Name: 골격 근육의 Isometric 나기도하고 강제로 생성 평가는 절연 근육질 Dystrophies의 손쥐 모델에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 배우세요 생쥐 골격근의 등장성 및 이심성 수축을 통한 기능 평가 방법입니다. 이 기법은 근육 영양 장애 치료제 효능을 평가하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 폴 D. Wellstone 협동 연구 센터 (AR052646)에 의해 지원되었다.

모든 절차는 펜실베니아 IACUC 대학에 의해 검토 및 승인되었습니다. 1. 편집 판단리스트 해부 및 준비 (약 30 분) <ol><li> 그 절차 기간 동안 통증이나 고통을 경험하지 않도록하기 위해 마우스를 마취 만 잘 순환하여 근육 유지 산소. 우리는 정기적으로 IP를 통해 주입 케타민 / xylazine 칵테일 (10분의 100 밀리그램 / kg)을 사용합니다. 마취의 수술 비행기가 페달 또는 palpedral 탈퇴 반사, 또는 귀 트 응답의 부족의 완전한 부재에 의해 결정됩니다. </li><li> 의료 테이프를 사용하여 hindlimbs을 고정,이 지역의 근육을 노출 할 수있는 낮은 앞 hindlimb의 피부를 제거합니다. 정기적으로 PBS의 응용 프로그램과 함께 근육이 촉촉하세요. </li><li> 박리 범위에서 편집 판단리스트 근육의 근위 힘줄을 노출하기 위해 무릎에 옆 작은 절개를합니다. 가이 지역에 두 개의 힘줄이 있는데, 모두 재를 사용하도록 절단해야편집 판단리스트의 moval. </li><li> 안쪽 발목에서 메타 tarsals 따라 연장 편집 판단리스트의 말초 힘줄을 노출 TA 근육의 힘줄을 잘라. 편집 판단리스트 아래에를 잘라내거나 만지지 않도록주의하는 것 방법 TA 근육을 들어 봐요. , 편집 판단리스트의 말초 힘줄로 돌아 가기 싹둑 각각 다음 힘줄을 쥐었고, 발목을 통해 그려, 부드럽게 다리의 나머지 부분에서 떨어져 편집 판단리스트를 당깁니다. 그것은 자유롭게 근위 끝에서 출시하지만,하지 않을 경우, 힘줄이 절단되도록 옆 절개로 돌아합니다. 차가운 산소를 Ringers로 가득 해부 접시에있는 근육과 장소를 제거합니다. 생체에서 발견 된 길이는 약 휴식 길이의 힘줄을 통해 근육을 핀. 근육이 해부 핀을 당기는 경우 길이는 근육이 접시에 이완 할 때 너무 짧습니다, 그리고 너무 깁니다. </li><li> 자궁 경부 전위에 의한 근육 제거 후 즉시 마우스를 안락사시켜야. </li><li> 10에 봉합을 묶을가까이 가능한 한 근육에, 그러나 근육을 터치하지 dons. 봉합을 사용하여 약 휴식 기간에 근육을 핀. </li></ol> 2. 격막 해부 및 준비 (약 30 분) <ol><li> 같은 마우스가 모두 dissections를 받게되는 경우, 마취하에 자궁 경부 전위에 의해 이전 절차에 마우스를 안락사시켜야하거나, CO 2에 의해 자궁 경부의 전위와 확인이 나타납니다. </li><li> 복부와 가슴 캐비티를 노출하기 위해 피부에 절개를합니다. 복강을 열고 그냥 갈비뼈 아래 몸을 벽에 상처를 냈어. 뼈 가위를 사용하고, 척추를 통해 격막 립 라인에 따라 전체 흉곽 주위에 잘라내 삽입, 그리고 컷 위에 시작합니다. 가로막 쉽게 제거 할 수 있도록 격막의 중심을 실행하는 혈관을 자른다. </li><li> 마우스에서 격막 및 산소를 Ringers로 가득 해부 접시에 장소를 제거합니다. 부드럽게 diap을 선동피를 씻어 할 수있는 요리에 hragm. 필요에 따라 새로 고침 솔루션을 Ringers. </li><li> 측면 hemidiaphragms의 중앙 부분에있는 섬유의 방향을 따라 중앙 힘줄에서 갈비뼈에 격막의 작은 스트립을 잘라. 스트립 폭 2~4mm 사이 여야합니다. 뼈 가위 사용하여 격막 스트립의 양쪽에 갈비뼈의 약 1~2mm의 오버행을두고, 스트립의 양쪽에 갈비뼈를 잘라. </li><li> 중앙 힘줄에 봉합을 묶어주세요. 옆으로 돌출 리브 엔드 각각 봉합을 묶어하고 큰 루프를 만들기 위해 함께 이것들을 묶어. </li><li> 두 스트립은 특정 다이어프램 (각 측면에서 하나)에서 얻을 수있다. </li></ol> 3. 기계 욕조에 장착 근육 <ol><li> 봉합을 잡고 한쪽 끝에서 강성 게시물에 근육을 첨부하려면 다음을 사용하고 다른 끝에서 힘 변환기에. </li><li> 근육이 이완 아니라, 긴장되지 않는지 확인의 길이를 조정합니다. 좋은 근사값은 휴식 musc입니다1.4에서와 같이 르 길이 - 1.5. </li><li> 목욕은 ° C 테스트에 대한 근육의 안정성을 연장 22에서 유지 산소를 Ringers 솔루션으로 가득해야합니다. 근육 온도 22 ° C.에 equilibrated하도록 근육 전에 기능 테스트이 욕조에서 5 분 휴식을 취한다 </li></ol> 4. Isometric 진통 <ol><li> Supramaximal 자극 조건을 설정합니다. 