Name: 생체 내 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 생체 내 혈관 투과성 분석법을 통해 내피세포 기능과 혈관 질환 메커니즘을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기법은 마우스 모델에서 엘붐민 결합 염료를 사용하여 혈관 장벽 손상을 정량적으로 평가합니다.

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이 작품은 국립 보건원, R01CA142928의 교부금에 의해 지원되었다.

1. 마우스 측면 꼬리 정맥에 에반스 블루의 정맥 주사 <ol><li> PBS에서 에반스 파란색의 0.5 % 살균 솔루션을 준비합니다. 필요한 경우, 용해되지 않은 미립자를 제거 할 수있는 솔루션을 필터 소독. </li><li> 주사기에 200 μl 에반스 블루 솔루션을 기음. 주사기로 탈출했을 수도 모든 기포를 사용하지 마십시오. </li><li> 동물이 자유롭게 이동하지 않지만 꼬리가 처리 할 수​​ 있도록 구속 장치에 8-12주 오래된 곳 마우스. </li><li> 그래서 측면 꼬리 정맥을 쉽게 볼 수 있으며 위쪽으로 직면하고있다 그 쪽 마우스 덮개 장치를 놓습니다. </li><li> 엄지와 집게 손가락 사이의 비 지배적 인 손으로 정신 차려라. </li><li> 머리의 방향에 대한 측면 꼬리 정맥에 10 ~ 15도 각도, 베벨까지 사전에있는 바늘 (작은 게이지, 27-30)를 삽입합니다. 꼬리에 바늘과 주사기 병렬세요. </li><li> 디O이 정맥을 축소 하듯이 적절한 위치를 확인하는 압력을 다시 적용하지. </li><li> 천천히 마우스의 꼬리 정맥에 200 μl 에반스 블루 솔루션을 주입. </li><li> 플런저 진보가이 같은 정맥에 바늘의 올바른 위치의 증명되는 편의성을 관찰합니다. </li><li> 그 케이지에 다시 마우스를 넣고 30 분 동안을 관찰합니다. </li></ol> 2. 기관에서 장기 수집 및 에반스 블루의 추출 <ol><li> 자궁 경부 전위를 통해 쥐를 희생. 이 혈관 투과성과 상당한 간섭을 제한 마일 분석을 위해 자궁 경부 전위 권장합니다. 한 빨리 가능한 한 같은 시간에 모든 쥐를 희생. 죽음의 혈관이 더 융화가 될 직후에 있기 때문에, 6 생쥐 이하의 동료들과 협력합니다. </li><li> 자신의 뒤를에 마우스를 놓고 화이트 보드에 발을 고정. </li><li> 토르을 폭로 할 수있는 복부 및 흉부 캐 버티를 엽니 다acic 및 복부 기관. </li><li> 에반스 블루 넘쳐 흐름의 차이를 보여 대표 사진을 찍습니다. 모든 마우스에 동일한 조명 조건이하기 위해 같은 필드에있는 모든 쥐를 포함합니다. </li><li> 관심 장기를 수집하고 1.5 ML 튜브에 넣어 </li><li> 빈 관을 무게 0으로 균형 값을 가져. </li><li> 조직 샘플을 전송하고 무게. 모든 조직 샘플에 대한 반복합니다. 조직은 공기가 다른 장기 사이의 물 내용 변화를 제거하기 위해 건조 할 수 있습니다. </li><li> . 각 조직 샘플 튜브에 500 μl 포름 아미드를 추가합니다. </li><li> 55 ° C의 물을 욕조 또는 열 블록에 대한 모든 튜브를 전송합니다. 조직에서 에반스 블루를 추출 할 수 있도록 24-48 시간에 품다. </li></ol> 3. 에반스 블루의 정량화는 중간 조직에 Extravasated <ol><li> 펠렛 남아있는 조직 조각에 포름 아미드 / 에반스 블루 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 610에서 흡광도를 측정NM. 빈으로 500 μl 포름 아미드를 사용합니다. </li><li> 계산 NG 에반스 블루 MG 조직 당 extravasated. </li><li> 그래프의 모든 데이터를 하겠나. </li><li> 큰 차이를 결정하기 위해 통계 분석을 수행합니다. </li></ol>

<ol><li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+NO+synthase%3A+role+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li>
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</ol>

저자는 갈등이나 경쟁 금융 이익이 없습니다.

