Name: 전체 마운트 RNA 형광 현장에서 하이브리드 Drosophila 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 태아에서 RNA 발현과 위치를 분석하는 전체 마운트 형광 현장에서 하이브리드(FISH) 기법을. 이 최적화된 프로토콜은 발달생물학 연구자들이 고해상도로 RNA 분포를 시각화하여 유전자 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lécuyer 실험실에서 실시 작품은 국립 과학 캐나다의 공학 협의회 (NSERC), 건강 연구 (CIHR)와 Fonds 드 공들인 실내 Santé 뒤 퀘벡 (FRSQ)의 캐나다 연구소에서 자금을 지원합니다. 캐롤 Iampietro는 안젤로 Pizzagalli 박사 교제를 지원하는 동안 파비오 알렉시스 Lefebvre와 게일 Moquin - Beaudry은 NSERC 학부 연구 studentships에 의해 지원됩니다.

1. RNA 프로브 준비 개요 : 다음 섹션은 물고기에 적합한 Digoxigenin (해봐)이라는 RNA 프로브를 만들기 위해 필요한 단계를 설명합니다. 첫 번째 단계는 복제 또는 시퀀스 특정 프로브를 생성하는 데 사용됩니다 관심있는 유전자의 베꼈 지역에 해당하는 순서를 증폭 PCR 포함됩니다. 이것은 여러 복제 사이트는 다음 발기인 시퀀스를 통합 측면을 노릴 프리 머를 사용하여 PCR을위한 템플릿으로 제공 할 수 박테리오파지 프로모터 요소 (T7, T3 또는 SP6)에 의해 둘러싸인되는 플라스미드에 처음 복제 유전자 세그먼트에 의해 달성 될 수있다 , 따라서 각각의 말단 (그림 1A)에서 다른 발기인 시퀀스와 선형 PCR 제품을 생성. : 또는 복제 단계를 방지하기 위해, 하나는 게놈 DNA 또는 cDNA T3 T7, 또는 5 &#39;극단에서 SP6 시퀀스 (예 : T7을 포함 oligonucleotides를 사용 PCR 증폭을 수행 할 수 있습니다5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3 : 5&#39;-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3&#39;; SP6 : 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 &#39;). 선형 PCR 제품은 다음 실행 - 오프 적절한 효소 (그림 1B)와 체외 스크립트에 의해 해봐 - 라벨 감각이나 안티센스 RNA 프로브를 만들기 위해 템플릿으로 사용됩니다. 특정 유전자에 대한 프로브를 할 때, 우리는 생선 신호 특이성 (예 : 관심의 유전자가 안티센스 방향으로 베꼈하지 않는 한 평가에 도움이 될 것입니다 별개의 polymerases를 사용하여 감각 안티센스 RNA 프로브를 모두 준비하는 것이 좋습니다, 감각 RNA 프로브가 표시됩니다 배경 신호의 레벨). 다음 단계의 모든에서는, (예 : 물, 먼저 70 %의 에탄올 또는 상업적 RNAse의 오염 제거 솔루션으로 모든 벤치 공간과 장비를 청소하고 RNAse 무료 물자를 사용하여 오염 ribonucleases (RNAses)에 의해 잠재적 인 저하를 방지하기 위해 큰주의를 기울여야한다 팁, microcentrifuge 튜브). 엄마terials <ul><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (Abgene, 로체스터, NY, USA 고양이. 번호 0900) </li><li> 젤 - 추출 키트 (QIAGEN, Mississauga, ON, 캐나다,. 고양이 번호 28706). </li><li> RNAse 무료 물 (Wisent 주식회사 고양이. 번호 809-115-CL) </li><li> RNA의 polymerases (T3 T7, 또는 SP6). (20 U / μl, Fermentas Biosciences. 고양이. 번호 EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> RNAse-OUT Ribonuclease 억제제 (40 U / μl), (Invitrogen, 버 링턴. Canada.Cat. 번호 10777-019 ON). </li><li> Digoxigenin (파) 염기 믹스 (파-11-UTP, 로슈 응용 Biosciences, 라발, QC, 캐나다. 