근육이 목욕탕에 배치 한 후 트를 생성하는 단일 0.5 밀리 초를 자극 펄스를 사용하며, 강제 출력을 모니터링 할 수 있습니다. 힘이 최대하지만 꾸준한 수준을 달성 할 때까지 점차적으로 현재 높일 수 있습니다. 나머지 실험이 수준보다 10 % 더 많은 전류 높입니다. </li><li> 최적의 길이를 설정합니다. 최대 힘을​​ 얻을 때까지 isometric 트의 stimulations를 사용하여 서서히 근육의 길이를 조정합니다. 각 수축 사이의 근육에게 ~ 10 초를 놓습니다. 트 팀은 최대 일 때 최적 근육의 길이 (L O)이 달성된다. 기록 근육 길이 (길이가 수십대 초반은 myotendinous 편집 판단리스트에 접합하고, 중앙 힘줄이 myotendinous 접합 및 버니어 캘리퍼스를 사용하여 늑골에 근육 삽입) 사이에 있습니다. </li><li> 최대 Isometric 파상풍의 힘. supramaximal 자극에서 0.5 밀리 초 펄스의 일련와 퓨전 주파수 (주파수 힘의 관계 (예 : 심판의 고원에서의 500 밀리 초 기간 동안 L O로 설정 근육을 자극 :. 8) 편집 판단리스트 근육의 대지는 일반적으로 120 Hz에서와, 100 Hz에서와 격막 근육에 달성했습니다. 모든 근육에 대한 자극을 관찰 사이의 5 분의 휴식 시간과 각각의 주파수에서 3 번을 자극한다. </li></ol> 5. 편심 진통 <ol><li> 근육이 isometric 및 편심 수축을 수행하는 사이 5 분 휴식 할 수 있습니다. </li><li> 최종 200 밀리 초를 자극에서 10 %의 L O 스트레치 (0.5 L O의 신축성 속도에 이어 최초의 500 밀리 초에 대한 isometrically 80 Hz에서 근육을 자극/ 초)입니다. </li><li> 편심 수축의 원하는 번호 사이에 5 분 쉼표로 자극 패턴을 반복합니다. </li><li> 스트레치 이전 기간의 각 수축에 힘을 측정합니다. 처음이자 마지막 수축 사이의 힘의 드롭을 계산합니다. </li></ol> 6. 장치에서 근육 제거 <ol><li> 변환기에서 근육의 부드러운 제거 할 수 있도록하고 게시하고 Ringers과 해부 접시에 돌아갑니다 근육 길이를 단축. </li><li> 근육에서 봉합을 제거합니다. </li><li> 편집 판단리스트 근육을 보려면 다음 (예 : 냉동, 고정 등) 이후에 처리하기 전에, 그것을 무게, 두 번 근육을 되리. 이것은 단면적, 그리고 특정 힘을 계산하는 것이 중요합니다. </li><li> 격막 근육의 경우 0.1 % procion 오렌지, 15-20 분을위한 멤브레인 impermeant의 염료에 몸을 담그고. 이 해부 손상의 색인을 제공 할 것입니다. </li><li> 거리에 뼈 삽입의 근육을 해부뿐만 아니라 센트역 학 힘줄. 이 근육의 정확한 무게를 제공 할 필요가 있습니다. 무게 및 이후 준비하기 전에 위의 점이 되리. </li><li> 단면적 (CSA)을 건너 계산 : CSA (mm 2) = 질량 (MG) ​​/ [(L O mm) * (L / L O) * (1.06 밀리그램 / mm 3)], L / L O는 섬유입니다 근육의 길이 비율 (편집 판단리스트에 0.45, 가로막을위한 1.0)에 5 1.06 근육의 밀도입니다. </li></ol>

<ol><li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TREAT-NMD%22%5BJournal%5D)">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li>
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<li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young%2C+adult+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li>
<li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li>
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</ol>

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편집 판단리스트와 격막 -이 문서의 목적은 쥐에서 두 개의 근육에 격리 된 근육 기능을 수행하기위한 지침을 제공하는 것입니다. 이러한 근육의 평가는 근육 질환에 대한 치료 후보가 도움 여부에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 두 근육의 경우 강력한 데이터를 취득의 주요 요소는 깨끗한 절개입니다. 따라서 연습하고 초기 절연 단계를 완성하면 기능 테스트에 이동하기 전에 필수적입니다. 또한, 일반 근육에 대한 기능 벤치 마크를 설정하면 이전 dystrophic 근육에 비교하는, 또는 트리트먼트를 사이에 중요합니다. 이 연구 결과는 실험을 수행하는 사람의 능력에 의해 이수 높은 다양성의 대상이 아니라는 것을 보장합니다. 