Name: 철 소스로 인간 혈색소를 사용하여 황색 포도상 구균 성장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 배우세요 황색포도상구균이 인간 혈색소를 철 소스로 활용하는 성장 분석법을. HPLC 정제와 철 결핍 배지를 사용하여 병원균의 철 대사 메커니즘을 연구하고 치료 전략 개발에 활용합니다.

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이 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 미국 공중 보건 서비스 보조금 AI69233 및 AI073843에 의해 지원되었다. EPS는 전염병의 Pathogenesis에 버로우즈 웰컴 동지이다. KPH는 세포 및 분자 미생물학 교육 보조금 프로그램 5 T32 A107611-10로 운영되었습니다.

1. 신선한 혈액에서 헤모글로빈의 정화 <ol><li> 항응고제로 보충 신선한 인간의 피를 취득. 정화에 걸쳐 얼음이나 4에 혈액 ° C세요. </li><li> 1500 X g에서 20 분 피를 원심 분리기. 적혈구은 (적혈구) 튜브의 하단에 있습니다. 조심스럽게 표면에 뜨는을 대기음 부드럽게 얼음처럼 차가운 0.9 % (w / V) NaCl 용액에서 펠렛을 resuspend. 원심 분리를 반복 3 회 씻는다. </li><li> 얼음처럼 차가운 10 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) 1 볼륨에 펠렛을 Resuspend. 이 삼투압에 의한 적혈구의 용해를 유도합니다. ~ 20 % 최종 볼륨에 톨루엔을 추가합니다. </li><li> 밤새 회전 통닭에 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 1 시간에 20,000 XG에서 lysate를 원심 분리기. 톨루엔 (상단에 떠있는)와 펠렛 훼손되지 않은 떠나 중간 hemolysate 분수를 수집합니다. 중앙 분수를 수집하는 긴 목 피펫을 사용합니다. </li><li> 0.44 μm 주사기 필터를 통해 전달합니다. 솔루션은 미립자가 포함 된 경우물질과는 단계 1.5를 반복 필터를 통과 할 수 없습니다. </li><li> 고성능 액체 크로마토 그래피와 헤모글로빈 (HB)를 정화 (HPLC) 음이온 교환 컬럼 (Varian, PL-SAX 1000 8 μm, 150mm × 4.6 mm). 이 모바일 상 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) 및 모바일 상 B 10 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) + 0.5 M NaCl이다 10. 용매 B의 0 % -100 %의 기울기는 2.0 ML / 분 유량에서 2 분 동안 실행됩니다. (: 410 nm의와 280 nm의 λ) 용출는 흡수를 기반으로 모니터링된다. 밝은 붉은 색과 눈에 잘 띄는 흡수 피크 (그림 1)을 특징으로 만 일부를 수집합니다. </li><li> 에 대한 용출을 Dialyze 인산염 버퍼 다시 생리 (PBS) 밤 한 다음 몇 시간 동안. 0.22 μm의 주사기 필터를 통과하여 소독. </li><li> HB 농도를 측정하기 위해 PBS에 알려진 농도의 표준 HB 솔루션을 준비합니다. (우리 시약과 표를 참조 표준 솔루션을 혼합하여 샘플에 HB의 농도를 결정에드) 또는 1:1의 비율로 2 배 Drabkin의 시약 (가루로 만든)과 샘플 솔루션입니다. 예를 들어, 96 - 웰 플레이트에 100 μl 배 Drabkin의 시약을 100 μl HB 솔루션을 섞는다. 540 나노 미터에서 15 분 및 측정 흡광도에 품다. 표준 곡선을 그리기 및 샘플에있는 HB 농도를 결정한다. 다섯 데 15 MG / ML 생산량은 전형적인 있습니다. </li><li> 복제에 15 % SDS-PAGE에서 헤모글로빈을 정화 15-20 μg을 실행합니다. 젤 중 하나를 청바지, 헤모글로빈의 니트로 셀룰로스 막과 immunoblot (그림 2)에 다른 겔에서 단백질을 전송합니다. </li><li> 고정 및 액체 질소에 헤모글로빈의 1 ML의 aliquots를 저장합니다. </li></ol> 2. 의 준비 철 고갈 성장 미디어 <ol><li> 제조업체와 1% cassamino의 산 (CA) (w / V)에서 권장하는대로 나트륨 중탄산염을 추가 물에 RPMI 분말을 용해하여 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 국물을 준비합니다. 0.2 μm 필터 및 매장 refrig를 통과하여 소독erated. </li><li> 7% (w / V) Chelex 100를 추가하고 저어 접시에 하루 아침에 혼합하여 금속 소모 RPMI (NRPMI)를 준비합니다. 0.2 μm 필터 및 매장 냉장를 통과하여 Chelex 100 제거합니다. 25 μM ZnCl 2, 25 μM MnCl 2, 100 MM CaCl 2, 1 ㎜ 무균 1000 X 솔루션으로 사전에 준비 MgCl 2 : 필수 비 철 금속과 미디어를 보완. 재사용 가능한 물품의 철 오염을 방지하기 위해이 단계에 대한 일회용 플라스틱 용기를 사용하십시오. </li></ol> 단독 철 소스로 혈색소를 사용하여 3. 포도상 구균 성장 <ol><li> 연속 S. 냉동 가공에서 tryptic 간장 한천 (TSA)에 절연을위한 구균. 20-24 시간에 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> Resuspend ethylenediamine-N, 100 mm까지 무수 에탄올에 N&#39;-비스 (2 - hydroxyphenylacetic 산) (EDDHA). EDDHA이 솔루션에 들어갈 것이 아니라 에탄올의 소독을합니다. </li><li> 0.5 mm의 최종 농도에 RPMI에 EDDHA을 추가합니다. 허용EDDHA은 다음 단계로 진행하기 전에 최소 30 분 동안 분해합니다. 배치 - 투 - 배치 변화로 인해, 최종 EDDHA 농도는 박테리아 성장을 허용하는 0.25 mm까지 낮아해야 할 수 있습니다. </li><li> S.의 한 식민지의 예방 RPMI 15 ML 나사 캡 원추형 튜브에 EDDHA를 포함하는 5 ML에 구균. 16-20 시간에 대한 분 (RPM) 당 180 회전에서 진동으로 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 7500 XG에서 5 분의 밤 문화를 원심 분리기와 NRPMI이 0.5 밀리미터 EDDHA을 포함에 펠렛을 resuspend. ~ 3 OD 600 정상화. </li><li> NRPMI는 ML HB 당 2.5 μg과 0.1-1.0 밀리미터 EDDHA을 포함하는 준비합니다. 배치 사이의 차이로 인해 NRPMI에서 무료 철을 킬레이트하는 데 필요한 EDDHA 농도가 다를 수 있습니다. </li><li> 15 ML 나사 캡 원추형 튜브 1 ML NRPMI + EDDHA + HB로 단계 3.5에서 세균 현탁액의 하위 문화 10 μl. </li><li> 180 rpm으로 또는 회전 드럼에 진동을 최대 48 시간까지에 대해 37 ° C에서 문화를 품다. </li><li&gt;을 모든 6-12 시간은 96 - 웰 플레이트에 문화의 50 μl를 제거하고 PBS 150 μl로 혼합하여 OD 600 판독을. </li></ol>