혈관 투과성는 혈관 상태에 대한 중요한 표시입니다. 증가 혈관 투과성은 당뇨병, 고혈압, 그리고 면역 질환 6,7,8 등 여러 조직 질환에 존재하는 표시되었습니다. 증가 혈관 투과성이 전단 응력에 의해 중재 할 수 표시되었습니다 혈관 내피 성장 인자와 섬유 아세포 성장 인자, 세로토닌, 히스타민, 9 bradykinin과 같은 염증성 중재자 같은 성장 요인에 따라 결정됩니다. 물과 작은 분자의 넘쳐 흐름은 내피 세포 사이의 작은 구멍을 통해 발생하는 것으로 생각됩니다. 휴대 전화의 접합의 강도는 엄격히 분자 열 간의 상호 작용에 의해 조절된다. 생리적 조건에서 내피 물과 이온에 대한 투과성, 그리고 단백질에 불 침투성입니다. 따라서, 염증 자극의 부재에서, 알부민은 혈액의 흐름을 제한하고 세포 외액으로 이동하지 않습니다. E를 주입하여밴 블루, 알부민 결합 염료, 우리는 중간 조직에 혈액 스트림에서 단백질 누출의 범위...

선택적 투과성 장벽의 형성 및 유지 보수 적절한 장기 개발 및 성능 1,2에 필수적입니다. 내피 세포 라인 혈관 내강하고 혈액 모든 기관의 중간 공간 사이의 선택 전송에 필수적인 반 투과성 장벽을 형성하고 있습니다. 적절한 투과 장벽은 엄격하게 성장 요인 크린 시토 킨 및 기타 스트레스 관련 분자 세에 의해 제어됩니다 꼭 휴대 전화의 접합을 통해 유지됩니다. 내피 세포 장벽의 파괴가 증가 투자율과 혈관 누출이 발생할 수 있습니다. 이러한 효과는 다양한 질병 상태에서 볼 수 있으며 밑줄 분자 신호의 이해 학제 방법은 4,5이 필요합니다. 이 문서에서는, 우리는 마우스 모델을 사용 선박 투자율을 측정하는 생체 방법에 대해 설명합니다. 또한 마일 분석으로 알려진 우리가 설명하는 분석은 잘 establ입니다생체에 혈관 투과성을 테스트하는 방법을 ished. 검정은 기초 생리 조건 하에서, 알부민은 내피 장벽을 통과하지 않는 사실에 기반을두고 있습니다. 에반스 블루, 알부민 높은 친 화성이있는 아조 염료는 실험 동물의 혈액 스트림에 주입되고, physiologic 조건 하에서,이 혈관 내에서 제한 될 것으로 예상된다. 혈관 투과성의 자극이 추가되면, 어느 붙이기 또는 체계적으로, 혈관은 알부민에 바인딩 된 에반스 블루는 또한, 따라서 단백질을 누설하기 시작합니다. 투과성의 혈관이 조직의 급속한 푸른 착색에있는이 결과. 마우스 측면 꼬리 정맥에있는 염료를 성공적으로 주입 실험의 좋은 결과에 중요합니다. 꼬리 정맥 주입 기술은 광범위한 연습이 필요하고 실험을 시작하기 전에 마스터해야합니다. 선박 투자율은의 연령과 체중에 크게 의존imal 때문에 다른 마우스 변종을 비교하면은 마우스 또는 기타 시험 과목이 동일 출생 날짜와 무게에 가까운 있다는 필수적입니다. 내피 장벽의 투과성에 영향을 미치는 다른 요소는 온도, 습도 등의 환경 조건이며, 매우 중요한 마우스의 처리 스트레스. 실험의 결과에 영향을 미칠 수 요인의 다양한 때문에이 실험은 적어도 세 배 및 통계 분석 수행 반복되는 항상 좋습니다. 이 분석은 선박 유전자 변형 된 쥐 투자율뿐만 아니라 다른 유전 배경을 가진 쥐를 비교하거나 사용할 수 있습니다. 투자율이 변조되는 유전자의 기능에 따라 자극의 유무에 평가 될 수있다. 이 분석은 또한 혈관 투과성에 대한 서로 다른 화합물의 효과를 테스트하거나 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 에반스 BLUE </td><td> 시그마 </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 0.2M 인산 1.5M NaCl 산도 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 덮개 장치 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> 바늘의 게이지는 동물의 크기에 따라 달라집니다. </td></tr><tr><td> 균형 </td><td> 덴버 INSTRUMENT </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; 생체 내</em혈관 투과율을 테스트하려면&gt; 분석