막 impermeant의 염료의 사용은 염료는 대부분 손상된 섬유를 표시합니다 포함 된 솔루션의 모든 근육의 부화를 들어, 분해 준비를 최적화에 도움이 수 있으며, D의 인덱스로 제공 할 수issection 성공. 근육에 손상 섬유의 수를 최소화하면 측정을 최적화하는 데 도움이 될 것입니다. 해부에 의해 손상 섬유는 편심 수축에 의해 손상보다 훨씬 더 밝게을 형광 및 염색도 기계 과정에서 사용하는면, 하나는 손상의 두 가지 유형을 구별하기 염색의 강도를 사용할 수 있습니다. 격막 스트립의 해부는 거의 항상 섬유의 길이를 따라 절단하여 일부 불가피하게 파괴하게하기 때문에, 섬유 손상을 갖게됩니다. 염료 이해는 그 손상된 섬유에 강한이며, 이러한은 일반적으로 준비의 바깥 가장자리으로 제한됩니다. 평균적으로, 우리는 근육 스트립​​의 양쪽에 폭 ~ 3 섬유 (~ 120 μm)입니다 손상된 섬유의 밴드를 관찰합니다. 손상된 밴드 근육의 15 % 이상을 포함하는 경우, 데이터가 삭제됩니다. 다이어프램 준비는 기능 측정을위한 최적의 크기에 제약이 있습니다. 우리는 발견 한 그 D 조각중앙 힘줄이 넥타이가 한 지점에 불과하기 때문에 5mm보다 폭 아르 iaphragm은 자신에 접어 시작합니다. 에있는이 결과는 준비에서 특정 힘을 감소. 우리는 또한 절개하는 동안 손상 섬유의 숫자가 전체 섬유 번호의 큰 비율을 구성하기 때문에 좁은 스트립은 또한 우리가 믿고 낮은 특정 힘을 가지고 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 각면에 0.1 mm가 손상되면, 그건 강제로 기여하지 않는 근육 준비의 5 % (2x0.1 mm / 4 밀리미터 스트립)입니다 반면 스트립는 단 1mm, 20 인 경우 근육 준비 %가 손상되었습니다. 따라서, 손상된 영역의 폭뿐만 아니라 전체 준비의 폭을 모두 제어 할 중요한 요소입니다. 최대 isometric 긴장 측정은 근육의 모든 근육 섬유가 자극해야합니다. 함수 장치의 구성 요소에 엄청난 변화가 있기 때문에, 이것은 각 세트에 대해 결정되어야한다까지. 예를 들어, 욕조 크기 또는 stimulator의 유형은 자극의 강도에 영향을 미칠 수 있습니다. 트의 자극은 supramaximal 자극 조건을 결정하는 합리적인 방법입니다. 이것은 특정 설치 및 근육에 설립되면, 후속 연구에 활용 될 수있다. 반면, 특정 근육의 최적 길이는 위에서 설명한 반복 프로세스를 사용하여 각 준비를 위해 측정해야합니다. 이것은 두께 얇은 필라멘트 중복 최적이고 최대 잠재적 인 힘을 창출 능력이 측정됩니다 보장합니다. 다른 절차는 근육 강선과 관련된 회절 패턴에 의존 할 수 있지만이 여기에 설명되지 않은 추가 장비가 필요합니다. 우리는 정기적으로이 분야의 다른 조사에 의해 사용이 매개 변수의 중간 범위에 속하는 500 밀리 초를 자극 기간을 사용합니다. 이 자궁이 수축하는 동안 근육의 일부 피로가 발생할 수 있지만, 이는 분명하다최대 힘 생산에 &quot;처지&quot;로, 그 자체가이 정보를 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 피로의 차이는 따라서 활성 자궁이 수축하는 동안 힘의 처지가 개선을위한 인덱스로 제공 할 수있는 그 대상 칼슘 처리를 포함한 요법의 다른 유형에 의해 달성 될 수있다. 또는 힘의 손실이 힘줄에 봉합이 충분히 빡빡하지 나타냅니다, 그리고 그들이 자궁이 수축하는 동안 미끄러지는 것을 수 있습니다. 근육은 목욕탕에서 제거해야하며이 경우 봉합이 다시 묶여해야합니다. 우리는 또한 준비의 안정성을 평가하는 데 도움이 3 파상풍의 수축, 일련의를 사용합니다. 다시 봉합 용지는 다시 봉합을 필요로 묶는, 수축 사이의 힘의 손실로 이어질 것입니다. 대형 근육은 또한 프로토콜 중 힘의 손실로 이어질있는 anoxic 코어를 생성 할 수 있습니다. 근육 크기가 분리 된 근육 기능 테스트를 수행하기위한 제한 요소입니다, 어디서 20 밀리그램보다 더 큰 질량과 편집 판단리스트 근육은 각 contrac과 힘을 잃게기, 욕조에 superfusion에서 지원 할 수 없습니다. 사람들이 목욕탕에서 장시간 생존을 할 수있을만큼 얇은 때문에 격막 스트립 같은 합병증으로 고통하지 않습니다. 다른 근육은 일반적으로 사용되는 soleus 근육을 포함한 절연 근육 기능에 대한 활용하지만, 여기에 설명 된 수는 없습니다. 동일한 절차의 많은 준비와 기능 테스트의 측면에서 soleus을 위해 채택 할 수 있습니다. 그러나, 주된 차이점은 자극 주파수에 있으며, 편심 수축에 대한 매개 변수입니다. 함수의 soleus를 사용 다른 두 근육의 것을을 보완, 그래서는 dystrophic 마우스에게 7 4 평가 &quot;표준 패키지&quot;의 일부로 간주해야합니다. 편심 수축은 수축 취약성의 색인을 제공하며,이 프로토콜을 사용하는 것이 중요합니다 그 wildtype 동물의 근육에 힘 겸손한 손실 및에 힘 상당한 손실 결과치료 dystrophic 근육 비교에 대한 다양한 동적 범위가되도록. 