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우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

철은 인생 15 모든 왕국에서 생물에 필요한 필수 영양소입니다. vertebrates에서, 철은이 요소로 인한 독성을 피하기 위해 분리되어 있습니다. 이 격리은 영양 면역 16로 알려진 과정에 미생물을 침해에서 철을 은폐합니다. 대응 병원균은 영양 면역을 회피 전략을 발전시켜 왔습니다. 하나의 메커니즘 헤모글로빈에 의존되는데,이 호스트 17에서 철의 가장 풍부한 원천입니다. 헤모글로빈은 적혈구 안에 포함되어 있습니다. 손상된 적혈구에서 출시 혈색소는 대 식세포 18 일 haptoglobin - 헤모글로빈 단지의 급속한 제거 신호를 호스트 haptoglobin에 의해 구속된다. 헤모글로빈에 액세스하기 위해, S. 구균은 적혈구에게 19 lyse hemolysins을 표현한다. Haptoglobin 유도 헤모글로빈 제거는에 의해 표현 세포 표면 수용체에 의해 헤모글로빈의 높은 친 화성 바인딩에 의해 반박된다 <em&g...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> HPLC의 음이온 교환 컬럼 </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Drabkin의 시약 </td><td> 시그마 </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> 헤모글로빈 표준 </td><td> 포인트 과학 </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex 100 나트륨 양식 </td><td> 시그마 </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC 표준 GmbH의 </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> 헤모글로빈 항체 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) 생명 공학, Inc의 </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> Tryptic 콩 한천 </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

