Name: 라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 라이브 세포에서 4D 현미경을 이용한 단백질 응집체 동역학 시각화 방법을. Ubc9 ts 폴딩 센서와 열충격을 활용하여 단백질 품질 관리 메커니즘을 실시간으로 추적하고 연구할 수 있습니다.

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1. 효모 준비 <ol><li> GAL1-GFP-Y68L (UBC9 TS) 카세트를 들고 플라스미드와 효모 종자를 변환 할 수 있습니다. </li><li> 16 시간 또는 O / N. 24 시간에 2 % raffinose를 포함하는 합성 미디어에서 효모의 성장과 뒷면 2퍼센트 갈락토오스가 포함 된 미디어에 희석 200 rpm으로 흔들어 동안 30 ° C에서 세포를 배양. </li><li> 다음날 아침, OD 600 = 0.2 쿼리 부담을 희석. 문화 = 0.8-1.0 OD 600에 도달 할 때까지 30 ° C (200 RPM)에서 4-6 시간에 흔들어. </li><li> 식 (그래서 GFP-Ubc9 TS 만 이미 번역 접 풀을 모니터링하는 것과 같이), 2 %의 포도당 (SD) 이전 이미지 30 분을 보충 합성 미디어로 변경 미디어를 주체할 수 있습니다. </li><li> 치료 - 열 충격 37 번 20 분의 세포 ° C misfolding를 유도하거나, 지속적으로 열 충격 조건에서 단백질 집계를 수행하는 현미경 보육 인치 참고 - 당신은 RT, 사전 열 구경이 위의 모든 온도에서 현미경을 사용하는 경우현미경과 목표의 몸 (아래)를 따라 온도를 평형하는 2 시간에 관한 연구. </li></ol> 2. 판 \ 슬라이드 준비 <ol><li> 해당 판을 선택합니다. 주요 고려 사항은 영상 획득 동안 초점을 유지하는 능력입니다. 다음 점은 2D 시간이 만료 또는 3D 이미징을위한 4D 영상을위한 중요한과하지 않습니다. <ol><li> 여러 우물 판 다른 우물의 바닥 (예 : 우물이 목표에 상대적으로 다른 높이에있을 것입니다) 균일하지 않을 수 있습니다. 이 어려운 관계없이 autofocusing 기술이 사용되는, XY 포인트와 시간 지점에서 초점을 유지하기 위해 할 것입니다. </li><li> 슬라이드 자료 : 유리 대 플라스틱. 유리 바닥 슬라이드 더 Z-동질 우​​물 사이에 있지만, 더 비쌉니다. </li><li> 접시의 바닥의 두께 : 우리가 보통 coverslip 바닥 판 인덱스 1.5를 사용하지만, 인덱스 1은 목표에 따라도 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Cov10 분에 ConA (0.25 MG / ML)와 플레이트의 응급실 바닥 \ 슬라이드. ConA는 시간이 지남에 따라 하나의 셀에 따라 수 있습니다 슬라이드에 세포를 준수하는 데 사용됩니다. </li><li> ConA를 제거하고 그래서 초과 ConA이 증발하는 화학 후드에 슬라이드를 품다. </li><li> 잘 ConAed에 효모 샘플 플레이트 (200) μl (OD 600 = 0.5). </li><li> 세포 판의 표면에 충실 사용으로 15 분에 품다. </li><li> 매체의 압축을 풉니 다, 그리고 세포의 하나의 레이어를 새로운 매체로 세 번 씻어. 참고 : 긴 시간 경과를 계획하는 경우, 씨앗 세포가 띄엄 띄엄 있도록 새로운 꽃 봉오리가 작성하고 관심 지역을 방해하지 않습니다. </li></ol> 3. 현미경 준비 <ol><li> 우리는 몇 가지 표준이 아닌 수정 니콘 A1Rsi 공 촛점 현미경을 사용합니다. 최대 및 효모 영상을 위해 4 레이저 (및 640 nm의, 40 MW CUBE 레이저, 457-514 nm의, 65 MW 아르곤 이온 레이저; 561 나노 미터, 50 MW 사파이어 레이저 405 nm의, 50 MW의 CUBE 레이저)까지 사용 을 갖춘 4 PMTs필터. 우리 영상의 대부분은 EGFP를위한 녹색 필터 세트와 mCherry과 tdTomato에 빨간색 필터 세트 이루어집니다. GFP 및 mCherry과 함께 거의 bleedthrough는 없으며, 따라서 우리는 종종 동시 스캔을 사용합니다. 그러나, 라인 스캔은 또한이 발생하면 bleedthrough을 방지하는 데 사용할 수 있습니다. 우리 공 촛점도 2-3초 당 Z-스택을 (30-50 절) 활성화, z는 3 밀리 초 단계를 만들 수 있습니다 PInano 압전 단계 (MCL) 구비되어 있습니다. galvano 스캐너와 공진 스캐너 - 시스템은 스펙트럼 검출기, 완벽한 초점 (레이저 오프셋), 두 개의 스캐너가 있습니다. </li><li> 적절한 목표를 선택합니다. 주요 고려 사항 : <ol><li> 물 / 오일 / 에어 목적 : 주 고려 사항은 샘플의 매체 대 영상 매체의 굴절률이다. <ol><li> 오일 목적의 장점 : <ol><li> 오일 목표는 높은 수치 개구 (석유 바꿈 물보다 더 많은 빛을, 따라서 더 많은 광자 목표로 돌아가)를 할 수 있습니다. 오일 목적은 보유 할 수 있습니다NA 1.49은 물 1.27에 비해합니다. (단,이 사실은 해상도에 큰 차이 없습니다.) </li><li> 기름의 굴절률은 유리의 굴절률과 일치, 따라서 더 광자는 목표에, 유리를 통해 샘플에서 갈 손실되지 않습니다. (참고 - 목표와 coverslip에 적합한 굴절률이 집중 오일을 선택). </li><li> 이 증발하지 않기 때문에 기름은 문제없이 오랜 시간이 만료 된 수 있습니다. </li></ol> 석유 목표의 단점 : <ol><li> 빛이 수성 매체 (예 : 셀 등)를 통해 여행을하는 경우에는 오일 목적의 높은 NA으로 활성화 높은 해상도는 빠른 속도로 떨어집니다. </li><li> 이미지는 일반적으로 구형 aberrations을 가지고는 3D에 적용 &quot;을 뻗어&quot;. </li><li> 오일은 끈적 지저분한와 목적에 해로울 수 있습니다. </li></ol></li><li> 물 목적의 장점 <ol><li> 셀 자체는 수성이며, 따라서 Z의 적은 왜곡,이 있습니다차 해상도는 수성 샘플에 높은 깊이 남아 있습니다. </li><li> 청소하고 사용자 친화적 인. 