정상적인 근육에 힘 손실의 부족은 편심 수축이 너무 온화 것을 제안하고, 효과적이지 않을 테라피와 진정으로 도움이되어있는 사이에 구별하기에 충분한 수 없습니다. 그러나, 편심 수축을 받게 일반 근육의 힘 극적인 손실이 질병과 관련된 차이를 올리지 너무 큰 수 있습니다. 편집 판단리스트와 격막에 대한 프로토콜은 10 %의 길이 변화를 생산하기 위해 0.5 소호 / 초 신축성 속도를 사용합니다. 우리는 일반적으로 5 편심 수축, 정상적인 근육의 힘의 작은 손실 및 dystrophic 근육의 힘의 상당한 손실 결과를 수행합니다. 물론, 이러한 매개 변수 중 모든 병에 걸린하고 건강한 근육 사이의 차이뿐만 아니라, 돌연변이의 특정 유형의 영향에를 구별하기 위해 전체 길이의 변화, 신장의 속도, 또는 편심 수축의 수를 늘리기 위해 다양 할 수 있습니다 또는 treatment 하나는 공부하고 있습니다. 그 동안 정상과 병에 걸린 근육 사이에 현저한 차이가 있으므로 다음 트리트먼트 측면에서에 접근 할 수있는 황금 표준이 있습니다. 요약이 프로토콜은 isometric 및 편심 수축을 수행하기위한 지침을 수립하고, 운이 좋다면 당신 실험실에서이 기법을 설정할 때 방지하기 위해 잠재적 인 함정을 식별합니다.

근육 기능 측정은 근육 병리학뿐만 아니라이 조직의 생리를 근간 메커니즘의 결정에 대한 잠재적 인 치료의 평가에 기여합니다. 근육 질환의 경우, 마우스 모델의 사용은 잠재적 인 치료학의 설계 및 테스트에 그 지식을 확장하는 유전자형과 표현형 사이의 링크를 이해하는 중앙 구성 요소가 있습니다. 근육 dystrophies는 특히,이 에이전트를 평가하고 환자의 시련으로 이동하는 데 필요한 사전 임상 데이터를 설정하는 마우스에 의존하고 있습니다. 자주 결과 측정은 연구의 다양한 적용됩니다 강도를 측정하기 위해 절연 근육 기능을 사용합니다. 또 다른 조치가 편심, 또는 길이를 사용하는 것입니다, 수축이 Duchenne 근육질 영양 장애에 결함이 근육 막 무결성의 변화,이 질환 (MDX)의 마우스 모델을 결정합니다. 따라서 measurem 이러한 유형의에 필수적입니다엔트 민감하고 재현 할 수 있습니다. 마우스 신근 digitorum longus의 (편집 판단리스트) 근육이 균일 한 섬유 방향 및 최종 힘줄 2, 5, 6, 10, 12를 포함한 이상적인 형상과 크기로 인해 절연 근육 기능에 광범위하게 사용되었습니다. 편집 판단리스트 근육 isometric 기능 측정 방법은 치료 - NMD SOP 1 이전 주피터 간행물 8,뿐만 아니라에 설명되어 있습니다. 우리는 isometric와 편심 수축을 모두 포함하려면 다음 방법의 설명을 연장했다. 질병의 특징은 변성 / 재생 및 감소 힘 출력 heighted 사이클을 포함, 편집 판단리스트에 분명합니다. 마우스 다이어프램은 마우스 11의 다른 근육에 비해 근육 영양 장애의 가장 빠른 병적 진행을 전시하고 있습니다. 생후 6 개월 누적 섬유증은 근육의 약 50 %로 구성되어 있습니다. 크게 impaire이 결과D 강제로 출력 11. 따라서, fibrotic 침투를 방지 할 수 있습니다 치료 요원의 입장에서 효율적으로 평가 될 수있다. 근육의 dystrophin의 손실은 모든 근육이 9 증가 취약성과 상승 수축성 피해로 연결됩니다. Duchenne 근육질 영양 장애에 대한 따라서 많은 치료는 dystrophin 교체를 위해 준비되어 있습니다. 따라서 이러한 전략을 평가하는 중요한되고있다 분석 할뿐만 아니라 수축성 손상 2, 3, 4에서 dystrophic 근육을 보호하기위한 특정 전략을 한 혜택을할지 결정으로, 정상 및 dystrophic 근육을 구별 할 수 편심 수축,이 12. 이 절차는 / 레코드 길이와 힘, 또는 힘 변환기에서 빠르게 별도의 길이를 조정하는 방법을 조절 할 수 있습니다 중 듀얼 모드 서보 모터가 필요합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 체외 근육 테스트 시스템에서 </td><td> 오로라 과학 </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> 현미경을 해부 </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE 광원 </td><td> SCHOTT-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> 해부 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> 각진 해부 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> 메스 핸들 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 10003-12 </td><td> 대체 해부 도구 </td></tr><tr><td> 구부러진 