Name: 에 얇게 - 두개골 두피 창 기술 생체 내 광 결맞음 단층 촬영 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 배우세요 생쥐 모델에서 얇은 두개골 피질 창을 만드는 방법으로 생체 내 광결맞음단층촬영(OCT) 뇌 영상을 획득하는 기술입니다. 이 비침습적 방법은 뇌 생물학적 무결성을 유지하며 구조 및 기능 정보를 제공합니다.

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이 작품은 컨셉 교부금의 UC 발견 증명 의해 NIH (R00 EB007241)에 의해 지원되었다. 저자는 또한이 실험에서 그녀의 도움 재클린 허바드 감사드립니다.

1. 외과 준비 <ol><li> 6~8주 세 사이의 여성 CD 1 마우스는 우리 실험에 사용되었습니다. </li><li> 케타민과 xylazine 조합 (80 MG / kg ketamine/10 MG / kg xylazine)의 intraperitoneal 주사와 마우스를 마취. ~ 37 ° C.에 최적의 체온을 보장하기 위해 homeothermic 패드에서 마우스를 놓으십시오 지속적인 동물의 반사 신경 (예를 들면, 무딘 집게와 발을 곤란하게) 테스트에 의해 마취의 수준을 모니터링하고 필요한 경우 더 많은 마취를 삽입. </li><li> 인공 눈물의 연고와 함께 두 눈에 기름칠. 면도칼을 사용하여 두피에 머리카락을 제거하고 70 % 알코올 시험을 치루 패드를 사용하여 잔류 머리카락을 제거합니다. 두피 이상 Nair 헤어 제거 크림의 얇은 층을 적용하고 적용하려면 2 분 정도 기다리십시오. 부드럽게 생리를 사용하여 Nair와 나머지 머리는 면봉과 알코올 시험을 치루 패드를 moistened 닦아. 두피는 이제 완전히 사나이 답게해야합니다. </li><li> betadine 면봉 스틱을 사용하여 두피를 소독하고 7 청소0 % 에탄올 사립 패드. </li><li> ~ 37 최적의 체온을 보장하기 위해 수술 커튼에 동물을주의 깊게 포장 ° C와 두개골을 고정 할 수있는 stereotaxic 프레임에 동물을 탑재합니다. 살짝의 안정성을 보장하기 위해 두개골을 누릅니다. 사용 재료의 목록은 표 1에 제공됩니다. </li></ol> 2. 얇게 - 두개골 두피 창 준비 <ol><li> 눈 사이의 중간 선 지점에 절개를 시작합니다. 귀 사이의 중간 선 지점으로 caudally 계속합니다. 집게가있는 부분 피부를. </li><li> 해부 현미경으로 얇게 할 지역을 찾아 부드럽게 핀셋을 사용하여 근막을 제거합니다. 얇게 대뇌 피질의 창을 만들기 전에 멸균 면봉으로 두개골을 말린다. 우리의 실험에서, 우리는 4 만든 × 4mm는 두개의 창 ~ bregma에 뒤쪽과 측면 1mm를 얇게. </li><li> 빛 한눈에 모션 onl를 사용하여 수술 핸드 드릴에 드릴 비트 크기 0.75 mm를 둥근 카바이드 버를 사용하여 두개골을 썼음 시작Y. 두개골로 직접 압력을 가하지 마십시오. 멸균 생리와 면봉을 사용하여 뼈 먼지를 제거하고 두개골을 과열 방지를 위해 매 20-30 초를 드릴 중지합니다. 생리는 또한 두개골 전체의 열을 사라지고에 도움이됩니다. </li><li> 소형 뼈의 바깥 층이 완전히 제거되면 중간 작은 구멍이 많은 뼈 층은 이제 표시됩니다. 혈관이 작은 구멍이 많은 뼈 계층에서 더 명백만큼 ​​일부 약간의 출혈이있을 수 있습니다. 녹색 돌 버로 전환하여 작은 구멍이 많은 층 더 섬세하므로 특히주의를 사용하여 드릴 계속 진행합니다. 두개골 창 전체 반반 함을 만들 때 녹색 돌 버 적은 뼈 자료를 삭제합니다. 뼈 먼지를 제거하고 두개골을 냉각 가끔 드릴 중지합니다. </li><li> 마지막으로, 두개골이 더 투명하고 뇌에 vasculature 나면 이제 볼 수 있습니다, 연마 버를 사용하여 두개골을 연마 시작합니다. 이 수 두개골을 부드럽게하면서 숱이 더 정확.주세요 SKU의 두께를 확인부드럽게 포셉과에 눌러 붙인다. 두개골이 약간 유연하게 될 때 연마를 중지합니다. </li><li> 얇게 두개골 창이 완전히 부드럽고 반사 및 이미징 (그림 1)에 대한 준비가되어 있어야합니다. 뇌의 고도의 분산 조직의 특성으로 인해, 두개골은 최적 깊이 침투에 대해 최소 55 μm로 얇게해야합니다. 사용 재료의 목록은 표 1에 제공됩니다. </li></ol> 3. 광 결맞음 단층 촬영 영상 <ol><li> 수술이 완료되면 마취의 적절한 수준을 보장하고 필요한 경우 추가 마취를 관리하는 동물의 호흡 속도와 반사 신경을 확인합니다. stereotaxic 프레임에서 동물을 제거 동물 이미징 역 수술 커튼에 싸여 있으며, 교통 동물 유지. </li><li> 이미지는 반사 표지판을 확인하고 필요한 경우 추가 인공 눈물을 적용하기 전에. 두개골을 확보 할 수있는 stereotaxic 프레임에 동물을 탑재합니다. </li><li> 아래의 장소 동물10월 카메라와 광학 빔 (그림 2)에 따라 위치 TSCW합니다. 두개골과 뇌의 단면도는 이제 (그림 3) 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 관심 지역이 위치한되면 데이터 수집이 시작 할 수 있습니다. 영상을 위해, 우리는 4.0 mm의 폭과 이미지 창을 달성하기 위해 갈보 거울을 사용합니다. 2mm의 이미지 깊이는 6 사고 전력 MW과 초점 얇게 두개골 아래의 1mm를 얻은 것입니다. 각 단면적 이미지 당 0.14 초의 수집 속도 2,048 축 스캔으로 구성. </li><li> 뇌의 용적 검사는 XY의 화살 방향으로 빔을 스캔 첫 번째 갈보 거울과 코로나에서 스캔 두 번째 갈보 거울과 스캔을위한 갈보 거울 두 개를 사용하여 2D 단면 일련의 이미지를 수집하여 구할 수 있습니다 방향. </li></ol>