고양이. No.11209256910). </li></ul> 장비 <ul><li> 테이블 상단 마이크로 원심 분리기 </li><li> 젤 - 전기 장치 </li></ul><ol><li> PCR은 게놈 DNA, cDNA, 또는 박테리오파지 T7, T3 또는 SP6 발기인 시퀀스으로 둘러싸인 선형 PCR 제품을 생성하는 플라스미드 DNA로부터 유전자 특정 순서를 증폭. PCR 조건에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. </li><li> 품질과시 확인아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품의 ZE. 추천을 생산하고 버퍼 50 μl에 제품을 elute에 따라 표준 젤 추출 키트를 사용 소비세 및 정화 PCR 제품입니다. </li><li> 3M의 아세트산 나트륨 (산도 5.2)과 얼음 차가운 100 % 에탄올 150 μl의 5 μl를 추가하여 PCR 제품을 침전하고, -70 ° C 하룻밤에 튜브를 놓습니다. 4 ° C에서 10 분 동안 13,000 XG에서 튜브를 원심 분리기와 70 %의 에탄올과 펠렛을 씻는다. 다시 돌려, 에탄올과 공기 펠렛을 건조의 모든 흔적을 제거합니다. RNAse 무료 물 25-50 μl에 Resuspend. </li><li> 10X T7 스크립트 버퍼 2 μl (Invitrogen), RNAse 억제제, 2 μl 해봐 - NTP 믹스 1 μl (20 U / μl) : 다음과 같이 20 μl 반응 200-500 NG 정화 PCR 제품을 사용 파 - 라벨 프로브를 고쳐 쓰다 , 2 μl T7 RNA 중합 효소의 (20 U / μl). RNAse 무료 물을 20 μl로 최종 볼륨을 가져와. 3-4 시간에 37 ° C에서 전사 반응을 품다. </li><li> transc을 조정RNAse 무료 물을 50 μl로 ription 믹스와는 4 단계에서 설명 해봐 - 라벨 RNA 프로브를 침전. RNAse 무료 물 100 μl에 씻은 RNA 펠렛을 Resuspend. -70 ° C.에 resuspended 샘플을 저장 </li><li> nanodrop 분광 광도계를 사용하여 프로브를 수량화. 프로브 품질을 확인하려면 ethidium 브로마이드와 1~2% 아가로 오스 겔 스테인드에 1-2 μl 샘플을 실행합니다. </li></ol> 2. Drosophila의 배아의 수집 및 고정 개요 :이 섹션은 무대 Drosophila의 배아를 수확 및 처리를 위해 단계를 설명합니다. 필요한 배아의 수에 따라 파리는 다양한 크기의 인구 케이지 유지 될 수 있습니다. 컬렉션은 100mm 사과 주스 수집 플레이트를 사용하여 900cm 3 원통형 새장을 사용하여 수행을위한 다음 단계는 다음과 같습니다. 적절한 고정은 배아를 둘러싼이 보호 층의 제거를 필요 바깥 쪽 융모막과 내부 vitellin전자 막 13. 일단 수확, 태아가 처음 융모막을 제거 할 수있는 50 % 표백제 용액에 목욕 있으며, 그때는 헵탄 (vitelline 막을 permeabilizes) 및 PBS는 3.7 %의 포름 알데히드를 포함하는를 포함하는 biphasic 솔루션에 혼합되어 있습니다. vitelline 막 나서 금과 헵탄과 메탄올의 biphasic 혼합으로 배아를 전송하여 제거됩니다. 적절한 배아 고정 및 vitelline 막 제거는 하류 물고기 절차의 성공을 위해 중요합니다. 자료 <ul><li> 사과 주스 허름한 크기의 효모 붙여 넣기와 한천 플레이트 (40 % 사과 주스, 4 %의 자당, 3.5 %의 한천, 0.3 % 메틸 paraben) (베이커의 효모는 버터의 일관성을 물과 혼합) </li><li> 가루 paraformaldehyde (전자 현미경 과학, 하트 필드, PA, USA,. 고양이 번호 19208) </li><li> 헵탄 </li><li> 메타놀 </li><li> 3 % 표백제 솔루션 </li><li> 20 ML 유리 병 섬광 (캐나다, ON 열 피셔 과학, 오타와,,. 