Name: 3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: 학습하세요 3D 공초점 현미경을 이용한 면역형광과 DNA FISH 결합 기법으로 염색질 변형과 DNA 서열을 동시에 검출하는 방법을. 이 기술은 세포생물학 및 유전학 연구자들이 핵 내 단백질과 게놈 위치를 3차원으로 시각화하여 염색질 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 토론과 의견 Skok 실험실, 특히 수잔나 휴잇의 회원 감사드립니다. 이 작품은 건강 교부금의 국립 연구소 R01GM086852, RC1CA145746 (JAS)에 의해 지원됩니다. JAS는 백혈병과 림프종 사회 학자이다. JC는 암 연구소의 Irvington 연구소 연구원입니다. MM은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 통합 대학원 교육과 연구 Traineeship (NSF IGERT 0,333,389)에 의해 지원됩니다.

1. Fluorophores있는 DNA 프로브 레이블 : 닉 번역 (~ 6 시​​간) <ol><li> 클린 BAC DNA (맥시 사립으로 작성) 또는 plasmids 또는 PCR 제품, H 2 O에 resuspended 모두, 라벨에 사용할 수 있습니다. 참고 강력한 생선 신호, 프로브 적어도 10킬로바이트에 걸쳐해야. </li><li> RNase에서 DNA를 배양 37 번 30 분에 대한 ° C (모든 시약은 표 1에 나열되어 있습니다). </li><li> 16에서 2 시간의 대화명 번역 반응을 길러 ° C (표 2, 3 참조). 직접 라벨의 다른 방법은 (: 생선 태그, Invitrogen 예) 사용할 수 있습니다. </li><li> -80에 하나의 시간에 대한 반응을 비활성화 -20 ° C.에서 ° C 또는 특급 </li><li> 2 % 아가로 오스 겔에서 프로브의 크기를 결정합니다. 얼룩은 약 300-500 BP (Cy5-프로브의 비방이 표시되지합니다)에서 대부분의과 100 1,000 BP 사이 여야합니다. DNA가 충분히 소화되지 않은 경우, 더 많은 DNA 폴 I 및DNase I은 반응에 추가 및 16 ° C.에서 두 시간에 incubated 수 있습니다 </li><li> 어둠의 두 시간에 H와 2 0을 채워 이리터 비커에서 0.025 mm 필터에 프로브를 정화. </li><li> 다음과 같이 프로브에 차단 요소를 추가 침대-1 DNA 10 μg, Hybloc의 DNA 10 μg과 DNA 프로브의 10 μg을위한 연어 정자의 100 μg. -20 ° C.에 저장 DNA 프로브 </li></ol> 2. 프로브 강수량 / 변성 / 사전 어닐링 (3-4 시간) <ol><li> 0.3 μg과 DNA 프로브의 1 μg 사이는 coverslip 당 사용됩니다. 3M NaAc (산도 5.2)와 100 % 에탄올 2.5 볼륨의 0.1 볼륨 믹스 탐사선이 -80에 하나의 시간에 품다 ° C 또는 야간 -20 ° C에서와 4에서 13,000 rpm으로 스핀 다운 ° C를 30 분에. DNA 프로브의 양이 DNA의 품질과 하이브리드의 핵 지역에 따라 조정 될 수 있습니다. 직접 라벨의 대체 방법의 감소 금액의 사용을 허용 할 수 있습니다프로브. 하나의 슬라이드에 여러 개의 DNA 생선 신호 감지를 들어, 다른 프로브는 (반복 시퀀스처럼, 사전 annealed이 아니어야 프로브 제외) 함께 유발 될 수 있습니다. 같은 시간에 수행 여러 가지 실험에 대한 프로브도 함께 유발 될 수 있습니다. 펠렛은 가볍게 (프로브의 작은 금액이 유발되는 경우, 펠릿이 표시되지 않을 수 있습니다)를 사용 fluorophores에 따라 색상이되어야합니다. </li><li> 드라이 알약과 37-45에서 어둠 속에서 (Eppendorf thermomixer를 사용하여) 진동과 coverslip 당 (표 4 참조) 15 μl 하이브 리다이 제이션 버퍼에서 그들을 resuspend ° C (약 20 분) 등이 있습니다. </li><li> 75-95에서 5 분에 변성 프로브 ° C. </li><li> 30-60 분에 대한 ° C 37 프로브를 사전 어닐링. 사전 어닐링의 길이는 프로브의 복잡성과 품질에 따라 조정될 수 있습니다. </li><li> 밤새 하이브리드에 대한 coverslips (제 3 항 참조)에 탐사선을 적용합니다. </li></ol> 3. 3차원 DNA 물고기 - 첫 번째 날 (~ 3 시간) <ol><li> 비 점착성의 세포는 1X PBS (coverslip 당 5-10 μl 1X PBS에서 ~ 2x10 5 세포)의 작은 볼륨에 집중하고 폴리-L-라이신 코팅 coverslip의 중심에 놓을 수 있습니다. 자기편 세포는 최소 24 시간 (~ 70 % 합류) (coverslips는 0.1 % 젤라틴으로 코팅 할 수 있습니다)에 coverslips에 배양해야합니다. 