골격 근육의 Isometric 나기도하고 강제로 생성 평가는 절연 근육질 Dystrophies의 손쥐 모델에서

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐에서 분리된 골격근의 기계적 특성을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 동물의 신근 digitorum longus 또는 EDL 근육과 횡격막 근육을 해부하여 수행됩니다. 다이어프램 스트립을 준비한 후 산소가 공급된 링거 용액이 담긴 접시에 EDL과 다이어프램 스트립을 핀으로 고정한 다음 근육의 양쪽 끝에 봉합 루프를 묶습니다.

다음으로, EDL 또는 다이어프램 스트립은 한쪽 끝에서 힘 변환기 또는 레버에 부착된 두 전극 사이의 장기 수조에 고정되고 경련력에 따라 최적의 길이로 조정됩니다. 마지막 단계는 여러 기계적 프로토콜을 사용하여 근육을 자극하고 힘 생성을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 힘 생성, 손상에 대한 저항, 힘, 빈도 관계 및 기타 특성의 계산은 근육의 강도, 무결성 및 기타 특성, 그리고 해당되는 경우 치료 또는 유전자 변형의 효과를 표시하는 데 사용됩니다.

이 기술은 대부분의 치료법이 근력을 회복하고 근육 취약성을 줄이는 것을 목표로 하기 때문에 근이영양증에 대한 잠재적 치료법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 처음 사용한 것은 아니지만, 우리는 일상적으로 이 기술을 사용하여 다양한 마우스 모델을 연구하고 근육 기능을 평가하며 근이영양증에 대한 여러 치료법을 특성화하고 평가합니다. Catherine Morewood 박사 외에도 생리학적 평가 핵심인 Min Liu 박사와 연구 전문가인 Mr.Ian을 통해 이 절차를 시연할 것입니다.

이 절차에 사용된 마우스는 케타민과 자일라진을 사용하여 마취하여 통증이나 고통을 느끼지 않도록 하지만 근육은 순환에 의해 잘 산소가 공급된 상태로 유지됩니다. 발가락 꼬집음으로 동물이 충분히 마취되었는지 확인하고, 의료용 테이프를 사용하여 높은 팔다리를 고정하고, 아래 앞쪽 뒷다리의 피부를 제거하여 이 부위의 근육을 노출시킨 후, 일정한 간격으로 PBS를 적용하여 근육을 촉촉하게 유지합니다. 절제 범위에서 무릎 옆으로 작은 절개를 만들어 신근 digitorum longus 또는 EDL 근육의 근위 힘줄을 노출시킵니다.

이 부위에는 두 개의 힘줄이 있으며 내측 발목에서 EDL을 제거할 수 있도록 둘 다 절단해야 합니다. 경골 전방 또는 TA 근육의 힘줄을 잘라 중족골을 따라 뻗어 있는 EDL의 원위 힘줄을 노출시킵니다. TA 근육을 들어 올리십시오.

아래에 있는 EDL을 자르거나 만지지 않도록 주의합니다. EDL의 원위 힘줄로 돌아가서 하나하나 잘라냅니다. 다음으로, 힘줄을 잡고 EDL을 팔다리의 나머지 부분에서 부드럽게 당겨 빼냅니다.

근위부 끝에서 자유롭게 방출되어야 합니다. EDL 근육을 제거하고 식힌 산소 분유기로 채워진 해부 접시에 넣습니다. 힘줄을 통해 근육을 대략 휴식 길이로 고정하는데, 이는 생체 내에서 발견되는 길이입니다.

근육이 접시에 들어가면 길이가 너무 짧고 근육이 해부 핀을 당기면 길이가 너무 깁니다. 근육에 최대한 가깝게 힘줄에 봉합사를 묶되 근육에 닿지 않도록 합니다. 봉합사를 사용하여 대략 휴지 길이로 근육을 고정합니다.

이 절차를 시작합니다. 안락사된 동물의 피부를 절개합니다. 복부와 흉강을 노출시킵니다.