철 소스로 인간 혈색소를 사용하여 황색 포도상 구균 성장

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. 구균이 중요한 신진 대사 기능과 원인 질환을 수행 할 철 필요로하는 병원성 세균입니다. 인간의 호스트 내부의 철의 가장 풍부한 저수지는 헤모글로빈의 cofactor이다 헴입니다. 헤모글로빈의 철을 취득하려면, S. 구균은 철 - 규제 표면 결정자 (Isd) 시스템 1로 알려진 정교한 시스템을 활용합니다. Isd 시스템 첫째 바인드 호스트 헤모글로빈의 구성 요소는 다음 추출하고 헴을 가져, 그리고 마지막으로 박테리아 세포질 2,3에 헴의 철을 해방. 이 경로는 체외 연구 4-9에서 수많은 통해 해부되었습니다. 또한, 감염 Isd 시스템의 후원금이 반복적으로 마우스 모델 8,10-14에서 입증되었습니다. 헤모글로빈 - 파생 철 수집에 Isd 시스템의 기여를 설립하고 성장은 점점 더 어려워 것으로 증명되었습니다. 단독 철 소스로 헤모글로빈을 사용하여 성장 assays는 B 복잡y는 성장 매체에 무료로 철을 오염 상업적으로 이용 가능한 헤모글로빈의 불안정, 그리고 철 chelators과 관련된 독성. 여기 우리는 이러한 한계를 극복하는 방법을 제시한다. 고품질의 헤모글로빈은 신선한 혈액 준비되어 있으며 액체 질소에 저장됩니다. 정화 헤모글로빈이로 보완되어 매체는 척추 호스트 내부의 병원균에 의해 발생 철 - 가난한 환경을 모방 철 (iron) - 고갈시킵니다. S.를 굶주리고하여 무료 철의 구균과 우리가 헤모글로빈을 묶는 헴를 추출, 세균 세포 봉투를 통해 헴에 합격하고 세포질에서 헴을 저하 할 수있는 능력에 전적으로 의존하는 방식으로 성장을 유도 헤모글로빈의 최소한 조작 양식을 보완. 이 분석은 S.에 hemoglobin-/heme-derived 철 획득의 메커니즘을 명료하게하다하고자하는 연구자에 유용합니다 구균 및 기타 세균 병원체.

우리는 HPLC (프로토콜 단계 1.7)로 hemolysate 인간의 헤모글로빈을 정화하고 있습니다. 그림 1은 쇼 280과 410 나노 미터 파장에서 eluate의 흡광도를 기록. 비율 5 수집 된 및 다른 분수이 삭제되었습니다. eluate의 밀리리터 당 헤모글로빈의 5-15 밀리그램의 생산량은 일반적으로 취득하고 있습니다. 정화 헤모글로빈이 중복으로 SDS-PAGE에 의해 분석되었으며 젤은 어느 단백질에 물들 또는 니트로 셀룰로스에 전송 된 및 (프로토콜 단계 1.10, 그림 2) immunoblotted. 우리는 야생 유형의 성장을 지원하기 위해 인간의 헤모글로빈을 정화하는 능력을 평가 한 S. 구균과 S. Isd 시스템 (Δ isdB)의 IsdB 구성 요소를 결여 구균. IsdB는 헤모글로빈 파생 철 취득 12 필요합니다 헤모글로빈 수용체입...

여기에 대한 성장 분석을 설명<em&gt; 포도상 구균</em&gt; 사용 가능한 영양 철의 단독 소스로 헤모글로빈을 사용합니다. 이 분석은 헤모글로빈 - 파생 철 인수에 참여 세균 요소의 역할을 설정합니다.

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

이 실험은 인간의 헤모글로빈을 유일한 철분 공급원으로 활용하는 황색포도상구균의 능력을 테스트합니다. 먼저 신선한 인간 혈액에서 적혈구를 분리합니다. 헤모글로빈의 무결성을 보장하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피로 헤모글로빈을 정제합니다.이제 헤모글로빈을 철이 고갈된 배지에 첨가하여 헤모글로빈 다음 배양의 형태로 철을 공급합니다. S 레우스. 헤모글로빈의 존재 하에서 헤모글로빈을 철분 공급원으로 활용하는 능력을 측정합니다.결과는 reus가 유일한 철분 공급원으로 헤모글로빈이 존재할 때 증식한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 병원체가 숙주 단백질을 철의 공급원으로 활용할 수 있는지, 이 과정을 사용하여 철을 활용하는 데 어떤 메커니즘이 필요한지 여부와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 방법은 헤모글로빈에서 포도상구균의 철 획득에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한 다른 박테리아에 대한 연구와 숙주의 철분 함유 단백질을 사용하는 방법에 적용할 수 있습니다. 이 기술을 시연하는 것은 제 연구실의 GLA Ani와 Catherine Haley입니다. 첫째로, 항응고제로 보충된 갓 고립된 인간적인 혈액을 얻고 정화 내내 4 섭씨 온도에 15, 000 Gs.Carefully 흡인에 20 분 동안 원심 분리에 의하여 적혈구를 유지하고, snat를 부드럽게 흡인하고 얼음 감기, 0.9%sodium 염화물 해결책에 있는 펠릿을 3개의 세척 후에, resus, 얼음 찬 10 millimolar triss의 1개의 양에 있는 펠릿을 중단하십시오, HCL을 삼투압에 의해 적혈구로 이동합니다.그런 다음 톨루엔을 최종 부피의 20%에 추가하고 로터에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 원심분리기. 20, 1 시간 당 000 Gs에 lysate.중간 용혈물 분획을 수집하고 상부 톨루엔 층과 펠릿을 방해하지 않습니다. 용혈액을 0.44마이크로미터 주사기 필터에 통과시킵니다. 용액에 미립자 물질이 포함되어 있고 필터를 통과할 수 없는 경우 고속 원심분리를 반복하십시오.이제 고성능 액체 크로마토그래피 음이온 교환 컬럼으로 헤모글로빈을 정제하십시오. 10 millimolar tris, HCL의 이동상 A와 10 millimolar tris, HCL과 0.5 molar sodium chloride의 이동상 B를 사용합니다. 분당 2밀리리터의 유속으로 2분에 걸쳐 0%에서 100%의 용매 B 경사를