물 객관적인 단점 : 증발 빠르게 목표에 지속적으로 물을 펌프하기 위해 만들어지고 특별한 준비없이 긴 영화에 따라서 적합하지. </li></ol></li><li> 에어 목적의 장점 : 1. 어떤 물질은 여러 포인트 획득이나 긴 영화 중에 / 증발을 잃어되지 않습니다. 2. 청소하고 사용자 친화적 인. 단점 : 낮은 해상도와 낮은 신호 감도. </li></ol></li><li> 객실 및 보육 온도 : 변화하는 온도가 물질 특성에 영향을 미치는, 그리고 섬세한 시스템에 초점을 변경합니다. 온도는 취득 점수를 선택하기 전에 조정해야합니다. 취득 기간 동안 온도를 변경하면 이미지가 중단되며, 초점의 손실을 야기 할 것이다. 우리는 우리의 현미경 시스템은 이미징 전에 원하는 온도에서 2 시간에 평형 보자. </li><li> 수정 목걸이 : 많은 목표 있도록 수정 링 함께목적은 주어진 커버 슬립의 두께에 맞게 변경해야합니다. 우리는 점 확산 함수 (point spread function)를 시각화하는 형광 구슬을 사용하는 동안 보정 칼라를 조정하는 것이 좋습니다. 이 모든 샘플에 대한 올바른 설정을 보장합니다. </li><li> 안정적인 샘플 홀더 : 우리가 가장 상업적으로 사용 가능한 샘플 홀더는 현미경의 약한 부분 것을 찾을 수 있습니다. 그들은 종종 휘청과 직선 없습니다. 이 고해상도, 멀티 - 포인트 4D 영상을위한 재해이다. 우리는 직선 우리 자신의 샘플 홀더를 디자인하고 무대에 단단히 맞습니다. 필요할 때 또한 딱 할 수 있습니다. </li><li> 다 지점 인수 : 저희 이미징 시스템은 기본적으로 레이저 기반의 자동 초점 메커니즘입니다 니콘 &quot;완벽한 초점&quot;시스템을 갖추고 있습니다. 시스템이 많이 표류하지 않습니다 특히 경우 autofocusing은 4D 영상과 반드시​​ 필요하지 않습니다. </li></ol></li></ol> 4. 영상 <ol><li> 시스템을 켜십시오 : 레이저, 무대, 컨트롤러, 카메라와 compu적이 소프트웨어. </li><li> 무대 홀더에 삽입 플레이트가 제대로 확보 및 안정화. </li><li> 효모의 위치와 방향을 결정하는 눈 포트를 사용합니다. </li><li> brightfield 사용하여 모양과 질감에 따라 세포의 건강과 생존 능력을 평가합니다. </li><li> 관련 형광 (GFP에 대한 예 FITC 필터)에 따라 epifluorescent 불 켜고, 그리고 연구에 따라 달라질 수 있습니다 표현형을 표시 셀에 중점을두고 있습니다. 하나 이상의 파장에서 높은 형광 아르 세포가 죽었 따라서 autofluorescent 수 있습니다. 우리는 SV40 NLS 신호 (NLS-TFP)에 융합 tdTomato의 형광으로 핵을 표시합니다. TFP 두 번 GFP의 크기이며, 핵의 확산 한도를 초과 따라서이며, 따라서 그것은 핵 마커로 잘 작동합니다. 우리는 또한 GFP로 동시에 녹색 (488 nm 정도) 레이저 TFP을 자극하지만, 스펙트럼 해결을위한 두 개의 별도 PMTs에 녹색과 붉은 배출량을 수집 할 수 있습니다. </li><li> 소음을 최소화하기 위해 다음과 같은 설정을 조정및 oversaturation : <ol><li> 레이저 전원 - photobleaching 및 이미지의 광독성 대 밝기 고려되어야한다. </li><li> 게인 : 카메라 감도에 영향을 미치는, 따라서 잡음 비율로 신호. </li><li> 핀홀 지름이 - 짧은 파장과 레이저에 따라 조정해야합니다. 핀홀 직경은 광학 부분의 두께 (높이)가 이미징를 결정합니다. 따라서, 핀홀을 열어이 더 빛을 (더 많은 광자하게)를 수집되지만, Z (이하 confocality)에서 해상도를 줄인 것입니다. </li></ol></li><li> 유용한 팁 : <ol><li> 다른 fluorophores가 일치 파장을 방출하는 경우, 가상 필터의 선택을 가능하게 스펙트럼 탐지기 기능을 사용합니다. 스펙트럼 감지기는 일반 PMTs보다 문자를 구분합니다. </li><li> 다른 fluorophores가 같은 레이저로 흥분하는 경우, 라인 스캔 기능을 사용합니다. </li><li> Galvano 스캐너 더 감도를 가능하게하지만, photobleaching에 대한 높은 위험이 있습니다. 공진 스캐너가 빠른 수cquisition는, 따라서 photobleaching에 대한 위험을 낮출 수 있지만, 덜 민감하다. </li><li> 이미지 2 ~ 16 평균, 소리의 비율로 신호를 향상하지만, 물론, 인수가 느린와 만드는, 레이저에 샘플 더 많이 노출을 포함한다. </li><li> 기간 생물학적 질문 (예 : JUNQ 및 iPod 형성은 ~ 2 시간이 소요)에 인수 - 따라 달라집니다. 우리는 시간이 경과 3D로 최대 30 시간까지의 공진 스캐너와 효모를 이미징하고 있습니다. </li><li> 시간 경과 간격 - 작은 간격은보다 일관된 동영상을 만들 수 있지만, 표백, 따라서 신호의 손실 사진을 발생할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