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

이 메소드는 테스트 동물 모델 쥐 에반스 블루의 정맥 주사를 기준으로합니다. 에반스 블루는 알부민 결합 염료입니다. physiologic 조건 내피는 알부민에 불 투과성이기 때문에, 에반스 블루 바운드 알부민 유적은 혈관 내에 제한. 증가 혈관 투과성 내피 세포를 촉진 pathologic 조건에서 부분적으로 자신의 가까이에 연락처를 잃게 내피는 알부민과 같은 작은 단백질 투과성이됩니다. 이 조건은 조직의 에반스 블루의 넘쳐 흐름 할 수 있습니다. 건강한 내피는 인근 vascularized의 조직에 염료의 넘쳐 흐름을 방지합니다. 증가 투자율과 기관은 그대로 내피와 장기에 비해 크게 증가 파란 착색를 표시합니다. 혈관 투과성의 수준은 간단한 시각화 또는 실험 동물 / 조직 대 제어 조직의 밀리그램 당 통합 염료의 양적 측정에 의해 평가 될 수있다. 두 포웨이 분석의 rful 측면은 단순성과 양적 특성입니다. 에반스 블루 염료는 포름 아미드의 조직의 특정 금액을 잠복기에 의해 조직에서 추출 할 수 있습니다. 에반스 블루 흡광 최대 620 나노 미터에 있으며 흡광도 최소 740 nm의에 있습니다. 에반스 블루에 대한 표준 곡선을 사용하여 광학 밀도 측정은 조직의 밀리그램 당 캡처 밀리그램 염료로 변환 할 수 있습니다. 통계 분석은 혈관 투과성에 큰 차이를 평가하기 위해 사용되어야합니다.

우리는 8~12주 기존 마우스에 혈관 누출을 테스트하기 위해 생체의 투자율 분석에를 사용했습니다. 이 테스트는 서로 다른 유전 배경의 동물 간 또는 vasculature에 영향을 미칠 치료를 받게 마우스의 단일 변종에 상대적으로 혈관 투과성을 비교에 유용합니다. 우리의 결과는 우리 실험실에서 만든 유전자 변형 쥐의 변종이 야생 형 생쥐에 비해 좀 더 투과성의 내피를 가지고 보여줍니다. 이러한 변화는 많은 기관에서 매크로 레벨 (그림 1)에 분명합니다. 우리는 spectophotometricaly 다른 기관에 조직 g 당 캡처 된 에반스 블루를 측정하여 혈관 투과성의 차이를 정할 수있었습니다. 우리가 그림에서 관찰로 2 개의 다른 기관 투과 유도 인자 신호에 다른 응답을 보여하므로 서로 다른 염료 축적을 보여줍니다. 이것은 또한 다른 조직의 vascular...

우리는을 받​​게된다고?<em&gt; 생체 내</em&gt; 혈관 투과성을 테스트하는 시험. 이 분석은 간질 공간으로의 확산 염료 및 그 이후의 시각화 정맥 주사에​​ 기반을두고 있습니다.