고양이 번호 03-337-15). </li></ul> 장비 <ul><li> 인구 케이지 </li><li> 컬렉션 바구니 (Nitex 메쉬와 구멍이 뚜껑으로 잘라되었습니다 된 컷 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브의 상단 부분을 사용하여 만든). </li><li> 작은 페인트 브러시 </li><li> 표 상단 소용돌이 </li></ul><ol><li> 25 1 시간을위한 신선한 사과 주스 / 효모 판으로 미리 명확 잘 자란 인구 케이지 ° C. </li><li> 초기 단계의 배아를 수확하기 위해 케이지에 새로운 사과 주스 / 효모 판을 추가합니다. 25 4 시간의 새장을 길​​러 ° C (수집 시간이 원하는 단계에 따라 조절 될 수 있다는주의). </li><li> 3.7 g의 paraformaldehyde 가루, 2N 코 70 μl, 그리고 화학 후드 아래에 유리 섬광 병에 milliQ 물 7.3 ML를 결합하여 새로운 37%의 포름 알데히드 용액을 준비한다. paraformaldehyde 분말이 완전히 용해 될 때까지 새로운 섬광 유리 병에 실내 온도와 필터 그리고 시원한 솔루션을 끓일. </li><li> 하여 biphasic 고정 솔루션을 준비다음 헵탄의 7.5 ML를 추가, 섬광 유리 병 37 %의 포름 알데히드 250 ML에 1X PBS의 2.25 ML을 결합. </li><li> 케이지에서 사과 주스 판을 수확하고 객실 온도 수돗물의 비트를 추가하고 섬세 페인트 브러시와 함께 접시에서 배아를 닦고하여 배아를 수집합니다. 바구니에 resuspended 배아를 전송하고 미지근한 수돗물로 씻어. </li><li> 표백제 용액에서 컬렉션 바구니를 수영 90 초 동안 Dechorionate 배아는 다음 미지근한 수돗물 (표백제 냄새가 사라질 때까지)로 철저하게 린스. </li><li> 수집 바구니를 분해, 부드럽게 붓을 사용하여 배아를 수집하고 biphasic 고정 솔루션으로도 양도 할 수 없습니다. 배아는 PBS와 헵탄 층 사이의 인터페이스에서 축적됩니다. </li><li> 인감 섬광 튜브와 와류 믹서에 고정. 가장 낮은 설정을 20 분 동안 흔들어. </li><li> 제거하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 낮은 PBS와 상부 헵탄 단계의 대부분을 폐기합니다. 대기음피펫에 남아있는 PBS / 헵탄 / 배아 혼합물. dropwise 패션에서 배아를 제거하지 돌보는, 피펫에서 낮은 PBS 단계를 폐기하십시오. 500 μl 헵탄의 biphasic 솔루션 (상위 단계), 500 μl 메탄올 (낮은 단계)이있는 1.5 ML 튜브로 배아를 입금. </li><li> vitelline 세포막을 자극 30-45 초를 위해 손으로 힘차게 튜브를 흔들어. 일단 금이 간, 배아는 메탄올로 가라 앉을 것입니다. </li><li> 헵탄 / 메탄올의 계면에서 상단 헵탄 위상 및 uncracked 배아를 폐기하고, 메탄올 500 μl를 추가합니다. 5 초에 흔들어. </li><li> 메탄올로 3 회 씻고 -20 ° C (이 시점에서 배아는 주 / 개월 동안 저장 될 수있다)에있는 배아를 저장합니다. </li></ol> 3. 후 고정 처리, 하이브리드 및 사후 하이브리드 세차 개요 : 생선이 절 세부 배아 permeabilization에 대한 처리 단계 이전에, 사전 하이브리드,RNA 프로브 및 사후 하이브리드 세차와 하이브리드. 초기 permeabilization 단계의 경우 배아는 단일 관 (단계 아래 1-9, 정착 태아 / 샘플의 10-15 μl를 목표로)에 수영장으로 처리되지만, 그들은 96 - 웰 PCR 플레이트의 개인 우물에 aliquoted 아르 사전 하이브 리다이 제이션 단계 (아래 10 단계)로 진행하기 전에. 이 실험의 초기 단계에있는 모든 배아의도 치료를 보장하는 데 도움이됩니다. 물고기 실험을 설정하면 각각의 실험에서 배경 신호의 레벨을 결정하기 위해 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 우리는 섹션 1, 일반적으로 &#39;노 프로브&#39;조건에 필적하는 신호를 제공합니다 &#39;의미&#39;RNA 프로브와 hybridized 샘플에 명시된 바와 같이 &#39;노 프로브&#39;샘플을 포함시키는 것이 좋습니다합니다. 자료 : <ul><li> 메타놀 </li><li> 인산염은 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 (PBT)와 염분 버퍼 </li><li> Proteinase-K 1 MG / ML 주식 솔루션 (시그마 알드리치, 옥빌, ON, 캐나다. 