철 소스로 인간 혈색소를 사용하여 황색 포도상 구균 성장

이 실험은 인간의 헤모글로빈을 유일한 철분 공급원으로 활용하는 황색포도상구균의 능력을 테스트합니다. 먼저 신선한 인간 혈액에서 적혈구를 분리합니다. 헤모글로빈의 무결성을 보장하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피로 헤모글로

이제 헤모글로빈을 철이 고갈된 배지에 첨가하여 헤모글로빈 다음 배양의 형태로 철을 공급합니다. S 레우스. 헤모글로빈의 존재 하에서 헤모글로빈을 철분 공급원으로 활용하는 능력을 측정합니다.

결과는 reus가 유일한 철분 공급원으로 헤모글로빈이 존재할 때 증식한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 병원체가 숙주 단백질을 철의 공급원으로 활용할 수 있는지, 이 과정을 사용하여 철을 활용하는 데 어떤 메커니즘이 필요한지 여부와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 방법은 헤모글로빈에서 포도상구균의 철 획득에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 다른 박테리아에 대한 연구와 숙주의 철분 함유 단백질을 사용하는 방법에 적용할 수 있습니다. 이 기술을 시연하는 것은 제 연구실의 GLA Ani와 Catherine Haley입니다. 첫째로, 항응고제로 보충된 갓 고립된 인간적인 혈액을 얻고 정화 내내 4 섭씨 온도에 15, 000 Gs.Carefully 흡인에 20 분 동안 원심 분리에 의하여 적혈구를 유지하고, snat를 부드럽게 흡인하고 얼음 감기, 0.9%sodium 염화물 해결책에 있는 펠릿을 3개의 세척 후에, resus, 얼음 찬 10 millimolar triss의 1개의 양에 있는 펠릿을 중단하십시오, HCL을 삼투압에 의해 적혈구로 이동합니다.

그런 다음 톨루엔을 최종 부피의 20%에 추가하고 로터에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 원심분리기. 20, 1 시간 당 000 Gs에 lysate.

중간 용혈물 분획을 수집하고 상부 톨루엔 층과 펠릿을 방해하지 않습니다. 용혈액을 0.44마이크로미터 주사기 필터에 통과시킵니다. 용액에 미립자 물질이 포함되어 있고 필터를 통과할 수 없는 경우 고속 원심분리를 반복하십시오.

이제 고성능 액체 크로마토그래피 음이온 교환 컬럼으로 헤모글로빈을 정제하십시오. 10 millimolar tris, HCL의 이동상 A와 10 millimolar tris, HCL과 0.5 molar sodium chloride의 이동상 B를 사용합니다. 분당 2밀리리터의 유속으로 2분에 걸쳐 0%에서 100%의 용매 B 경사를 실행합니다.

410나노미터 및 280나노미터에서 흡수를 기반으로 용리를 모니터링합니다. 밝은 붉은 색과 눈에 띄는 흡수 피크를 특징으로하는 분획을 수집합니다. 약 16시간 동안 인산염 완충 식염수에 대한 용출을 투석합니다.

샘플을 멸균하려면 헤모글로빈 농도를 측정하기 위해 0.22마이크로미터 주사기 필터를 통과시킵니다. PBS에서 HP 표준 솔루션을 준비합니다. 이제 표준 용액 또는 샘플 용액을 96웰 플레이트에서 1:1 비율로 혼합하고 540나노미터에서 흡광도를 15분 동안 측정한 후

표준 곡선을 플로팅하고 샘플의 HP 농도를 밀리리터당 5-15밀리그램으로 측정합니다. 수율은 2개의 15%STS 페이지 겔에서 15-20마이크로그램의 정제된 헤모글로빈 샘플의 일반적인 부분 표본입니다. 겔 중 하나를 염색하고 다른 겔의 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨 헤모글로빈을 동결하기 위한 면역 블롯을 만들고 삼부작, 대두 한천에 냉동 스톡 줄무늬 S aureus에서 액체 질소에 분리된 헤모글로빈의 분취액 1밀리리터를 저장하고 섭씨 37도에서 20-24시간 동안 배양합니다.

E-D-D-H-A를 함유한 5ml의 RPMI에 단일 콜로니를 접종하고 섭씨 37도에서 배양하고 하룻밤 동안 180RP M에서 진탕합니다. 7, 500 Gs.Then Resus에 5 분 동안 원심 분리에 의하여 박테리아를 펠릿으로 만들고, 0.5 millimolar E-D-D-H-A를 포함하는 RPMI에 있는 박테리아를 중단하고, 대략 3의 OD 600에 정상화하십시오. 다음으로, 밀리리터당 2.5마이크로그램, HB 및 0.1 내지 1밀리몰 E-D-D-H-A를 함유하는 N-R-P-M-I를 제조하여 유리 철을 킬레이트화합니다.

이제 10마이크로리터의 박테리아 현탁액을 1밀리리터의 N-R-P-M-I와 E-D-D-H-A 및 HP로 과소배양하여 섭씨 37도에서 최대 48시간 동안 배양물을 배양하고 6-12시간마다 180RRP M에서 진탕합니다. 96개의 웰 플레이트에서 50마이크로리터의 배양 혼합물과 150마이크로리터의 PBS를 제거하고 OD 600 판독값을 취합니다. 용혈액에서 인간 헤모글로빈의 이 HPLC 정제에서 280 및 410 나노미터 파장에서 용리액의 흡수는 헤모글로빈을 포함하는 분획 5로 측정됩니다.

일반적으로 제제당 밀리리터당 5-15밀리그램의 헤모글로빈을 얻을 수 있습니다. 정제된 헤모글로빈은 SDS 페이지에 의해 중복으로 분석되었으며, 겔은 단백질을 의미하거나 니트로셀룰로오스 및 면역 블로트로화되었습니다. 다음으로, 정제된 인간 헤모글로빈은 헤모글로빈 유래 철분 획득에 필요한 헤모글로빈 수용체가 결핍된 야생형 아수스 및 ASUS의 성장을 지원하는 능력에 대해 테스트되었습니다.

시간이 지남에 따라 배양물의 광학 밀도가 증가한다는 것은 N-R-P-M-I 플러스 E-D-D-H-A 플러스 hb에서 야생형 ASUS가 증식하지만 돌연변이는 그렇지 않음을 나타냅니다. 대조적으로, 보충된 유리 철을 활용하는 능력은 야생형과 돌연변이 균주 모두에서 동일하며, 공급원이 없는 경우 둘 다 증식하지 않습니다. 신선한 혈액에서 정제된 헤모글로빈 또는 동결건조된 헤모글로빈으로 보충된 배지를 비교한 결과, 혈액에서 정제된 헤모글로빈은 성장을 위해 ISDB가 필요합니다.

동결건조된 헤모글로빈은 ISDB 돌연변이의 증식을 가능하게 하지만, 일단 숙달되면 헤모글로빈의 적절한 정제는 몇 시간 내에 완료될 수 있습니다. 기증자는 혈액 매개 병원체의 잠재적 보균자이므로 인간의 혈액을 생물학적 위험 물질로 취급하십시오.