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

에 초점을 세균성 병원체에 의해 호스트 세포의 침략의 연구를위한 일반적인...

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

출처: Gupta, S., et al. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 철분 제한 조건에서 결핵균 을 배양하여 철분 스트레스를 유도하고 박테리아 생존을 지원하는 시데로포어의 분비를 촉진하는 절차를 보여줍니다.

철분 제한 조건에서 결핵균 배양

출처: Maurakis, S., et al. 금속 반응성 유전자의 특성화 및 숙주 리간드로부터의 금속 획득을 위한 Neisseria gonorrhoeae의 금속 제한 성장. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 금속 반응 유전자의 역할을 연구하기 위한 금속 제한 박테리아 성장 분석을 보여줍니다. 금속 고갈 배지에서 성장한 야생형 및 돌연변이 박테리아는 금속 리간드와 함께 배양되고 플레이트 리더를 사용하여 성장을 모니터링합니다. 금속이 고갈된 조건에서 야생형 박테리아는 금속 흡수와 성장을 가능하게 하는 표면 수용체를 발현하는 반면, 돌연변이체는 이 수용체가 부족하여 성장이 제한됩니다.

금속 반응성 유전자의 역할을 연구하기 위한 금속 제한 박테리아 성장 분석

출처: Behera, R.K. 외, 감염된 조직에서 박테리아 유전자 조절을 연구하는 형광 기반 방법. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 박테리아 성장 표준화와 대사 동기화를 달성하기 위해 용혈성 황색포도상구균 배양을 준비하는 과정을 보여줍니다.

숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 용혈성 황색포도상구균 배양 준비

이 비디오에서는 유세포 분석을 사용하여 식균작용 후 인간 호중구에 대한 악성 및 덜 독성이 있는 Staphylococcus aureus 균주의 세포 독성을 검출하는 분석을 시연합니다.

포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 세포 독성 분석 : phagocytosis 후 호중구에 대한 균주

여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

우리는 여기에서 금속 섭취에 대한 유전자의 발현을 용이하게하기 위해 금속 제한 액체 배지에서 Neisseria 임질의 성장을위한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 이 조건에서 성장한 임노코커스의 표현형을 특성화하기 위하여 다운스트림 실험을 개략적으로 설명합니다. 이들 방법은 다른 박테리아에서 금속 반응성 유전자의 특성화에 적합하도록 적응될 수 있다.

호스트 리간드에서 금속 반응 유전자 및 금속 취득의 특성화를 위한 Neisseria 임질의 금속 제한 성장

이 프로토콜은 황색포도상구 균 의 내재화의 범위와 인간 숙주 세포 내부에서 살아남을 수있는 능력뿐만 아니라 항균 화합물의 세포 내 효능을 연구하는 방법을 설명하는 것을 목표로합니다.

황 색포도상구균 내산화 및 항균 화합물의 세포 내성 효능을 연구하는 향상된 효소 보호 분석

이 원고에서는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항생제 생존을 평가하고, 플라스미드를 녹농균(P. aeruginosa) 및 S. 아우레우스(S. aureus )로 변환하여 리포터 균주를 생성하고, 타임랩스 형광 현미경 검사로 지속형(persister)와 같은 표현형 변이를 시각화하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus 이종 표현형

배우세요 황색포도상구균이 인간 혈색소를 철 소스로 활용하는 성장 분석법을. HPLC 정제와 철 결핍 배지를 사용하여 병원균의 철 대사 메커니즘을 연구하고 치료 전략 개발에 활용합니다.

철 소스로 인간 혈색소를 사용하여 황색 포도상 구균 성장

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