성장 Axons 함께 손쥐 Schwann 세포 개발 분석

다음 실험의 목적은 자연 서식지인 성장하는 축삭돌기를 따라 슈완 세포의 발달을 분석하는 것입니다. 이것은 두 번째 단계로 첫 번째 ex explan superior cervical ganglia 또는 마우스 배아의 S cgs를 콜라겐 매트릭스에 의해 달성됩니다. S cgs는 신경 성장 인자 또는 NGF로 치료되며, 이는 관상 방식으로 SCG 뉴런의 축삭 성장을 촉진합니다.

X explan에서 축삭 성장 외에도 내인성 슈완 세포(endogenous schwan cell)가 확장된 축삭을 따라 주변부로 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다. 슈완 세포 발달은 타임 랩스 이미징과 고정 조직의 종말점 분석을 통해 분석할 수 있으며, 이를 통해 거리를 측정할 수 있습니다. 스크래치 이동 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 백조 세포의 자연 서식지가 이 분석에 포함된다는 것입니다.

이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 콜라겐 메트릭의 올바른 조립과 SGS의 올바른 해부가 성공의 열쇠이기 때문입니다. 이 단계는 배우기가 특별히 어렵지 않습니다.

그들은 먼저 연습이 필요합니다. 조직 배양에서 일하는 동안 후드는 얼음 위의 모든 솔루션으로 우리의 상태를 이해했습니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라 스톡 배양 배지와 쥐 꼬리 콜라겐을 준비합니다.

800 마이크로 리터의 쥐 꼬리 콜라겐과 210 마이크로 리터의 스톡 배지를 혼합합니다. 거품이 생기지 않으면 용액은 붉은 색으로 유지되어야 합니다. 용액이 노랗게 변하면 Ratal 콜라겐 용액이 너무 산성이므로 더 높은 농도의 수산화나트륨 피펫 100 마이크로 방출로 용액을 다중 웰 슬라이드의 각 웰로 다시 만들고 각 웰의 바닥이 완전히 덮여 있는지 확인해야 합니다.

접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 가습 조직 배양 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다. 수확 후 E 16 내지 E 18 배아를 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣은 다음 양막에서 해부하고 C 쇄골의 수평 코달에서 목을 베웁니다. 그런 다음 머리와 목 부위를 실리콘 바닥 접시로 옮기고 해부 현미경을 통해 보면서 곤충 바늘을 사용하여 턱밑과 쇄골 부위의 조직을 고정합니다.

이제 집게를 사용하여 턱밑 부위의 피부와 피하 조직을 제거합니다. 그런 다음 턱밑 타액선을 제거하여 설상근, 하치근 및 흉쇄유돌근을 드러냅니다. 다음으로, 겸자를 사용하여 하부골 및 흉쇄유돌근을 조심스럽게 제거하여 후두와 기관을 드러냅니다.

겸자로 기관을 잡고 기관과 후두를 들어 올립니다. 후두와 기관이 제거되면 경동맥이 보이고, 이는 추경 전 근육의 양쪽입니다. 상경추신경절(superior cervical ganglia)은 경동맥의 분기점에 위치하며 타원형으로 식별될 수 있습니다.

집게와 곤충 바늘이 장착된 바늘 홀더를 사용하여 상경부신경절을 제거하고 PBS가 들어 있는 새 접시에 넣은 다음 신경절에서 혈관이나 연결된 조직을 해부합니다. 주사기 바늘을 사용하여 인큐베이터에서 젤라틴화된 콜라겐 젤을 제거하고 주사기에 장착된 주사기 바늘을 사용하여 신경절을 젤로 전달합니다. 이산화탄소가 5%이고 습한 조건에서 섭씨 37도로 설정된 조직 배양 인큐베이터에 외식을 1-2시간 동안 놓습니다.

1-2시간의 배양 후, 조직 배양 인큐베이터에서 상경부 신경절 절개물을 채취하고 B 27 보충제 글루타민과 항생제를 함유한 100마이크로리터의 신경 기저 배지를 각 엑스플랜에 첨가합니다. 그 후, 200마이크로리터의 신경 기저 배지는 밀리리터당 60나노그램을 함유합니다. NGF는 또한 축삭 성장을 촉진하기 위해 우물에 추가됩니다.