복강을 열고 뼈 가위를 사용하여 갈비뼈 바로 아래의 체벽을 자르고 횡격막 삽입 위부터 시작합니다. 갈비뼈 선을 따라 흉곽 전체를 자르고 척추를 자릅니다. 횡격막을 쉽게 제거할 수 있도록 횡격막 중앙을 통과하는 혈관을 절단합니다.

마우스에서 다이어프램을 제거하고 산소가 함유된 링거로 채워진 해부 접시에 넣습니다. 접시의 횡격막을 부드럽게 저어 피를 씻어냅니다. 필요에 따라 링거 용액을 새로 고칩니다.

다음으로, 측면 hemi 횡격막의 중앙 부분에 있는 섬유의 방향을 따라 중앙 힘줄에서 갈비뼈까지 횡격막의 작은 스트립을 자릅니다. 스트립의 너비는 2mm에서 4mm 사이여야 합니다. 봉합사를 중앙 힘줄에 묶고, 옆으로 튀어나온 갈비뼈 끝 각각에 봉합사를 묶은 다음, 뼈 가위를 사용하여 큰 고리를 만들기 위해 함께 묶습니다.

스트립의 양쪽에 있는 리브를 자르고 다이어프램 양쪽에 리브의 돌출부를 약 1-2mm 남겨둡니다. 고립된 골격근의 스트립 힘 생성 평가는 시험관 근육 테스트 시스템에 의해 수행되어 정비사의 욕조에 근육을 장착하고 봉합사를 잡고 이를 사용하여 근육을 한쪽 끝의 단단한 기둥과 다른 쪽 끝의 힘 변환기에 부착합니다. 좋은 근사치는 휴지 근육 길이입니다.

앞에서 볼 수 있듯이 수조는 섭씨 22도로 유지되는 산소화된 링거 용액으로 채워져 있습니다. 근육 안정성을 연장하기 위해 근육 테스트를 위해 근육 기능을 테스트하기 전에 이 욕조에서 5분 동안 휴식을 취해야 하며, 이를 통해 근육 온도가 섭씨 22도로 유지되어 최상의 최대 자극 조건을 설정해야 합니다. 근육을 욕조에 넣은 후 0.5밀리초 자극 펄스를 한 번 사용하여 경련을 일으키고 힘 출력을 모니터링합니다.

힘이 최대이지만 일정한 수준에 도달할 때까지 점차적으로 전류를 증가시키고, 최적의 길이를 설정하기 위해 나머지 실험을 위해 이 수준보다 10% 더 많은 전류를 증가시키고, 먼저 근육이 느슨하지 않은지 확인하되 가르치지도 않습니다. 좋은 근사치는 앞에서 보여준 것처럼 휴지 근육 길이입니다. 등척성 경련 자극을 사용하여 최대한의 힘이 얻어질 때까지 근육의 길이를 점차적으로 조정합니다.

각 수축 사이에 약 10초 동안 근육을 쉬게 합니다. 최적의 근육 길이는 트위치 힘이 버니어 캘리퍼스를 사용하여 근육 길이를 최대 기록할 때 달성됩니다. EDL의 경우 근 건초 접합부 사이의 길이입니다.

횡격막의 경우, 중심 힘줄 근 건초 접합부와 갈비뼈에 대한 근육 삽입 사이의 길이입니다. 최대 등척성 타이타닉 힘을 결정하기 위해 초 최대 자극 및 융합 주파수에서 일련의 0.5 밀리 초 펄스로 500 밀리 초 동안 최적의 근육 길이로 설정된 근육을 자극합니다. EDL 근육의 정체기는 일반적으로 120Hz로, 횡격막 근육의 경우 100Hz로 각 주파수를 3회 자극하며, 5분 휴식 후 모든 근육에 대해 5분의 휴식 시간을 갖습니다.