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<li>Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+for+ultrahigh+resolution+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging.</a> Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).</li>
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<li>Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%3A+a+window+into+the+mechanisms+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis.</a> Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).</li>
<li>Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+optical+detection+of+cerebral+edema+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Early optical detection of cerebral edema in vivo.</a> J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).</li>
</ol>

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10월와 얇게-두개골 영상은 최근 15, 16, 조사 된 소설 신경 영상 기술이다. 우리의 실험에서, 우리는 생체 내 마우스 모델에서 TSCW을 통해 SD 10 월 영상의 가능성을 보여 주었다. 결과에서 두개골이 약 55 μm로 얇게되어 있고 침투 깊이는 각각의 축 방향 및 측 방향에서 8 μm 및 20 μm의 이미지 해상도로 약 1mm에서 얻어진다. 정상적인 두개골 (그림 4)에 비해 신호 강도 프로파일에서 TSCW을 통해 10월 영상은 신호 강도와 깊이 침투를 증가시킨다. 비교 ~ 10-15 μm의 두개골의 두께에 TSCW있는 두 광자 이미징은 ~ 3 μm 10시 축 해상도로 pial 표면 10, 11, 13 아래 150-250 μm의 이미지 깊이에 도달 할 수의 얇게 두개골 동안 ~이 20 μm 영상 깊이 대뇌 피질 12에서 300-400 μm에게 광고를 노출 할 수 있습니다. 오븐erall, 10...