카탈로그 번호 P2308) </li><li> 글리신 (20 MG / ML 주식 솔루션) </li><li> 하이브리드 솔루션 : 50 % 포름 아미드, 5 배 SSC, 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 빠졌어 연어 정자 DNA의 100 G / ML, 100 μg / ML 헤파린. </li><li> 0.2 ML 96 - 잘 PCR 플레이트, Abgene, 로체스터, NY, USA 고양이를 halfskirted. 0900 없음) 없음 </li></ul> 장비 <ul><li> 56 조정 하이브 리다이 제이션 오븐, 디지털 가열 블록이나 물 목욕 ° C, 80 ° C 또는 100 ° C, 또는 PCR 기계. </li><li> 멀티 채널 pipettors (세정 단계를 단순화하는 것이 좋습니다) </li><li> 믹서를 Nutating </li></ul><ol><li> PBT에 두 번 한 후 PBT, 그리고 : 메탄올의 1:1 혼합물에 다음 메탄올에 배아를 씻어. </li><li> PBT는 nutator에 일정한 흔들와 3.7 %의 포름 알데히드를 (11 단계에 설명 된대로 신선하게 조리 된) 포함 1 ML의 20 분의 배아를 해결했습니다. </li><li> PBT에서 2 분 흔들면서 3 번 배아를 씻으십시오. </li><li> 3 μg / PBT에 희석 proteinase K (PK)의 ML의 솔루션을 준비하고 추가샘플에 대한 솔루션 500 μl. 흔들림없이 실내 온도에서 10 분에 샘플을 품다. 피펫으로 분사하거나 부드럽게 반전 튜브의 배아마다 2 분을 섞는다. </li><li> 1 시간에 얼음 배아 샘플을 전송합니다. </li><li> 실내 온도에 샘플을 이동 PK 솔루션을 제거합니다. PBT + 2 밀리그램 / ML 글리신의 1 ML과 2 분에 2 번 씻으십시오. </li><li> 요동와 PBT + 3.7 %의 포름 알데히드의 1 ML에 샘플 20 분 문제를 해결했습니다. 태아에게 PBT 5 번 씻어. </li><li> PBT 및 Hyb 솔루션의 1:1 혼합물의 1 ML과 배아를 씻어. 백퍼센트 Hyb 솔루션 (이 단계에서 배아는 -20 ° C에서 몇 일 / 주 동안 저장 될 수 있습니다)의 0.5-1 ML로 대체합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트 (/ 잘 배아 손상을 방지하기 위해 폭 넓은 조리개 팁을 사용하는데주의를 기울여야 해결 배아의 ~ 10-15 μl를위한 목표)의 각 우물에 나누어지는의 배아. </li><li> 5 분을위한 얼음에 시원 후 5 분에 있고 Hyb 솔루션 100 μl / 샘플을 끓일. 이 솔루션은 (사전 Hyb) 샘플 사전 하이브 리다이 제이션에 사용됩니다. </li><li> 사전 Hyb 솔루션 100 μl / 샘플을 추가하고 56에서 최소한 2 시간에 품다 ° C. </li><li> 각 샘플을 보려면 Hyb 솔루션 100 μl에 프로브의 ~ 100 NG를 희석. 80 예선 5 분 (온수 프로브는 몇 시간 동안 얼음에 보관하실 수 있습니다)에 얼음 이후 쿨 3 분에 대한 ° C. </li><li> 배아에서 사전 Hyb 솔루션을 제거하고 RNA 프로브 솔루션으로 교체하십시오. </li><li> 12-16 시간에 56 ° C에서 잡종을 만들다. </li><li> 56에서 사전 따뜻하고 다음 세척 솔루션 ° C : (A) 200 Hyb 솔루션의 μl / 샘플 (B) Hyb의 3시 1분 혼합의 100 μl / 샘플 : PBT,의 (C) 100 μl / 샘플 Hyb의 1시 1분 혼합 : PBT, (D) Hyb의 1시 3분 혼합의 100 μl / 샘플 : PBT (E) PBT 400 μl / 샘플. </li><li> 세탁 솔루션 100 μl와 함께 샘플을 씻어 후 15 분마다 56의 솔루션 AD 100 μl / 샘플과 세척 단계 ° C를 수행합니다. 그런 다음, 56 ° C.에서 솔루션 E의 100 μl / 샘플 5 분에 샘플 4 번 씻어 </li><li> 실내 온도에 차가운 샘플. </li></ol> 개요 :이 섹션은 RNA 프로브 신호 다음 하이브 리다이 제이션의 분포를 감지하고 시각화하는 데 사용되는 항체를 검출 시약을 설명합니다. 