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

이 영상에서는 혈관 투과성을 테스트하는 in vivo 분석법을 소개합니다. 마우스의 경우, 혈관 내피세포가 혈관 벽을 형성하여 반투과성 장벽을 이룹니다. 생리학적 조건에서 내피세포는 대부분의 단백질에 대해 불투과성이므로, 단백질들은 혈류 내에 제한됩니다.혈관 투과성 증가를 촉진하는 병리적 상태에서는 내피세포 간의 접촉이 부분적으로 소실됩니다. 이로 인해 내피층은 알부민과 같은 작은 단백질에 대해 투과성을 갖게 됩니다. 본 분석법에서는 내피 투과성이 증가한 상태에서 알부민과 결합하는 청색 염료를 정맥 주사합니다.D는 내피 장벽을 통과하여 간질 공간으로 확산됩니다. 이는 결과적으로 실험 시작 전 해당 조직이 푸른색으로 착색되는 결과로 이어집니다. 필요한 모든 재료와 피펫, 멸균 팁을 준비하십시오.Evans blue, 멸균 스패튤라, 멸균 PBS, 멸균 주사기 및 바늘. 마우스, 마우스 보정기, 해부 도구, 해부판 및 핀. 분석 저울, 55 °C 수조용 히팅 블록.C.Vet 분광광도계를 사용하여 Evans blue 분말의 무게를 측정하고 멸균 튜브로 옮깁니다. 멸균 PBS를 추가하여 0.5% 작동 농도로 조제합니다. 200 µL의 Evans blue 용액을 주사기로 천천히 흡입합니다.모든 기포를 제거하고, 주사기 내에 남아 있는 기포가 있다면 완전히 없앱니다. 마우스가 크게 움직이지 않으면서도 꼬리를 다룰 수 있도록 보정 기구에 넣습니다. 보정 기구를 옆으로 눕혀 외측 꼬리 정맥이 위를 향하고 쉽게 보이도록 배치합니다.비우세손의 엄지와 검지로 꼬리를 잡습니다. 꼬리 기부에 압력을 가하여 지혈대 역할을 하도록 합니다. 바늘을 10도 각도로 삽입합니다.바늘의 사면(bevel)이 위를 향하게 하여 정맥 속으로 진입시킵니다. 바늘과 주사기를 꼬리와 평행하게 유지하십시오. 바늘이 정맥에 제대로 위치했는지 확인하기 위해 역압을 가하지 마십시오.정맥이 허탈될 수 있으므로 200 µL의 Evan Blue 용액을 꼬리 정맥에 천천히 주입하십시오. 플런저가 부드럽게 밀려 들어가는지를 관찰하며, 이는 정맥 내에 바늘이 정확히 위치했음을 증명하는 것입니다. 바늘이 정확하게 삽입되었다면, 바늘을 제거한 후 작은 혈적(blood drop)이 나타납니다.출혈이 멈출 때까지 배출 부위를 압박합니다. 마우스를 케이지에 다시 넣고 30분 동안 관찰합니다. 마우스를 희생시킨 후 화이트보드에 고정합니다.본 영상에서는 대조군 생쥐와 내피 세포의 무결성을 조절하는 유전자가 결핍되도록 유전자 조작된 생쥐를 모두 제시합니다. 복강과 흉강을 열어 장기를 노출시킨 후, 관심 장기를 수집하여 eend DPH 튜브에 넣으십시오. 이 과정 전에 생쥐의 사체를 폐기하십시오.관심 있는 모든 장기의 대표 사진을 확보하십시오. 새로운 튜브 세트에 라벨을 붙이고, 빈 튜브의 무게를 측정합니다. 저울의 수치를 0으로 맞춘 다음, 조직 샘플을 튜브로 옮겨 무게를 측정하십시오.모든 샘플에 대해 동일하게 반복합니다. 각 튜브에 mite 500 µL를 추가합니다. 모든 튜브를 55 °C 가열 블록 또는 항온 수조로 옮깁니다.모든 조직에서 Evans blue를 추출하기 위해 24~48시간 동안 배양한 후, 600 nm 파장에서 흡광도를 측정합니다. 공시료(blank)로는 500 µL의 IDE를 사용합니다. 각 샘플의 광학 밀도를 측정합니다.이 단계에서 혈관 투과성의 유의미한 차이를 쉽게 관찰할 수 있습니다. 조직 1mg당 유출된 Evan Blue의 나노그램(ng) 수를 계산하십시오.모든 데이터를 그래프로 도식화하십시오. M assay로도 알려진 해당 방법은 실험 시작 전 생쥐의 혈관 투과성을 테스트하는 데 사용됩니다. 꼬리 정맥 주사는 광범위한 연습이 필요한 기술이므로 완전히 숙달해야 합니다. 결과는 정지 영상과 정량적 측정값으로 모두 기록해야 하며, 항상 분자 분석이 병행되어야 합니다.혈관 투과성은 환경 조건 외에도 동물의 연령과 체중에 크게 의존합니다. 따라서 실험을 최소 3회 반복하고 통계 분석을 수행해야 합니다.

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우리는 쥐에 있는 고분자량 (155 kDa) dextran의 정맥 주입을 사용하여 전이 (TMEM) 출입구 기능 및 암 세포 intravasation의 종양 미세 환경과 관련되었던 과도 혈관 투과성을 평가하기 위한 2개의 방법을 기술합니다. 방법은 살아있는 동물에 있는 활력 화상 진찰 및 면역 형광을 사용하여 고정된 조직 분석을 포함합니다.

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