메스 블레이드 # 12 </td><td> 정밀 과학도구 </td><td> 10012-00 </td><td> 대체 해부 도구 </td></tr><tr><td> 뼈 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T 봉합 매는 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 SS 포셉 - 각진 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> 합 사형 실크 봉합 크기 6-0 </td><td> Teleflex 의료 </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> 의료 테이프 </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> 케타민 염산염 100 MG / ML </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> 최종 투여 량은 80 밀리그램 / kg이다 </td></tr><tr><td> TranquiVed 사출 (xylazine 100 MG / ML) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> 최종 투여 량은 10 밀리그램 / kg이다 </td></tr><tr><td> 대응 오렌지 14 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> 솔루션 구성 요소를 Ringers </td><td></td><td></td><td> 솔루션는 95 % O 2 5 % CO 2, 최종 pH를 7.4로 equilibrated 가스입니다 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S7653 </td><td> 최종 농도 : 118 MM </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P217-3 </td><td> 최종 농도 : 4.7 MM </td></tr><tr><td> 칼슘 염화물 이수화 </td><td> 피셔 과학 </td><td> C79-500 </td><td> 최종 농도 : 2.5 MM </td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기의 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P-285 </td><td> 최종 농도 : 1.2 MM </td></tr><tr><td> 황산 마그네슘 </td><td> JT 베이커 </td><td> 2500-01 </td><td> 최종 농도 : 0.57 MM </td></tr><tr><td> 4 - (2 - 히드 록시 에틸) 파이프razine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP310-500 </td><td> 최종 농도 : 5.95 g ​​/ L </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G8270 </td><td> 최종 농도 : 5.5 MM </td></tr></tbody></table>

골격 근육의 isometric 나기도하고 강제로 생성 평가는 절연 근육질 dystrophies의 손쥐 모델에서

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

근육 질환에 대한 잠재적 치료학의 평가에 중요한 근육 기능의 민감하고 재현 생리적 평가입니다. 많은 사전 임상 실험이 질환 마우스 모델에 의존하기 때문에, 절연 근육 기능은 환자에 앞으로 약물 후보를 이동에서 이동 / NoGo 결정을위한 기준의 하나가되었습니다. 우리는이 연구에 활용 지배적 인 근육 아르 기능 테스트를위한 신근 digitorum longus의 (편집 판단리스트)과 격막 근육의 준비를 보여줍니다. 편집 판단리스트 근육 구조는 두 쉽게 접근 할 수 힘줄 및 욕조에서 superfusion에서 지원 할 수있는 작은 크기로, 분리 된 근육 준비에 이상적입니다. 다이어프램은 dystrophic 동물에 깊은 진보적 인 병리학을 전시하고, 섬유증을 countering 많은 잠재적 인 치료를 평가하고, myofiber의 안정성을 홍보하기위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. isometric와 eccen 등의 일상적인 테스트 프로토콜,tric 수축이 표시됩니다. Isometric 힘은 힘의 평가를 제공하며, 편심 수축이 근육 dystrophies 많은 종류의에서 중단되어 sarcolemma의 안정성을 평가하는 데 도움이됩니다. wildtype 및 dystrophic 근육에서 근육 사이의 예상 결과의 비교도 제공됩니다. 이러한 조치는 조직 항상성의 형태학 및 생화학 측정뿐만 아니라, 근육 기능의 전체 동물 평가를 보완 할 수 있습니다.