이 단계는 그림 2에 개략적으로 설명되어 있습니다. 여기 우리는 강력한 신호 증폭에 사용하는 표준 검출 시약 만 제시하지만, 단백질 RNA 두 번에 동시에 서로 다른 RNAs를 공동 감지 두 번 생선 실험을 수행 할 때 특히 다양한 대안으로 사용할 수 있습니다 상업적으로 이용 가능한 시약을 존재 착색. 이 프로토콜로 얻어진 결과의 예는 그림 3의 mRNA 표현 / 현지화 패턴 모자이크에 표시됩니다. 자료 <ul><li> HRP-복합 마우스 단클론 항 파 (잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 고양이. 번호 200-032-156) </li><li> 비오틴 - 복합 마우스 단클론 항 파 (잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 고양이. 번호 200-062-156) </li><li> Streptavidin-HRP 공액 (분자 프로브, 유진 OR, USA, 고양이. No.S991) </li><li> Cy3-tyramide의 conjugates (Perkin 엘머 생명 과학, 보스톤, MA, 미국, 고양이. 번호 SAT704A) </li><li> DABCO이 솔루션을 설치 : 50 ML 튜브에 DABCO의 1.25 g 희석 (1,4-diazabicyclo [2.2.2] 옥탄을, 시그마 D-2522) 완전 할 때까지 1X PBS의 15 ML에 한 다음 35 글리세롤의 ML와 혼합을 추가 균질. PBS로 premixing으로 DABCO 분말은 매우 신속하게 용해된다. -20 ° C.에 상점 장착 솔루션 </li><li> 유리 슬라이드, coverslips </li></ul> 장비 <ul><li> 믹서를 Nutating </li><li> 멀티 채널 pipettor </li><li> 형광 현미경 </li></ul><ol><li> PBT를 포함하는 PBTB 솔루션 + 1 % 비 지방 건조 우유를 (보통 50-100 ML 모든 검색 시약 보육 및 세정 단계 충분합니다) 준비합니다. </li><li> nutator에 흔들하면서 100 μl PBTB / 샘플의 온도는 실온에서 10 분 동안 샘플을 차단합니다. </li> &lt;리&gt; 락 100 μl / 샘플 단클론 비오틴 안티 - 파 항체 솔루션 (PBTB에 혈통이 4백분의 1을 희석)로 실온에서 1.5-2 시간에 태아 및 배양 샘플에서 차단 솔루션을 제거합니다. </li><li> 각 흔들 100 μl PBTB / 샘플 5 분에 샘플 6 번 씻으십시오. </li><li> 락과 streptavidin-HRP 솔루션 (PBTB, 10 μg / ML 최종 농도 혈통 1백분의 1을 희석)의 75 ML / 샘플 실온에서 1.5 시간을 품다. </li><li> 샘플 씻어 5 분 6 번 흔들어 (DNA의 counterstaining에 대해 PBTB의 1X 작업 농도에 DAPI를 희석하고 첫 번째 세척 단계에서이 솔루션을 사용) 100 μl PBTB / 샘플.을 </li><li> PBT와 배아를 씻어 후 PBS로 5 분을 위해 2 번을 씻는다. </li><li> Cy3-tyramide 솔루션 (Tyramide 증폭 버퍼에 50분의 1 희석)의 50 μl / 샘플과 nutator에 실온에서 2 시간 동안 샘플을 품다. 에서이 단계에서, 밝은 차폐 소켓에 샘플을 보관해야합니다. &lt;이/ 리&gt; <li> 5 분마다 nutator에 100 μl PBS / 샘플과에 샘플 6 번 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거하고 70 % 글리세롤 및 2.5 % (DABCO)를 포함 장착 솔루션의 100-125 μl / 샘플을 추가 할 수 있습니다. 스토어 샘플 4에 ° C. 이 샘플은 몇 년 동안 저장 될 수 있습니다. </li><li> 넓은 보어 팁을 사용하여 부드럽게 샘플을 pipetting하여 배아를 resuspend과 유리 슬라이드로 배아의 25 μl를 전송 한 후 손톱 폴란드어와 슬라이드로 배아 및 인감 이상 coverslip를 놓습니다. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 배아 샘플을 분석합니다. </li></ol>

