 높은 농도의 수산화나트륨 피펫 100 마이크로 방출로 용액을 다중 웰 슬라이드의 각 웰로 다시 만들고 각 웰의 바닥이 완전히 덮여 있는지 확인해야 합니다.접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 가습 조직 배양 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다. 수확 후 E 16 내지 E 18 배아를 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣은 다음 양막에서 해부하고 C 쇄골의 수평 코달에서 목을 베웁니다. 그런 다음 머리와 목 부위를 실리콘 바닥 접시로 옮기고 해부 현미경을 통해 보면서 곤충 바늘을 사용하여 턱밑과 쇄골 부위의 조직을 고정합니다.이제 집게를 사용하여 턱밑 부위의 피부와 피하 조직을 제거합니다. 그런 다음 턱밑 타액선을 제거하여 설상근, 하치근 및 흉쇄유돌근을 드러냅니다. 다음으로, 겸자를 사용하여 하부골 및 흉쇄유돌근을 조심스럽게 제거하여 후두와 기관을 드러냅니다.겸자로 기관을 잡고 기관과 후두를 들어 올립니다. 후두와 기관이 제거되면 경동맥이 보이고, 이는 추경 전 근육의 양쪽입니다. 상경추신경절(superior cervical ganglia)은 경동맥의 분기점에 위치하며 타원형으로 식별될 수 있습니다.집게와 곤충 바늘이 장착된 바늘 홀더를 사용하여 상경부신경절을 제거하고 PBS가 들어 있는 새 접시에 넣은 다음 신경절에서 혈관이나 연결된 조직을 해부합니다. 주사기 바늘을 사용하여 인큐베이터에서 젤라틴화된 콜라겐 젤을 제거하고 주사기에 장착된 주사기 바늘을 사용하여 신경절을 젤로 전달합니다. 이산화탄소가 5%이고 습한 조건에서 섭씨 37도로 설정된 조직 배양 인큐베이터에 외식을 1-2시간 동안 놓습니다.1-2시간의 배양 후, 조직 배양 인큐베이터에서 상경부 신경절 절개물을 채취하고 B 27 보충제 글루타민과 항생제를 함유한 100마이크로리터의 신경 기저 배지를 각 엑스플랜에 첨가합니다. 그 후, 200마이크로리터의 신경 기저 배지는 밀리리터당 60나노그램을 함유합니다. NGF는 또한 축삭 성장을 촉진하기 위해 우물에 추가됩니다.이 시기에 시험 물질이 추가될 수도 있는데, 이는 이미 이동하기 시작한 백조 세포에 미치는 영향을 연구하기 위해 시험관 내 0일로 정의됩니다. 축삭 물질은 기존 배지 180 마이크로 리터를 제거하고 관심 물질과 NGF를 포함하는 배지 200 마이크로 리터로 교체하여 체외 3 일 만에 투여 할 수 있으며, 타임 랩스 이미징은 병렬 세포 배양 배양 및 타임 랩스 이미징을 가능하게하는 도립 현미경 설정을 사용하여 수행되어 다른 테스트 물질을 비교합니다. 한 실험에서는 실험의 끝점에서 다중 위치 설정이 권장됩니다.배양 슬라이드에 4%PFA로 3-4시간 동안 고정하고 PBS로 세척한 후 면역조직화학을 수행하여 10%의 정상 당나귀 혈청과 2%의 트리톤 X 100이 함유된 PBS로 조직을 2시간 동안 차단하여 X 외식을 검증합니다. 그런 다음 밤새 차단 용액에서 1차 항체 배양을 수행합니다. 1차 항체 배양 후 다음날, PBS로 세척한 후 겔이 포함된 X 엑스플랜을 24웰 플레이트로 옮기고, 빛으로부터 보호된 상태에서 형광 표지된 2차 항체로 2시간 동안 배양한 다음, PBS로 세척하고 dappy 용액으로 10분 동안 배양합니다.여러 번 세척한 후 X 엑스플란이 포함된 콜라겐 젤을 현미경에 놓고 슬라이드를 밀고 건조시킨 다음 송아지 고기로 장착합니다. 표준 형광 현미경을 사용하여 향후 정량 분석을 위한 이미지를 얻을 수 있습니다. 현미경 소프트웨어가 메타데이터를 기록할 수 있는 경우 유용합니다.획득한 이미지의 정량 분석은 Fiji 또는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있으며, 이는 과학 응용 분야에 무료로 사용할 수 있습니다. 이 동영상에서는 4일 동안 시험관 내에서 도식적인 SCGX EXPLAN을 통한 축삭 성장을 보여줍니다. 면역조직화학검사는 이식된 신경절을 명확하게 확인하기 위해 4일째 되는 날에 시험관 내에서 시행할 수 있습니다.교감신경절(sympathetic ganglion)로서, 슈완 세포(schwan cell)는 축삭돌기(axon)를 따라 상경추신경절(superior cervical ganglion)에서 주변부(periphery)로 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다. 이 비디오는 더 높은 배율에서 본 것과 동일한 마이그레이션 패턴을 보여줍니다. 회로도에 묘사된 바와 같이 여러 위치에서 선행 슈완 세포의 핵에서 이식된 SCG의 경계까지의 거리를 측정함으로써 DPI가 있는 핵에 대한 샘플의 이동 거리를 쉽게 측정할 수 있으며, 이 동영상은 SCG 설명의 경계에서 슈완 세포의 이동을 보여줍니다.명시야와 형광의 결합을 통해 S 100 GFP 양성 백조 세포와 축삭돌기를 시각화할 수 있습니다. 마지막으로, 이 영화는 상경추 신경절(superior cervical ganglion ex explan)의 경계에서 슈완 세포(schwan cell)의 이동을 보여줍니다. 여기에는 형광 채널만 표시되어 S 100 GFP 양성 슈완 세포를 더 쉽게 해석할 수 있습니다.이 절차에 따라 하나의 세포 증식의 정량화 또는 하나의 세포 사멸의 정량화와 같은 추가 정량 분석을 수행할 수 있습니다. 물론, 종말점 분석을 위해 적절한 면역조직화학을 수행하거나 살아있는 맥락에서 효과를 보여주기 위해 특정 형질전환 동물을 사용해야 합니다.