12주 오래된 동물 편집 판단리스트 근육의 isometric 세력에 대한 예상 값은 그림 1에 표시됩니다. MDX 근육 보상 비대를 전시하기 때문에, 총 파상풍의 힘은 나이와 일치하는 wildtype 컨트롤을 비교하여 MDX 근육의 상위가 될 수 있습니다. 그러나, 기능 출력의 더 적절한 조치는 힘이이 값을 계산 단면적에 대한 표준화되어 특정 힘 (그림 2)입니다. 특정 힘은 절대 힘과 단면적이 모두 차지 때 dystrophic 근육의 약점에 더 명백 근육의 고유 기능 용량에 따라 달라집니다. 손에서 MDX 마우스에서 편집 판단리스트 근육은 약 20를 생성 - 연령 26 주 - 10 일부터 wildtype 쥐를 일치 시대의 사람들보다 25 % 낮은 특정 힘을. 준비가 아까 그 바 말인데, 의존 근육의 한 부분이기 때문에 가로막를 들어, 특정 힘이 비교 관련ction. wildtype 및 MDX의 격막 근육 사이의 특정 힘의 비교는이 조직의 진보적 인 병리를 반영합니다. Isometric 강제 출력은 생후 6 개월, MDX 마우스의 격막 근육이 더 이상 연령 일치 wildtype 컨트롤을에서 격막 스트립의 기능 출력의 절반 이상을 생산하지 않도록, 나이 (그림 3)와 감소. 다이어프램 테스트에서 편심 수축의 예는 그림 4에 표시됩니다. 이후의 각 편심 수축을 통해 강제 출력 wildtype (C57) 및 MDX 마우스 모두에서 격막 스트립에 감소. 그러나, 힘의 손실이 dystrophin과 관련된 단백질의 부재에서 추측 컨데, MDX 마우스의 근육 샘플에 더 극적인입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> 그림 1. wildtype 및 MDX 편집 판단리스트 근육 F 조에서 Isometric 파상풍의 힘<html> ROM 12주 오래된 마우스. 절대 힘이 보상 비대로 인해 나이와 일치하는 MD​​X 편집 판단리스트 근육의 상위가 될 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> 근육 단면적에 의해 표준화 그림 2. Isometric 파상풍의 힘은 특정 힘이며, wildtype 마우스의 그에 비해 MDX 마우스에서 편집 판단리스트 근육의 우울 기능 용량을 드러내고있다. 흔적은 그림 1에서와 같이 동일한 쥐에서 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> 그림 3. 특정 힘에 의해 평가 힘 생성 능력의 진보적 인 손실은 (파란색 줄에 C57) wildtype에 비해 MDX 마우스 (적색 바)의 입장에서 가장 명백합니다. 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. 12 세 주 C57 및 MDX 마우스의 격막 근육을위한 편심 수축 번호의 함수로 힘의 손실. 데이터는 뜻 이죠 ± 유전자형 당 N에 대한 SEM은 = 4 근육.

근육 기능 측정은 근육 병리에 대한 잠재적 인 치료학의 평가뿐만 아니라,이 조직의 생리를 근간 메커니즘의 결정에에 기여합니다. 우리는 기능 테스트를위한 신근 digitorum longus의와 격막 근육의 준비를 보여줍니다. isometric 및 편심 수축을위한 프로토콜은 병적 인 상태를 나타내는 dystrophic 근육 사이에 결과의 차이, 그리고 wildtype 근육뿐만 아니라 표시됩니다.

골격 근육의 Isometric 나기도하고 강제로 생성 평가는 절연 근육질 Dystrophies의 손쥐 모델에서

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐에서 분리된 골격근의 기계적 특성을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 동물의 신근 digitorum longus 또는 EDL 근육과 횡격막 근육을 해부하여 수행됩니다. 다이어프램 스트립을 준비한 후 산소가 공급된 링거 용액이 담긴 접시에 EDL과 다이어프램 스트립을 핀으로 고정한 다음 근육의 양쪽 끝에 봉합 루프를 묶습니다.다음으로, EDL 또는 다이어프램 스트립은 한쪽 끝에서 힘 변환기 또는 레버에 부착된 두 전극 사이의 장기 수조에 고정되고 경련력에 따라 최적의 길이로 조정됩니다. 마지막 단계는 여러 기계적 프로토콜을 사용하여 근육을 자극하고 힘 생성을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 힘 생성, 손상에 대한 저항, 힘, 빈도 관계 및 기타 특성의 계산은 근육의 강도, 무결성 및 기타 특성, 그리고 해당되는 경우 치료 또는 유전자 변형의 효과를 표시하는 데 사용됩니다.