<ol><li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+gene+expression+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li>
<li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li>
<li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li>
<li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li>
<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li>
<li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEISHA%2C+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li>
<li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryo+dechorionation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+gene+collection%3A+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%25+of+D.+melanogaster+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+complementary+DNA+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li>
<li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846(2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

프로브 합성 단계의 경우, 우리는 일반적으로 Drosophila 유전자 컬렉션 (DGC), 다음 웹 사이트에서 설명하는 자원에서 발견 plasmids의 증폭 전체 길이 Drosophila의 cDNAs에서 체외 스크립트에 의해 실행 - 오프 안티센스 RNA 프로브를 생성 : <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 페이지</a> 14,15. 이 접근 방식은 플라이 배아 9,16의 매핑 유전자 표현과 mRNA의 현지화 패턴을 대상으로 대규모 틱 연구에서 널리 사용되었습니다. DGC의 plasmids은 Drosophila 게놈 자원 센터 (주문하실 수 있습니다 <a href="https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/" target="_blank">htt...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> T7, T3 또는 SP6 RNA 중합 효소의 </td><td> Fermentas 생명 과학 </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> 키트는 반응 버퍼가 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> 파 RNA 라벨 믹스 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M의 아세트산 나트륨 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 차가운 100 % 에탄올. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 차가운 70 % 에탄올. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 염소 표백제 솔루션은 물과 1:1 희석. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 헵탄 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 메타놀 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> 시그마 알드리치 옥빌, ON, 캐나다 </td><td> 카탈로그 번호 P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40 % 포름 알데히드 용액, 신선한 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-십대 초반 솔루션 (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0.1 % 십대 초반-20 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 솔루션 </td><td></td><td> PBT에서 2 밀리그램 / ML 글리신 </td><td></td></tr><tr><td> 단클론 HRP-복합 마우스 안티 - 파 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (PBTB의 1 MG / ML 주식 솔루션의 400분의 1 희석 </td></tr><tr><td> HRP-복합 양 안티 - 파 단클론 </td><td> 로슈 응용 ScienCE, 라발, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> PBTB의 주식 솔루션의 5백분의 1 희석 </td></tr><tr><td> 비오틴 - 복합 마우스 단클론 항 파 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사, 웨스트 그 로브, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (PBTB의 1 MG / ML 주식 솔루션의 400분의 1 희석 </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP 공액 </td><td> 분자 프로브, 유진 OR, USA </td><td> S991 </td><td> (1 μg / ML 주식 100분의 1 희석 </td></tr></tbody></table>