생화학 프로세스에 대한 우리의 직관이 반응물 및 제품의 잘 혼합 솔루션 비커에 평형에 도달 할 수되는 벤치 탑 실험에서 도출. 이러한 설정에서 특정 화학 종의 농도는 매크로 볼륨 분자의 몰 수량의 비율 인 하나의 숫자로 표현 될 수 있습니다. 세포의 전체 인구의 homogenates에서 추출을 수행 서부 blots, centrifugations, 그리고 분광 측정 : 많은 우리가 단백질 구조와 기능에 대해 알고 무엇의 고전, 대량 반응 사진을 반영 방법을 사용하여에서 유래. 우리가 배율에 따라 세포를보고 사용하는 기술로 도약하고 경계에 의해 향상은 대부분의 생화학 반응이 생체에서 개최되는 조건이 고전 벤치 탑 시나리오의 사람들 만이 조금 닮았 그런 적 명확하게된다. 뿐만 아니라 cel의 내부입니다라는 밀도가 크롤링 효과가 실질적으로 다양한 반응물의 활동을 변경하는, 또한 잘 혼합의 정반대이며, 환경을 포장. 체외의 복잡한 macromolecular 반응 폭 넓은 범위의 생체 효율성의 사이에 자주 차이에 대한이 차지한다. 아무데도 생체 폴딩, misfolding, 그리고 단백질의 집계에 관련된 질문에서와 같이 오해를 더 쉬운 체외 생화학 실험 클래식에서 형태소 분석 직관이 없습니다. 대량 반응 단백질 화학의 연구 간단한 예, 아니오로 답하는 등의 특정 단백질에 대한 개고의 문제를 처리 할 수​​ 있습니다 반면, 라이브 셀에 고분자 전체 인구의 역학을 추적 할 시도가 가능한 전체 배포에 민감해야합니다 폴리펩티드 사슬을 사용할 수 conformational 결과와 misfolding 및 집계의 위험에 특히. 예를 들어, 우리는 대량 셀 리를 검사 할 수서쪽은 blotting하여 집계 단백질 물리게하다, 그리고 단백질이 대부분 불용성 및 ubiquitinated 아니라는 것을 확인하십시오. 그러나, 생활 셀에 여러 셀을 통해 평균 때를 검출하기 어려운, 단백질의 하위 인구 이산, 가용성 및 종의 로컬 농도가 매우 높은 특정 구획에 ubiquitinated 수 있습니다. 후자의 시나리오는 큰 대량 하위 인구보다 세포의 생존에 대한 더 많은 중요한 결과가 초래 될 수 있습니다. 보호자가 pleiotropic 행동과 체외에서 기능을 다양하게 표시 반면 또한,이 셀에 자신의 분리 기능이 spatially과 시간적으로 국한하는 증거가되고있다. 생화학을 이해 새롭게 새로운 패러다임에서, 농도는 세포의 나노 환경 각각의 변수 재산되고, 생물학적 과정을 기초 분자 이벤트뿐만 아니라 시간에 assayed해야합니다뿐만 아니라, spac에5. 여기에 제시된 4D 영상 방식은 다른 생물학적 과정의 수를 연구하는 데 사용할 수있는 방법과 그들이 시간, 공간에 규제 있지만, 라이브 셀의 단백질 misfolding의 민감한 모델링을 가능하게하고, 환경 조건의 변화에​​ 따라. 이 논문에서 우리는 효과적으로 세포 기질의 단백질 응집체의 발병에 대처하는 단계와 옵션을 보여줍니다 Ubc9 TS 접는 센서를 사용합니다. 집계 품질 관리의 세포 생물학을 도시뿐만 아니라, 이러한 방식은, proteostasis (예를 들어 Ubc9 TS는 산화에 대한 응답으로 단백질 접힘 스트레스를 측정하는 데 사용할 수 있습니다에서 특정 섭동 또는 유전자 변이의 영향을 파악하기위한 강력한 도구로 제공 할 수 품질 관리 경로에서 유독 집계, 또는 변이)의 표현. 4D 영상을 정확하게 두 개의 서로 다른 단백질 간의 단백질 현지화 또는 colocalization를 결정하는도 중요합니다초, 그리고 어쩌면 과도하지만 중요 현상을 검출하기위한. 예를 들어, 특히 효모와 같은 작은 구형 유기체으로는, 4D 영상이 단순히 검사의 각도의 유물입니다 나타날 수 있습니다 반면 구조 또는 누계는 juxtanuclear 현지화을 가지고있는 경우로 나타날 수 있습니다. 우리가 여기에 제시 예를 들어 실험에서, 우리는 모델의 사용은 세포 기질의 시간과 공간에 대한 집계 품질 관리를 수행하는 단백질, Ubc9 TS를 misfolded 보여줍니다. 허용 온도에서 Ubc9 TS 가운은 개 어져 있으며, 핵 및 세포 기질에 확산. 열 유도 misfolding하면, 그것은 처음에 빠르게 proteasomal 저하에 처리됩니다 diffusing 작은 집계 스트레스 Foci을 형성한다. proteasome가 부분적으로 억제 될 때, 이러한 스트레스 Foci는 약 2 시간에 걸쳐 JUNQ 및 iPod 함유로 변환됩니다. ubiquitin로 인한 오염은 품질 관리 옵션, UB 등을 사용할 수없는 경우C9 TS는 즉시 보호 집계에 아이팟 포함에 다시 라우팅됩니다. 이 도구는 집계 품질 관리에 관련된 소설 유전 요인을 발견하고, 세포에서의 공간과 시간적 규정을 둘러 놀라운 기회를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>MG132</td><td>Mercury</td><td>mbs474790</td><td></td></tr><tr><td>con A</td><td>Sigma</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥판</td><td>ibidi</td><td>ibd81158</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D film은 PInano Piezo stage(MCL)가 장착된 Nikon A1R-si 현미경을 사용하여 60x water objective NA 1.27, 0.3 micron slice를 사용하여 획득했습니다., 0.5% 레이저 출력(65mW 488 레이저 및 50mW 561 레이저). z 스택을 90분 동안 5분마다 획득했습니다. 각 z 시리즈는 0.5미크론 스텝 크기와 총 30개의 스텝으로 획득되었습니다. 이미지 처리는 NIS-Elements 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.</td></tr></tbody></table>