초기 1990 년대의 도입 이후, 10 월은 조직 구조와 기능 2 생물 이미징 용도로 사용되었습니다. 10월는 광섬유 켈슨 간섭계 2,4과 낮은 일관성 광원을 구현하여 backscattered 조명 4 반향 시간 지연을 측정하여 단면 이미지를 생성합니다. 또한 푸리에 도메인 10월 (FD 10 월)로 알려진 SD 10 월은, 첫째 1995 5 소개 및 전통적인 시간 도메인 10월 (TD -10 월)에 비해 우수한 이미징 양상을 제공합니다. SD 10 월에서 참조 암은 높은 속도와 초 고해상도 이미지 획득 6-9의 결과로 고정 유지됩니다. 현재 TSCW 모델은 전통적인 craniotomy 대신에 두 광자 현미경의 생체 뇌 이미징 응용 프로그램에 주로 사용되었습니다. 이러한 TSCW은 추가 IMA을 제공하기 위해 사용자 정의 두개골 판이나 유리 커버 슬립 10-13와 동시에 사용되어왔다안정성을 ging. 우리의 연구에서 우리는 TSCW을 사용하는 경우 다음과 같은 액세서리는 10월 이미징에 필요한 아니라는 것을 관찰했다. 그들은 광학 빔을 방해하고 10월 이미지를 변경 할 수 있으므로 따라서, 두개골 판이나 유리 커버 용지의 부족은 이미지 창 크기의 넓은 범위의 할 수 있습니다. 얇게-두개골 준비 두 광자 현미경 10-13를 사용하여 뇌의 이미징 연구에 도움이 될 입증되었습니다. 우리의 실험에서, 우리는 TSCW을 통해 생체 내 이미지 피질에 SD 10 월 시스템을 사용합니다. 우리의 사용자 정의 SD 10 월 영상 설정은 각각 8 μm 및 20 μm의 축 방향 및 측 방향 해상도의 결과로 97 nm의 대역폭과 1,295 nm의 중심이 superluminescent 다이오드 (SLD), 14로 구성된 광대역, 낮은 간섭 광원을 포함 . 우리의 광학 이미징 장치와 함께, 우리는 TSCW을 통해 이미지가 O에 구조와 기능을 파악하고 시각화에 큰 가능성이 있다는 구상ptically 조밀 한 뇌 조직.

<table border="1"><tbody><tr><td> 자료 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 케타민 </td><td> 피닉스 제약 </td><td> 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Akorn 주식회사 </td><td> 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> 인공 눈물 연고 </td><td> 럭비 </td><td> 0536-6550-91 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> 교회 &amp; 드와이트 (주) 주식회사 </td><td> 4010130 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 알코올 준비 패드 </td><td> 켄달 의료 </td><td> 6818 </td><td></td></tr><tr><td> 면화는 Applicators 줬 </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-400-115 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine 솔루션 Swabstick </td><td> 퍼듀 제품 &lt;/ TD&gt; <td> 67618-153-01 </td><td></td></tr><tr><td> 생리 식염수, 0.9 % </td><td> 피닉스 제약 </td><td> 57319-555-08 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotactic 프레임 </td><td> Stoelting </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 고속 외과 핸드 드릴 </td><td> Foredom </td><td></td><td> 38,000 RPM </td></tr><tr><td> 초경 라운드 버 </td><td> Stoelting </td><td></td><td> 0.75 mm </td></tr><tr><td> 경질 - 그린 스톤 </td><td> Shofu </td><td></td><td> 생크 : HP 모양 : BA1 </td></tr><tr><td> CompoMaster 거친 &amp; CompoMaster 폴리 셔 </td><td> Shofu </td><td></td><td> 모양 : 미니 PT. </td></tr><tr><td> SpaceDrapes </td><td> Braintree 과학 주식회사 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에 얇게 - 두개골 두피 창 기술<em&gt; 생체 내</em&gt; 광 결맞음 단층 촬영 영상

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

광 간섭 단층 촬영 (OCT)는 높은 공간적 - 시간적 해상도 바이오 메디컬 이미징 기술이다. 그 최소한 침략 방식으로 10월는 피부과 안과, 그리고 gastroenterology 1-3에서 널리 사용되었습니다. 얇게 - 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 사용, 우리는 생체 내 이미지 피질을하는 도구로 스펙트럼 도메인 10월 (SD -10 월) 양상을 채용하고 있습니다. 더 다양한 기능을 제공으로 일반적으로, 오픈 - 머리가 신경 이미징에 사용 된 그러나, TSCW의 접근 방식은 덜 침습적이며, neuropathology의 연구에 장기 이미징을위한 효과적인 의미입니다. 여기, 우리는 대뇌 피질의 생체 10월 이미지에서의 마우스 모델에서 TSCW를 만드는 방법을 제시한다.