전체 마운트 rna 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; drosophila</em&gt; 태아

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

유전자뿐만 아니라 베꼈 RNA의 subcellular 지방화 속성의 표현 패턴을 평가하는 것은 개발 과정의 생물학적 기능을 이해하기위한 핵심 기능입니다. 현장 하이브리드 화의 RNA (RNA 살쯤)는 RNA 배포 속성을 시각화하는 데 사용되는 강력한 방법입니다, organismal, 휴대 또는 subcellular 레벨 1에서합니다. RNA 살쯤는 mRNA 또는 관심 (2)의 비 코딩 RNA 대상의 순서를 보완이라는 핵산 산 프로브 (예 : 안티센스 RNA, oligonucleotides)의 하이브리드에 기반을두고 있습니다. 프로 시저가 순서 특정 프로브를 생성 할 만 기본 순서 정보를 필요에 따라, 그것은 보편적 생물과 조직 표본 3의 광범위한 적용 할 수 있습니다. 사실, 대규모 틱 연구 번호가 유전자 발현을 문서화하고 다양한 모델 생물에서 현지화 역학을 RNA하기 위해 구현되었으며, 이는하게되었다중요 지역 사회 자원 4-11의 설립. 프로브 라벨 및 검색 전략의 다양한이 년 동안 개발 된 반면, 휘황-라벨 감지 시약 및 효소 신호 증폭 단계의 결합 사용은 절차 12 감도와 해상도에 상당한 향상을 제공합니다. 여기, 우리는 무대 Drosophila의 배아에서 RNA의 발현 및 현지화 역학을 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA)을 채용 원위치 하이브리드 화 방법 (물고기)에 최적화 된 형광을 설명합니다. 절차는 크게 샘플을 다수의 동시 처리를 용이하게 96도 PCR 플레이트 형식으로 수행됩니다.

성공적으로 수행되면,이 절차는 초기 Drosophila의 embryogenesis 동안 유전자 발현 및 mRNA의 현지화 역학의 spatio - 시간적 분석의 상세 놀랍도록 향상된 수준을 제공합니다. 클래식 쌍 - 규칙 유전자 꼬마 (실행)를도 3a에 도시 된 바와 같이 실제로, 하나는 핵을 표현 그룹의 초기 스크립트 foci의 검출을 통해 유전자 발현 이벤트를 관찰 할이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 또한, 그림의 3B의 배아 모자이크에 도시 된 바와 같이, 상기 방법은 높은 해상도의 mRNA의 현지화 기능의 시각화 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/50057/50057fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. RNA 프로브 준비 절...