라이브 셀의 단백질 응집체의 4d 영상

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

모든 살아있는 세포의 주요 작업 중 하나는 끊임없이 변화하는 환경 조건과 세포 내 환경을 단단히 포장되어, 끈적하고, 단백질의 안정성 1 위험한의 얼굴에서 새롭게 합성 단백질의 적절한 접는을 유지하고 있습니다. 동적으로 단백질 생산, 접이식 및 저하의 균형을 할 수있는 능력이 누구의 절대 필요성 때 오작동 가장 관찰이 높은 전문 품질 관리 기계를 요구합니다. 이러한 ALS, 알츠하이머, 파킨슨, 그리고 낭포 성 섬유증의 특정 형태의 질병은 단백질 폴딩 품질 관리 구성 요소 2에 대한 직접 링크를 가지고 있고, 따라서 향후 치료 개발 기본 과정의 기본적인 이해를 필요로합니다. 우리 실험 과제는 세포가 손상 신호를 통합하고 다양한 상황에 맞게 조정됩니다 답변을 마운트 방법을 이해하는 것입니다. 단백질 misfolding은 실존 thre를 나타냅니다 왜 주된 이유셀에서 총에 잘못 접 단백질의 성향에 따라서 혼잡하고 섬세 세포 접이식 환경 (1)의 글로벌 섭동의 원인입니다. 접는 건강, 세포 프로테옴의 &quot;proteostasis은&quot;정교한 품질 관리 시스템 3,4에서 다른 기계론의 단위의 조율 된 행동에 의해, 심지어 노화, 스트레스와 산화 손상의 협박, 유지됩니다. 분자 보호자의 전문 기계가 아닌 기본 polypeptides을 구속하고 기본 상태 1로 자신의 접이식를 홍보 할 수 있습니다, ubiquitin-proteasome 시스템 (5)에 의해 저하 위해 타겟팅, 또는 보호 집계 함유 6-9로 안내. juxtanuclear 품질 관리 구획 (JUNQ)과 불용성 단백질 보증금 (아이팟) (- 모델 그림 1) : eukaryotes에서 cytosolic 집계 품질 관리 하중은 두 개의 구획 8-10 사이에 분할됩니다.단백질 접힘 품질 관리 기계에 의해 ubiquitinated 아르 단백질들은이 proteasome에 의해 저하에 대한 처리 JUNQ에 전달됩니다. ubiquitinated되지 Misfolded 단백질들은 적극적으로 보호 구획에 집계됩니다 아이팟에 우회하고 있습니다. 최대이 시점까지, 라이브 세포 형광 현미경의 방법 론적 패러다임은 주로 라벨 단백질로 된 두 개의 차원에 시간 포인트와 보통 특정의 셀에 자신의 위치를​​ 추적 할 수 있습니다. 새로운 기술은 살아있는 세포에 experimenters에게 submicron 규모에 전례없는 액세스 권한을 부여 할 시작으로, 세포 기질의 동적 아키텍처는 실험 특성에 대한 도전 뉴 프런티어로보기에왔다. 우리는 빠른 속도로 시간이 지남에 따라 효모 세포 기질에 여러 휘황 표시된 단백질의 3D 공간 배포판을 모니터링하기위한 방법을 제시한다. 3D timelapse (4D 영상)는 단순히 기술적 인 도전이다; 쥐그녀 또한 세포 구조를 분석하는 데 사용되는 개념적 프레임 워크에 극적인 변화를 용이하게한다. 우리는 빠른 4D 형광 이미징을 사용하여 세포 집계 품질 관리에 misfolded 단백질의 고유 한 운명을 시각화하는 라이브 효모에서 cytosolic 접이식 센서 단백질을 사용합니다. Ubc9 단백질 10-12 (Ubc9 TS)의 온도에 민감한 돌연변이 세포 proteostasis의 센서, 및 추적 집계 품질 관리에 대한 생리 학적 모델을 둘 다 매우 효과적입니다. 대부분의 TS 단백질과 마찬가지로, Ubc9 TS가 활성화 세포 보호자에 의해 허용 온도에서 완전히 접힌과 기능입니다. 30 위 ° C, 또는 셀 misfolding 스트레스, Ubc9 TS의 misfolds을 향해 있으며 돌연변이, 열 변성, 또는 산화 손상으로 인해 misfolded 된 기본 구상 단백질의 운명을 다음과 때. 그 스트레스 Foci을 형성하거나, 그대로 융합하여 GFP 또는 기타 fluorophores에는,이 3D로 추적 할 수 있습니다 디JUNQ 또는 iPod에 rected.