이 시기에 시험 물질이 추가될 수도 있는데, 이는 이미 이동하기 시작한 백조 세포에 미치는 영향을 연구하기 위해 시험관 내 0일로 정의됩니다. 축삭 물질은 기존 배지 180 마이크로 리터를 제거하고 관심 물질과 NGF를 포함하는 배지 200 마이크로 리터로 교체하여 체외 3 일 만에 투여 할 수 있으며, 타임 랩스 이미징은 병렬 세포 배양 배양 및 타임 랩스 이미징을 가능하게하는 도립 현미경 설정을 사용하여 수행되어 다른 테스트 물질을 비교합니다. 한 실험에서는 실험의 끝점에서 다중 위치 설정이 권장됩니다.

배양 슬라이드에 4%PFA로 3-4시간 동안 고정하고 PBS로 세척한 후 면역조직화학을 수행하여 10%의 정상 당나귀 혈청과 2%의 트리톤 X 100이 함유된 PBS로 조직을 2시간 동안 차단하여 X 외식을 검증합니다. 그런 다음 밤새 차단 용액에서 1차 항체 배양을 수행합니다. 1차 항체 배양 후 다음날, PBS로 세척한 후 겔이 포함된 X 엑스플랜을 24웰 플레이트로 옮기고, 빛으로부터 보호된 상태에서 형광 표지된 2차 항체로 2시간 동안 배양한 다음, PBS로 세척하고 dappy 용액으로 10분 동안 배양합니다.

여러 번 세척한 후 X 엑스플란이 포함된 콜라겐 젤을 현미경에 놓고 슬라이드를 밀고 건조시킨 다음 송아지 고기로 장착합니다. 표준 형광 현미경을 사용하여 향후 정량 분석을 위한 이미지를 얻을 수 있습니다. 현미경 소프트웨어가 메타데이터를 기록할 수 있는 경우 유용합니다.

획득한 이미지의 정량 분석은 Fiji 또는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있으며, 이는 과학 응용 분야에 무료로 사용할 수 있습니다. 이 동영상에서는 4일 동안 시험관 내에서 도식적인 SCGX EXPLAN을 통한 축삭 성장을 보여줍니다. 면역조직화학검사는 이식된 신경절을 명확하게 확인하기 위해 4일째 되는 날에 시험관 내에서 시행할 수 있습니다.

교감신경절(sympathetic ganglion)로서, 슈완 세포(schwan cell)는 축삭돌기(axon)를 따라 상경추신경절(superior cervical ganglion)에서 주변부(periphery)로 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다. 이 비디오는 더 높은 배율에서 본 것과 동일한 마이그레이션 패턴을 보여줍니다. 회로도에 묘사된 바와 같이 여러 위치에서 선행 슈완 세포의 핵에서 이식된 SCG의 경계까지의 거리를 측정함으로써 DPI가 있는 핵에 대한 샘플의 이동 거리를 쉽게 측정할 수 있으며, 이 동영상은 SCG 설명의 경계에서 슈완 세포의 이동을 보여줍니다.

명시야와 형광의 결합을 통해 S 100 GFP 양성 백조 세포와 축삭돌기를 시각화할 수 있습니다. 마지막으로, 이 영화는 상경추 신경절(superior cervical ganglion ex explan)의 경계에서 슈완 세포(schwan cell)의 이동을 보여줍니다. 여기에는 형광 채널만 표시되어 S 100 GFP 양성 슈완 세포를 더 쉽게 해석할 수 있습니다.

이 절차에 따라 하나의 세포 증식의 정량화 또는 하나의 세포 사멸의 정량화와 같은 추가 정량 분석을 수행할 수 있습니다. 물론, 종말점 분석을 위해 적절한 면역조직화학을 수행하거나 살아있는 맥락에서 효과를 보여주기 위해 특정 형질전환 동물을 사용해야 합니다.