여기 우리는 전체 마운트 형광을 설명<em&gt; 현장에서</em과일 플라이의 embryogenesis 동안 표현 RNAs의 표현 및 현지화 특성을 결정하기위한&gt; 하이브리드 (물고기) 프로토콜,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

이 절차는 전체 마운트 초파리 배아에서 RNA의 발현 및 국소화 기능을 평가하기 위해 최적화된 어류 방법을 설명합니다. 이는 먼저 적절하게 선택된 DNA 템플릿의 시험관 내 전사를 통해 관심 있는 Mr NA 또는 코팅되지 않은 RNA를 보완하는 라벨링된 RNA 프로브를 합성함으로써 수행됩니다. 이와 병행하여 파리 개체군 케이지는 원하는 발달 단계의 배아를 채취, 고정 및 침투하는 데 사용됩니다.여러 번의 고정 후 단계 후에 배아는 표지된 안티센스 RNA 프로브와 혼성화됩니다. 마지막으로, 샘플을 광범위하게 세척한 후, 혼성화된 프로브는 특정 항체 및 형광 색소 접합 검출 시약으로 면역 라벨링을 통해 검출되므로 표적 RNA 분포에 대한 민감한 판독값을 제공합니다. 궁극적으로, 그 결과는 초파리 배발생 중 표적 RNA의 공간적 및 시간적 발현 특징을 문서화하기 위해 표준 형광 현미경으로 분석되는 고도로 분리된 형광 신호를 생성합니다.노던 블롯 또는 R-T-P-C-R과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 온전한 조직 표본 내에서 RNA 발현을 평가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 초기 초파리 배아에서 RNA 발현 특성을 분석하기 위한 것이지만 유충 또는 성충 파리에서 절개된 조직의 후기 발달 단계에서 배아를 분석하는 데에도 사용할 수 있습니다. 우리 절차의 중요한 측면은 PCR 장소에서 물고기를 수행하여 달성할 수 있는 샘플 수를 늘리는 것이며, 이는 접근 방식의 처리량을 크게 증가시킵니다.이 절차를 시연하는 연구실 구성원에는 학부생, 대학원생 및 박사 후 연구원이 포함됩니다. 잘 먹인 개체군 우리부터 시작하십시오. 접시를 사과 주스 효모 플레이트로 교체하고 섭씨 25도에서 한 시간 동안 파리를 그대로 두십시오.그런 다음 사과 주스 효모 플레이트를 교체하여 초기 단계의 배아를 채취합니다. 섭씨 25도에서 케이지를 배양하고 배아의 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 기다렸다가 화학 물질 후드에서 기다리는 동안 화학 물질을 혼합하여 유리 흡입 바이알에서 37%포름알데히드를 만듭니다. PFA 분말이 완전히 용해될 때까지 용액을 끓였습니다.그런 다음 실온으로 식히고 새 섬광 바이알에 걸러냅니다. 다음으로, biphasic fixation solution을 준비합니다. 섬광 바이알에 PBS와 37% 포름알데히드를 결합한 다음 준비가 되면 헵탄을 추가합니다.사과 주스 접시에서 배아를 실온, 수돗물, 고운 붓으로 섬세

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될...

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

이 원고 X를 생성 하는 자세한 방법을 제공-염색체 팔 프로브 및 수행 형광 제자리에서 교 잡 (물고기) 자매의 상태를 검사 하 chromatid 응집력 prometaphase 및 를 체포 하는 분열 초파리 oocytes. 이 프로토콜은 meiotic 팔 단결력은 그대로 또는 다른 genotypes에 방해 여부 결정 하는 데 적합 합니다.

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

여기에서, 우리는 초파리 배아 단백질 및 RNA의 검출 및 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다 수집에서 사전-포베딩 및 포매, 면역염색, 및 mRNA 를 계내 혼성화에 이르게 한다.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

학습하세요 Drosophila melanogaster 태아에서 RNA 발현과 위치를 분석하는 전체 마운트 형광 현장에서 하이브리드(FISH) 기법을. 이 최적화된 프로토콜은 발달생물학 연구자들이 고해상도로 RNA 분포를 시각화하여 유전자 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

전체 마운트 RNA 형광

더 많은 동영상 탐색