이 기술은 대부분의 치료법이 근력을 회복하고 근육 취약성을 줄이는 것을 목표로 하기 때문에 근이영양증에 대한 잠재적 치료법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 처음 사용한 것은 아니지만, 우리는 일상적으로 이 기술을 사용하여 다양한 마우스 모델을 연구하고 근육 기능을 평가하며 근이영양증에 대한 여러 치료법을 특성화하고 평가합니다. Catherine Morewood 박사 외에도 생리학적 평가 핵심인 Min Liu 박사와 연구 전문가인 Mr.Ian을 통해 이 절차를 시연할 것입니다.이 절차에 사용된 마우스는 케타민과 자일라진을 사용하여 마취하여 통증이나 고통을 느끼지 않도록 하지만 근육은 순환에 의해 잘 산소가 공급된 상태로 유지됩니다. 발가락 꼬집음으로 동물이 충분히 마취되었는지 확인하고, 의료용 테이프를 사용하여 높은 팔다리를 고정하고, 아래 앞쪽 뒷다리의 피부를 제거하여 이 부위의 근육을 노출시킨 후, 일정한 간격으로 PBS를 적용하여 근육을 촉촉하게 유지합니다. 절제 범위에서 무릎 옆으로 작은 절개를 만들어 신근 digitorum longus 또는 EDL 근육의 근위 힘줄을 노출시킵니다.이 부위에는 두 개의 힘줄이 있으며 내측 발목에서 EDL을 제거할 수 있도록 둘 다 절단해야 합니다. 경골 전방 또는 TA 근육의 힘줄을 잘라 중족골을 따라 뻗어 있는 EDL의 원위 힘줄을 노출시킵니다. TA 근육을 들어 올리십시오.아래에 있는 EDL을 자르거나 만지지 않도록 주의합니다. EDL의 원위 힘줄로 돌아가서 하나하나 잘라냅니다. 다음으로, 힘줄을 잡고 EDL을 팔다리의 나머지 부분에서 부드럽게 당겨 빼냅니다.근위부 끝에서 자유롭게 방출되어야 합니다. EDL 근육을 제거하고 식힌 산소 분유기로 채워진 해부 접시에 넣습니다. 힘줄을 통해 근육을 대략 휴식 길이로 고정하는데, 이는 생체 내에서 발견되는 길이입니다.근육이 접시에 들어가면 길이가 너무 짧고 근육이 해부 핀을 당기면 길이가 너무 깁니다. 근육에 최대한 가깝게 힘줄에 봉합사를 묶되 근육에 닿지 않도록 합니다. 봉합사를 사용하여 대략 휴지 길이로 근육을 고정합니다.이 절차를 시작합니다. 안락사된 동물의 피부를 절개합니다. 복부와 흉강을 노출시킵니다.복강을 열고 뼈 가위를 사용하여 갈비뼈 바로 아래의 체벽을 자르고 횡격막 삽입 위부터 시작합니다. 갈비뼈 선을 따라 흉곽 전체를 자르고 척추를 자릅니다. 횡격막을 쉽게 제거할 수 있도록 횡격막 중앙을 통과하는 혈관을 절단합니다.마우스에서 다이어프램을 제거하고 산소가 함유된 링거로 채워진 해부 접시에 넣습니다. 접시의 횡격막을 부드럽게 저어 피를 씻어냅니다. 필요에 따라 링거 용액을 새로 고칩니다.다음으로, 측면 hemi 횡격막의 중앙 부분에 있는 섬유의 방향을 따라 중앙 힘줄에서 갈비뼈까지 횡격막의 작은 스트립을 자릅니다. 스트립의 너비는 2mm에서 4mm 사이여야 합니다. 봉합사를 중앙 힘줄에 묶고, 옆으로 튀어나온 갈비뼈 끝 각각에 봉합사를 묶은 다음, 뼈 가위를 사용하여 큰 고리를 만들기 위해 함께 묶습니다.스트립의 양쪽에 있는 리브를 자르고 다이어프램 양쪽에 리브의 돌출부를 약 1-2mm 남겨둡니다. 고립된 골격근의 스트립 힘 생성 평가는 시험관 근육 테스트 시스템에 의해 수행되어 정비사의 욕조에 근육을 장착하고 봉합사를 잡고 이를 사용하여 근육을 한쪽 끝의 단단한 기둥과 다른 쪽 끝의 힘 변환기에 부착합니다. 좋은 근사치는 휴지 근육 길이입니다.앞에서 볼 수 있듯이 수조는 섭씨 22도로 유지되는 산소화된 링거 용액으로 채워져 있습니다. 근육 안정성을 연장하기 위해 근육 테스트를 위해 근육 기능을 테스트하기 전에 이 욕조에서 5분 동안 휴식을 취해야 하며, 이를 통해 근육 온도가 섭씨 22도로 유지되어 최상의 최대 자극 조건을 설정해야 합니다. 근육을 욕조에 넣은 후 0.5밀리초 자극 펄스를 한 번 사용하여 경련을 일으키고 힘 출력을 모니터링합니다.힘이 최대이지만 일정한 수준에 도달할 때까지 점차적으로 전류를 증가시키고, 최적의 길이를 설정하기 위해 나머지 실험을 위해 이 수준보다 10% 더 많은 전류를 증가시키고, 먼저 근육이 느슨하지 않은지 확인하되 가르치지도 않습니다. 좋은 근사치는 앞에서 보여준 것처럼 휴지 근육 길이입니다. 