<html><img alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> 1 그림. . 품질 관리 기계는 독특한 기능을 가진 서로 다른 구획으로 misfolded 단백질을 지휘 misfolded 단백질의 하위 세포 compartmentalization : 모델 가용성식이 단백질, 저하에 대한 타겟, 폴리 ubiquitination를 받아야하고 주 xta-N uclear Q의 uality 제어 구획 (JUNQ로 전송됩니다 ). 그들은이 활성화 집계를 받아야 곳 ubiquitinated 할 수없는 불용성 단백질은 액포에 인접 I nsoluble 저얼 otein D eposit (아이팟),에 보호 격리에 전송됩니다. es.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. GFP-Ubc9 TS로 모델링 단백질 misfolding. 정상적인 조건에서 GFP-Ubc9 TS (녹색)은 기본적으로 접혀 있으며, 핵 및 세포 기질에 diffusely 지역화되어 있습니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. Ubc9 TS의 표현은 모든 실험에서 이미징 전에 2 %의 포도당의 추가에 의해 종료되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol><li> 37 온도 변화시 ° C, GFP-Ubc9 TS (녹색)가 misfolded과 cytosolic 스트레스 Foci을 형성하고 있습니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. </li><li> 23 ° C에서 열 충격에서 회복되면 열 denaturated GFP-Ubc9 TS는 타락 등 감소 형광 수준으로 표시. </li><li> 80 음 MG132, GFP-U와 37 ° C 및 proteasome 억제에 온도 변화시<html> bc9 TS는 JUNQ 및 iPod 함유로 misfolded 처리됩니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. </li><li> 37 온도의 변화에 따라 ° C와 ubiquitination 억제, GFP-Ubc9 TS 아이팟 포함에 misfolded 처리됩니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. Ubiquitin 단백 분해 효소 4 (Ubp4)이 Ubc9 TS의 ubiquitination를 차단하도록 overexpressed 있습니다. </li></ol><img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> 그림 3. JUNQ 및 iPod 형성 시간 경과. 37 온도 변화시 ° C 80 음 MG132과 proteasome 억제가 GFP-Ubc9 TS 스트레스 Foci가 JUNQ 및 iPod 함유로 처리됩니다. 핵은 NLS-TFP (빨간색)으로 표시됩니다. 3D 이미지는 4 분 간격으로 획득했다. (또한 영화 1 참조).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포 생존 능력은 단백질 misfolding의 적시에 효율적 관리에 따라 달라집니다. 흠의 refolding, 열화, 또는 격리 : 우리는 여기 misfolded 단백질의 다른 잠재적 인 운명을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 Ubc9, 접이식 센서의 사용을 보여줍니다<sup&gt; TS</sup&gt;, 모니터링 proteostasis와 4D의 현미경을 사용하여 라이브 셀의 집계 품질 관리를위한.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