대뇌 피질 위에 얇게 창을 만든 후 vasculature는 이제 더 시각적으로 눈에 잘 띄는해야합니다 (그림 1)과 (최대 1 ㎜) 깊이 이미징 깊이있게됩니다. 140 μm (그림 1)에서 측정 및 더 큰 광학 선명도를 제공하는 일반 두개골에 비해 오른쪽 피질은 약 55 μm로 얇게되어 있습니다. 또한 10-15 μm로 썼음하면 11 그러나 유리 커버 용지와 두개골 플레이트의 사용 등 필요한는 (그림 1 및 2)의 실험에서 구현되지 않을 수 있습니다. 이 특별한 방법은 우리가 10월 단면 이미지 (그림 3)에서 특정 구조 (대뇌 피질, 코퍼스의 callosum)를 식별 할 수 있습니다. 얇게 해골 (그림 3B) 대 일반 해골 (그림 3A)의 Parasagittal 10월 이미지는 성공적으로 TSCW로 10월 이미지의 결과를 비교...

우리는을위한 마우스 모델에서 얇게 - 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 생성하는 방법을 제시<em&gt; 생체 내</em대뇌 피질의&gt; 10월 영상.

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

이 절차의 전반적인 목표는 뇌의 생체 내 광간섭 단층 촬영 이미징을 위해 마우스 모델에서 얇은 두개골 창을 만드는 것입니다. 이것은 먼저 동물을 마취하고 수술을 준비함으로써 이루어집니다. 다음으로 다양한 치아 버를 사용하여 두개골을 얇게 만듭니다.마지막 단계는 얇은 두개골 두개골 창을 통해 생체 내에서 뇌의 OCT 이미지를 얻는 것입니다. 궁극적으로, 결과 OCT 이미지에서 뇌의 구조 및 기능 정보를 얻을 수 있습니다. 두개골 절제술이나 커버 슬립 윈도우와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 finical window가 덜 침습적이고 뇌의 생물학적 무결성과 생존력을 유지할 가능성이 더 높다는 것입니다.OCT는 공초점 및 두 광자 현미경과 비교할 때 높은 공간 및 시간 해상도를 제공하고 우수한 깊이 침투를 제공하기 때문에 이 기술의 의미는 신경 장애의 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 두개골 골절이나 경막하 출혈이 발생하지 않고 균일하게 얇은 두개골 표면을 만드는 데 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 생후 6주에서 8주 사이에 CD 1마리의 마우스를 마취하여 케타민과 자일라진 조합의 복강 내 주사를 합니다.그런 다음 수술 준비 중에 약 섭씨 37도에서 최적의 체온을 보장하기 위해 마우스를 호메오 테마 패드 또는 담요에 놓고 동물의 반사 신경을 테스트하여 마취 수준을 지속적으로 모니터링하고 필요한 경우 더 많은 마취를 주입합니다. 다음으로, 인공 눈물 연고로 양쪽 눈을 윤활합니다. 이발기로 두피의 털을 제거합니다.그런 다음 결혼 패드나 면봉으로 남은 잘린 머리카락을 제거합니다. 그런 다음 두피에 제모 크림을 얇게 바르십시오. 2분 후 식염수, 적신 면봉, 알코올 준비 패드를 사용하여 크림과 남은 머리카락을 부드럽게 닦아냅니다.이제 베타딘 면봉을 사용하여 두피를 소독하고 70% 에탄올 준비 패드로 청소합니다. 그런 다음 동물을 입체 프레임에 장착하여 두개골을 고정시킵니다. 두개골의 안정성을 확인하기 위해 두개골을 가볍게 두드립니다.이 절차에서는 눈 사이의 정중선 지점에서 두피 절개를 시작합니다. 귀 부분 사이의 정중선 지점까지 조금씩 계속하면 집게로 피부가 펄럭입니다. 다음으로, 해부 현미경으로 얇게 할 영역을 찾습니다.집게를 사용하여 두개골을 긁어 잔여 근막을 제거합니다. 그런 다음 멸균 면봉으로 두개골을 말리고 약 1mm 후방과 외측 토레마에 4 x 4mm의 얇은 피질 창을 만듭니다. 둥근 카바이드 버가 있는 수술용 핸드 드릴을 사용하여 가볍게 쓸어넘기는 동작으로 두개골을 얇게 만듭니다.