analyzing-murine-schwann-cell-development-along-growing-axons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 stepwise 방식으로 표현하고자하는 일반적으로...

사용 Schwann - astrocyte 상호 작용 분석 체외에서 Assays

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

이 비디오는 등쪽 뿌리 신경절 이식과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 보여줍니다. 공동 배양 조건에서 아스코르브산은 슈반 세포가 수초화 형태로 분화되는 것을 촉진합니다. 슈반(Schwann) 세포는 축삭돌기를 여러 번 감싸 신경 기능에 필수적인 미엘린 수초(myelin sheath)를 만듭니다.

Neuron Myelination을 위한 Schwann Cells와 Dorsal Root Ganglion Explant의 공동 배양

우리는 유전자 조작 마우스 개발에서 감각 축삭 성장 표현형을 평가하는 효과적인 방법으로 전체 동물에서 말초 통각 수용기 축삭돌기 이미징을 위해 태아 마우스를 유전형, 염색 및 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

생화학적 분석과 결합된 광학 현미경 기술은 네트린 의존성 축삭돌기 분지화에서 SNARE 매개 외세포작용의 관여를 밝힙니다. 이러한 기술의 조합을 통해 축삭돌기 분지 및 세포 모양 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 식별할 수 있습니다.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

이 프로토콜은 랫트에서 분리된 등뿌리 신경절(DRG) 뉴런의 분리와 축삭 정렬을 향상시키기 위한 정적 사전 스트레치 세포 배양 시스템에서 DRG 뉴런의 배양을 설명하며, 이후 슈반 세포(SC)의 공동 배양은 수초화를 촉진합니다.

접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

ex vivo 슬라이스 분석은 oculomotor 신경 성장을 실시간으로 심상화할 수 있게 합니다. 슬라이스는 E10.5 IslMN:GFP 배아를 아가로오스에 포함시키고, 진동을 슬라이스하고, 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시킴으로써 생성됩니다. 축색 유도 경로의 역할은 배양 배지에 억제제추가에 의해 평가됩니다.

배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 성장하는 축삭을 따라 슈반 세포가 이동하는 과정을 관찰하는 방법을. 마우스 상경부 신경절을 콜라겐 매트릭스에 배양하고 NGF로 처리하여 시간 경과 이미징으로 정량적 분석을 수행합니다.

성장 Axons 함께 손쥐 Schwann 세포 개발 분석

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