이 실험적 시스템은 살아있는 세포에서 고해상도 3D 형광 이미지를 획득하여 단백질 접힘 품질 관리의 시공간 역학을 모니터링하고 분석합니다. 먼저, 빠르게 움직이는 단백질 복합체를 연구하기 위해 세포를 준비합니다. 높은 Z 해상도에서 이미지의 Z 스택을 획득합니다.그런 다음 Zacks로 구성된 시계열을 획득하고 결과 이미지를 3D 영화로 렌더링하고 결과 이미지를 분석합니다. 궁극적으로 4D 이미징을 통해 다양한 조건에서 세포의 동적 및 일시적 현상을 추적할 수 있습니다. 광시야 현미경 및 타임 랩스와 같은 기존 방법에 비해 4D 이미징의 주요 장점은 세포 내 전체 단백질 집단의 역학 및 공간적 시간 분포를 고해상도로 동시에 시각화할 수 있다는 것입니다.이 방법은 단백질 응집, 품질 관리 및 단백질 접힘에 대한 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 매우 동적이고 일시적인 프로세스입니다. 따라서 높은 시간적, 공간적 해상도가 없으면 많은 것을 관찰할 수 없습니다.이 방법은 집계 품질 관리에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 단백질 상호 작용 및 역학 연구에 혁명을 일으킬 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 내인성 태그 또는 발현이 낮은 단백질의 3D 영화를 촬영하려면 시스템의 안정성이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.높은 감도 및 낮은 광표백: UBC nine의 온도에 민감한 돌연변이와 같은 세포질 접힘 센서 단백질에 연결된 Fluor의 융합 단백질에 대한 발현 플라스미드로 효모 균주를 변형시킵니다. 24시간 동안 2% 라피노스를 함유한 합성 배지에서 효모를 성장시킨 다음 하룻밤 동안 2% 갈락토오스를 함유하는 배지로 다시 희석하여 쿼리 균주를 약 0.2의 OD 600으로 희석하고 이미징 30분 전에 배양액이 0.8 및 1.0 사이에 OD 600에 도달할 때까지 4-6시간 동안 배양합니다. 2%포도당이 보충된 합성 매체로 발현을 억제합니다.이 단계를 통해 발현 단백질의 이미 번역되고 접힌 풀(pool)만 모니터링할 수 있습니다. 이제 섭씨 37도에서 20분 동안 세포에 열 충격을 가합니다. 잘못 접히는 것을 유도하려면 4개의 D.Imaging 획득 중에 초점을 유지하기 위해 적절한 플레이트를 선택하십시오.접시 바닥을 10분 동안 0.25ml/milliliter con A로 덮습니다. Con A는 슬라이드에 셀을 부착하는 데 사용되며, 이를 통해 시간이 지남에 따라 단일 셀을 따라갈 수 있습니다. 콘 A와 화살표를 흡인하고 화학 후드에서 플레이트를 건조시킵니다.그런 다음 200마이크로리터의 효모 샘플을 추가합니다. 세포가 플레이트에 부착될 수 있도록 15분 동안 배양합니다. 효모 이미징을 위한 단일 세포층을 얻기 위해 배지로 세 번의 세척을 수행합니다.함께 제공되는 텍스트에 자세히 설명된 대로 몇 가지 비표준 수정이 있는 컨포칼 현미경을 사용하십시오. 이 효모 이미징 시스템은 최대 4개의 레이저와 필터가 장착된 최대 4개의 광전자 증배관을 사용합니다. 대부분의 이미징은 EGFP에 대한 녹색 필터 세트와 m 체리 및 TD 토마토에 대한 빨간색 필터 세트로 수행됩니다.또한 컨포칼에 pi nano pizo 스테이지 퍼펙트 포커스 시스템을 장착하고 갈반 O 및 공진 스캐너는 원하는 온도에 도달할 때까지 현미경 시스템을 평형을 이룹니다. 이미징 매체의 굴절률과 샘플의 매체를 기반으로 이미징하기 전에 적절한 물, 오일 또는 공기를 선택하십시오. 플레이트의 두께에 따라 보정환을 조정하십시오.