등척성 수축을 수행한 후 편심 수축 절차를 시작합니다. 초기 500밀리초 동안 등척성으로 80헤르츠에서 근육을 자극한 다음 마지막 200밀리초 자극에서 10%의 최적 근육 길이 스트레칭을 합니다. 중간에 5분간 휴식을 취하면서 자극 패턴을 반복합니다.

원하는 편심 수축 횟수를 얻으려면 스트레칭 이전 기간 동안 각 수축에 대한 힘을 측정합니다. 기능 테스트 완료 시 첫 번째 수축과 마지막 수축 사이의 힘 강하를 계산합니다. 근육 길이를 줄이고 변환기와 포스트에서 근육을 부드럽게 제거합니다.

링거로 근육을 해부 접시에 다시 넣습니다. EDL 근육을 위해 근육에서 봉합사를 제거합니다. 근육을 두 번 차단한 다음 후속 처리 전에 무게를 잰다.

이것은 횡격막 근육이 0.1%pros와 오렌지색, 멤브레인 및 투과 염료에 15-20분 동안 담가두는 단면적과 비힘을 계산하는 데 중요합니다. 이것은 박리 손상의 지표를 제공하고 횡격막 근육을 뼈 삽입부와 중앙 힘줄에서 멀리 해부합니다. 이는 무게를 측정하고 후속 준비를 하기 전에 근육 블롯의 정확한 무게를 제공하는 데 필요합니다.

단면적 또는 CSA는 다음 공식을 사용하여 계산되며, 여기서 LO에 대한 L은 섬유 대 근육 길이 비율이고 1.06은 야생형 C 57 및 12주 된 동물의 근이영양증 또는 M-D-X-E-D-L 근육의 등척성 힘에 대한 근육 기대 값의 밀도입니다. MDX 근육은 보상적 비대를 나타내기 때문에 MDX 근육에서 타이타닉 포스에 대한 총계는 연령에 맞는 야생형 대조군에 비해 더 높을 수 있습니다. 기능적 출력의 보다 적절한 측정은 힘이 단면적에 대해 정규화되는 비힘입니다.

이 값을 계산하기 위해 특정 힘은 근육의 고유한 기능적 능력에 따라 달라지며, 이영양성 근육의 약점은 절대 힘과 단면적을 모두 고려할 때 더 분명합니다. 이 연구에서 MDX 마우스의 EDL 근육은 생후 10주에서 26주 사이의 연령과 일치하는 야생형 마우스보다 약 20-25% 낮은 비력을 생성하는 것으로 관찰되었습니다. 횡격막의 경우, 제제는 해부에 의존하는 근육의 일부이기 때문에 비교에 특정한 힘만 관련됩니다.

파란색 선으로 표시된 C 57 야생형 근육과 빨간색 막대로 표시된 MDX 횡격막 근육 사이의 특정 힘을 비교한 것은 이 조직의 진행성 병리학을 반영합니다. 등척성 힘 출력은 나이가 들면서 감소하여 생후 6개월이 되면 MDX 마우스의 횡격막 근육이 연령에 맞는 야생형 대조군에서 횡격막 스트립의 기능적 출력의 절반 이상을 생성하지 않습니다. 다이어프램 테스트로 인한 편심 수축의 예가 이 그림에 나와 있습니다.

각각의 후속 편심 수축력으로 인해 파란색으로 표시된 야생형 C 57 마우스와 빨간색으로 표시된 MDX 마우스의 다이어프램 스트립에서 출력이 감소합니다. 그러나, 힘의 손실은 MDX 쥐의 근육 샘플에서 더 극적이며, 아마도 디스트로핀 및 관련 단백질이 없기 때문일 것입니다. 이 기술은 이 기술에 따라 적절하게 수행되면 단일 근육에 대해 약 1시간 안에 수행할 수 있습니다.

웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 기타 생화학적 측정과 같은 다른 방법을 사용하여 치료가 단백질 수준을 변경했는지 또는 근육 무결성을 정상화했는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 EDL과 다이어프램을 해부하는 방법과 편심 수축 전후의 힘 생성을 측정하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.