두개골에 직접적인 압력을 가하지 마십시오. 20-30초마다 드릴을 중지하여 멸균 식염수와 면봉을 사용하여 뼈 가루를 제거하고 두개골이 과열되는 것을 방지합니다. 식염수는 또한 두개골 전체의 열을 발산하는 데 도움이 됩니다.조밀한 뼈의 바깥층이 완전히 제거되면 가운데 해면질의 뼈층이 보여야 합니다. 해면질의 뼈층에서 혈관이 더 뚜렷하게 나타나기 때문에 약간의 출혈이 있을 수 있습니다. 녹색 돌 버로 전환하고 각별한 주의를 기울여 드릴링을 계속하십시오.해면질층이 더 섬세하기 때문에 녹색 돌 버는 두개골 창 전체에 균일성을 보장하면서 뼈 물질을 덜 제거합니다. 뼈 먼지를 제거하고 두개골을 식히기 위해 때때로 드릴을 멈추십시오. 마지막으로, 두개골이 더 투명해지고 뇌의 혈관 구조가 보이면 연마 버를 사용하여 두개골을 연마하기 시작하고 집게로 두드려 두개골의 두께를 확인하고 연마를 멈춥니다.두개골이 약간 유연해지면 얇아진 두개골 창은 이제 완전히 매끄럽고 반사되어 이미징할 준비가 되어야 합니다. 뇌 조직이 많이 흩어져 있는 특성으로 인해 두개골은 최적의 깊이 침투를 위해 최소 55미크론으로 얇아져야 합니다. 수술이 끝난 후, 육안 검사와 반사 신경을 통해 동물의 호흡 속도를 확인하여 적절한 마취 수준을 확인하고 추가 마취를 시행합니다 필요한 경우 OCT 카메라 아래에 동물을 배치한 다음 광학 빔 아래에 얇은 두개골 창을 배치합니다.이제 두개골과 뇌의 단면도를 시각화할 수 있습니다. 데이터 수집을 시작할 수 있습니다. 이미징 목적으로 관심 영역을 찾으면 4.0mm 너비의 이미징 피질 창을 통해 OCT 빔을 스캔하여 6밀리와트의 입사 전력으로 2mm의 이미징 깊이와 얇은 두개골 아래 0.1mm의 초점 지점을 얻었습니다.각 단면적은 이미지당 0.14초의 획득 속도로 2048개의 축 스캔으로 구성되었습니다. 이 특정 방법을 통해 OCT 단면 이미지에서 특정 구조를 식별할 수 있었습니다. 이 그림은 정상 두개골 아래 피질의 파라 시상 OCT 이미지를 보여주며, 다음은 얇은 두개골 아래의 파라 시상 OCT 이미지를 보여줍니다.뇌의 구조는 정상적인 두개골과 달리 얇은 두개골 창 아래에서 시각적으로 더 뚜렷하게 나타납니다. 또한 정중선 구조를 쉽게 식별할 수 있도록 관상 단면 OCT 이미지도 얻습니다. 뇌의 체적 스캔은 XY 스캔을 위해 두 세트의 gal O 미러를 사용하여 일련의 2D 단면 이미지를 수집하여 얻을 수 있으며, 첫 번째 gal O 미러는 시상 방향으로 빔을 스캔하고 두 번째 gal 미러는 코로나 방향을 스캔합니다.이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 10분 안에 완료할 수 있습니다. OCT 이미징 중에 적절한 신호 침투를 보장하기 위해 두개골을 균일하게 얇게 하는 것이 중요하지만, 이 비디오를 시청한 후에는 OCT 이미징 목적으로 얇은 두개골 피질 창을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

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Neuroscience

신경과학

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종<em&gt; 생체</em&gt;은 Cerebrovasculature의 이미징 : CNS 질환에 관련성

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Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

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배우세요 생쥐 모델에서 얇은 두개골 피질 창을 만드는 방법으로 생체 내 광결맞음단층촬영(OCT) 뇌 영상을 획득하는 기술입니다. 이 비침습적 방법은 뇌 생물학적 무결성을 유지하며 구조 및 기능 정보를 제공합니다.

에 얇게 - 두개골 두피 창 기술

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