렌즈 물티슈와 에탄올을 사용하여 대물렌즈를 청소합니다. 또한 샘플이 들어 있는 슬라이드를 청소하십시오. 플레이트를 스테이지 홀더에 단단히 놓고 샘플 홀더의 안정성을 확인하여 모든 샘플에 대한 올바른 설정을 보장합니다.형광 구슬을 사용하는 동안 보정환을 조정하여 아이 포트로 포인트 스프레드 기능을 시각화합니다. 효모의 위치와 방향을 결정합니다. 다음으로, 필요한 epi 형광등을 켜고 관련 표현형을 나타내는 세포에 초점을 맞춥니다.그런 다음 명시야를 사용하여 세포 생존율 평가를 위해 모양과 질감에 따라 세포 건강과 생존력을 평가합니다. SV 40 및 LS 신호에 융합된 TD 토마토 플로라 Fluor로 핵을 시각화합니다. TFP는 GFP의 두 배 크기입니다.핵의 확산 한계 위에 있기 때문에 핵 마커로 매우 잘 작동합니다. GFP와 동시에 녹색 4 88 나노미터 레이저로 TFP를 여기하되, 스펙트럼 분해능을 위해 녹색 및 적색 방출을 두 개의 별도 PMT로 수집합니다. 노이즈와 채도를 최소화하려면 함께 제공된 원고에 자세히 설명된 대로 레이저 출력과 핀홀 직경을 조정하십시오.서로 다른 플로라 힘이 합동 파장을 방출하는 경우 가상 필터를 선택하여 실험 설계에 따라 타임 랩스 이미지를 획득할 수 있는 스펙트럼 검출기 기능을 사용하고, Misfolded Protein U BBC nine Ts는 시간과 공간에 대한 응집 품질 관리를 따르는 모델 시스템을 제공합니다. 허용 온도에서 세포질에서 UBC nine Ts는 열에 의한 잘못 접히면 핵과 세포질에서 접혀 확산됩니다. 처음에는 프로테아좀 분해를 위해 처리되는 빠르게 확산되는 작은 세포질 응집체 반점을 형성합니다.프로테아좀이 부분적으로 억제되면 이러한 반점은 약 2시간 동안 정크 및 iPod 함유물로 전환됩니다. 정상적인 조건에서 GFP UBC nine Ts는 본래 접혀 있으며 여기에서 녹색으로 볼 수 있듯이 세포핵 세포질에 확산 국소화되어 있습니다. 온도가 섭씨 37도로 변하면 융합 단백질이 잘못 접히고 섭씨 23도에서 열 충격에서 회복될 때 세포질 반점 응집체를 형성합니다.열적으로 변성된 G-F-P-U-B-C nine Ts는 형광 수준 감소로 인해 저하됩니다. 핵은 N-L-S-T-F-P에 의해 빨간색으로 표시됩니다. 섭씨 37도로의 온도 변화가 프로테아솜 억제와 결합되면 G-F-P-U-B-C 9 Ts가 잘못 접혀 쓰레기 및 iPod 개재물로 처리됩니다.여기서, 유비퀴틴 프로테아제 4는 유비퀴틴화의 유비퀴틴화 억제를 차단하기 위해 과발현되며, 온도 변화는 G-F-P-U-B-C 9 Ts 처리를 iPod 포함물로 초래한다. 4분 간격으로 촬영된 이 타임랩스 이미지는 쓰레기와 아이팟 형성의 역학을 명확하게 보여줍니다. 이 기술은 UBC nine Ts를 접힘 센서로 사용하여 시간 경과에 따른 세포 프로테오스타시스를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.4D 이미징은 포유류 세포 및 C elegance와 같은 다른 모델 시스템에서도 수행할 수 있습니다. 또한 4D 이미징을 통해 응집체 품질 관리의 다른 미묘한 이벤트, 예를 들어 용해성 응집체 응력 병소의 형성 및 역학, 쓰레기 및 iPod 구획으로의 응집체 전달에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 프로테아좀 억제제를 사용하여 프로테아좀 활성을 차단하여 형광 표지에 융합된 잘못 접힌 돌연변이 단백질이 유비퀴틴 의존성 프로테아솜 분해를 겪어 세포 세포질 내에 축적되는 것을 방지하는 세포 기반 단백질 응집 분석을 시연합니다. 그런 다음 단백질 응집체를 시각화하고 형광 현미경으로 정량화합니다.