등척성 경련 자극을 사용하여 최대한의 힘이 얻어질 때까지 근육의 길이를 점차적으로 조정합니다.각 수축 사이에 약 10초 동안 근육을 쉬게 합니다. 최적의 근육 길이는 트위치 힘이 버니어 캘리퍼스를 사용하여 근육 길이를 최대 기록할 때 달성됩니다. EDL의 경우 근 건초 접합부 사이의 길이입니다.횡격막의 경우, 중심 힘줄 근 건초 접합부와 갈비뼈에 대한 근육 삽입 사이의 길이입니다. 최대 등척성 타이타닉 힘을 결정하기 위해 초 최대 자극 및 융합 주파수에서 일련의 0.5 밀리 초 펄스로 500 밀리 초 동안 최적의 근육 길이로 설정된 근육을 자극합니다. EDL 근육의 정체기는 일반적으로 120Hz로, 횡격막 근육의 경우 100Hz로 각 주파수를 3회 자극하며, 5분 휴식 후 모든 근육에 대해 5분의 휴식 시간을 갖습니다.등척성 수축을 수행한 후 편심 수축 절차를 시작합니다. 초기 500밀리초 동안 등척성으로 80헤르츠에서 근육을 자극한 다음 마지막 200밀리초 자극에서 10%의 최적 근육 길이 스트레칭을 합니다. 중간에 5분간 휴식을 취하면서 자극 패턴을 반복합니다.원하는 편심 수축 횟수를 얻으려면 스트레칭 이전 기간 동안 각 수축에 대한 힘을 측정합니다. 기능 테스트 완료 시 첫 번째 수축과 마지막 수축 사이의 힘 강하를 계산합니다. 근육 길이를 줄이고 변환기와 포스트에서 근육을 부드럽게 제거합니다.링거로 근육을 해부 접시에 다시 넣습니다. EDL 근육을 위해 근육에서 봉합사를 제거합니다. 근육을 두 번 차단한 다음 후속 처리 전에 무게를 잰다.이것은 횡격막 근육이 0.1%pros와 오렌지색, 멤브레인 및 투과 염료에 15-20분 동안 담가두는 단면적과 비힘을 계산하는 데 중요합니다. 이것은 박리 손상의 지표를 제공하고 횡격막 근육을 뼈 삽입부와 중앙 힘줄에서 멀리 해부합니다. 이는 무게를 측정하고 후속 준비를 하기 전에 근육 블롯의 정확한 무게를 제공하는 데 필요합니다.단면적 또는 CSA는 다음 공식을 사용하여 계산되며, 여기서 LO에 대한 L은 섬유 대 근육 길이 비율이고 1.06은 야생형 C 57 및 12주 된 동물의 근이영양증 또는 M-D-X-E-D-L 근육의 등척성 힘에 대한 근육 기대 값의 밀도입니다. MDX 근육은 보상적 비대를 나타내기 때문에 MDX 근육에서 타이타닉 포스에 대한 총계는 연령에 맞는 야생형 대조군에 비해 더 높을 수 있습니다. 기능적 출력의 보다 적절한 측정은 힘이 단면적에 대해 정규화되는 비힘입니다.이 값을 계산하기 위해 특정 힘은 근육의 고유한 기능적 능력에 따라 달라지며, 이영양성 근육의 약점은 절대 힘과 단면적을 모두 고려할 때 더 분명합니다. 이 연구에서 MDX 마우스의 EDL 근육은 생후 10주에서 26주 사이의 연령과 일치하는 야생형 마우스보다 약 20-25% 낮은 비력을 생성하는 것으로 관찰되었습니다. 횡격막의 경우, 제제는 해부에 의존하는 근육의 일부이기 때문에 비교에 특정한 힘만 관련됩니다.파란색 선으로 표시된 C 57 야생형 근육과 빨간색 막대로 표시된 MDX 횡격막 근육 사이의 특정 힘을 비교한 것은 이 조직의 진행성 병리학을 반영합니다. 등척성 힘 출력은 나이가 들면서 감소하여 생후 6개월이 되면 MDX 마우스의 횡격막 근육이 연령에 맞는 야생형 대조군에서 횡격막 스트립의 기능적 출력의 절반 이상을 생성하지 않습니다. 다이어프램 테스트로 인한 편심 수축의 예가 이 그림에 나와 있습니다.각각의 후속 편심 수축력으로 인해 파란색으로 표시된 야생형 C 57 마우스와 빨간색으로 표시된 MDX 마우스의 다이어프램 스트립에서 출력이 감소합니다. 그러나, 힘의 손실은 MDX 쥐의 근육 샘플에서 더 극적이며, 아마도 디스트로핀 및 관련 단백질이 없기 때문일 것입니다. 이 기술은 이 기술에 따라 적절하게 수행되면 단일 근육에 대해 약 1시간 안에 수행할 수 있습니다.웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 기타 생화학적 측정과 같은 다른 방법을 사용하여 치료가 단백질 수준을 변경했는지 또는 근육 무결성을 정상화했는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 EDL과 다이어프램을 해부하는 방법과 편심 수축 전후의 힘 생성을 측정하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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