Protein Aggregate Formation Assay: 프로테아솜 억제제에 의한 유도 시 배양된 세포에서 단백질 응집을 검출하고 정량화하는 방법

이 비디오는 유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. 뇌는 장착하기 전에 고정, 세척 및 페이딩 방지제로 처리됩니다. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처하고 정량화하여 돌연변이 단백질 응집체의 전달을 관찰합니다.

Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains (유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화)

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.

초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

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효모의 4D 현미경 검사법

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정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

우리는 여기에서 형광 상관 분광학을 사용하여 세포 용해 및 살아있는 세포에 있는 단백질 올리고머 및 응집을 측정하는 절차를 소개합니다.

형광 상관 분광법을 사용하여 단백질 응집 감지

여기에서, 선충류 예쁜꼬마선충에서의 단백질 응집 동역학의 분석을 위한 방법이 제시 된다. 연령 동기화 된 집단의 동물은 서로 다른 시점에서 이미지화되고 CellProfiler에서 반자동 포함 계수가 수행되고 AmyloFit의 수학적 모델에 적합합니다.

Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

배우세요 라이브 세포에서 4D 현미경을 이용한 단백질 응집체 동역학 시각화 방법을. Ubc9 ts 폴딩 센서와 열충격을 활용하여 단백질 품질 관리 메커니즘을 실시간으로 추적하고 연구할 수 있습니다.

라이브 셀의 단백질 응집체의 4D 영상

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