광장 18x18에 24~24mm의 coverslips는 6 잘 접시에 배치되며, 프로토콜에 걸쳐, 각 솔루션의 두 ML은 (또는 원형 1.5 mm의 coverslips는 12/24-well 판에 배치 할 수 있습니다) 잘 당 사용됩니다. </li><li> RT (4 % PFA 주식은 -20 ° C에서 저장 aliquoted 할 수 있습니다)에서 10 분 동안 2 % paraformaldehyde / 1X PBS, pH를 7-7.4에서 셀을 수정합니다. Paraformaldehyde가 (16 %) 용액에 구입할 수 있습니다, 또는 4 %의 주식 솔루션은 분말 / prills에서 준비하실 수 있습니다. Paraformaldehyde 가루는&gt; 60 ° 얼음에 C (산도가 해산을 촉진하기 8-9으로 증가 될 수있다), 냉각 다운이 조정에 1X PBS에 용해되어에드 산도 7-7.4까지, 필터링, 매에 aliquoted 및 -20 ° C.에 주 저장 </li><li> 1X PBS에 세 린스 후, 얼음에 5 분을 위해 아이스처럼 차가운 0.4 % 트리톤 - X-100 / 1X PBS로 세포를 permeabilize. permeabilization의 길이는 세포 종류에 따라 조정될 수 있습니다 NB는 :. DNA 물고기가 immunofluorescence와 결합되어있는 경우, immunostaining는 (제 4 참조)이 단계에서 수행해야합니다. </li><li> 37 한 시간에 0.1 μg / 1X PBS에서 μl RNase ° C.와 1X PBS, 배양 세포에서 세 린스 후 Coverslips는 parafilm의 솔루션이나 습기 챔버에서 슬라이드의 100 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 있습니다. Coverslips 그런 다음 조심스럽게 집게로 제거됩니다. 어떠한 저항도가 발생하는 경우 coverslips는 세포 손상을 방지하기 위해 1X PBS로 넘쳐해야합니다. </li><li> 1X PBS에 세 린스 후, 얼음에 10 분 동안 아이스처럼 차가운 0.7 % 트리톤 - X-100 / 0.1 M HCL에 셀을 permeabilize. </li><li> 세 린스 후N 1X PBS, RT 30 분에 1.9 M HCL에 변성 세포. 반면, 세포는 적어도 30 분 동안 75-80 ° C 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC에 변성 될 수 있습니다. 하이브리드 길이 (및 온도) 세포 유형에 따라 최적화 될 수 있습니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 1X PBS에 세 린스 후, ° C 어둡고 습한 챔버 37에서 잠을 자면 프로브와 세포 잡종을 만들다. Coverslips는 슬라이드 프로브의 15 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고, 고무 시멘트로 밀봉되어 있습니다. </li></ol> 4. 3 차원 Immuno - 물고기 - 1 일 (~ 6-7 시간) <ol><li> 결합 immunofluorescence / DNA 생선, immuno-얼룩은 0.4 % 트리톤 - X-100 (단계 3.3)의 permeabilization 한 후 수행해야합니다. </li><li> RT 30 분 (2.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 % 정상 염소 혈청, 0.1 % 십대 초반 - 2​​0)에 대한 솔루션을 차단에 세포를 배양. 차단 솔루션, 필터링 1.5 ML의 Eppendorfs에 aliquoted과 m에 저장-20 ° C.에 onths </li><li> 습기 챔버에서 RT 한 시간 동안 단백질 또는 차단 솔루션에 희석 관심 히스톤 수정에 대해 제기 된 주요 항체와 세포를 배양. 여기 H2AX (; 자세한 내용은 표 5를 참조 γ-H2AX, Millipore)의 phosphorylated 세린-139에 대한 항체의 예를 보여줍니다. Coverslips는 parafilm의 솔루션이나 습기 챔버에서 슬라이드의 100 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 있습니다. Coverslips 그 다음 신중하게 포셉 (1X PBS 필요한 경우와 홍수)로 제거됩니다. 참고 희석과 부화 길이는 항체 및 세포 유형의 품질에 따라 조정 될 수있다. </li><li> 0.2 %에 BSA / 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 / 1X PBS, 흔들림과 RT의 세 배 5 분 거리에 있습니다. 세포를 씻으십시오 </li><li> 어두운 습윤 챔버에 RT 한 시간에 대한 솔루션을 차단에 희석 적절한 형광 - 복합 차 항체와 세포를 배양. 여기로 검출의 예를 보여보조 염소 항 마우스 항체 (알렉사 형석 488 또는 555, Invitrogen, 자세한 내용은 표 5 참조). Hapten - 복합 이차 항체는 (비오틴, digoxigenin 등)도 사용할 수 있습니다. 이 경우, 적절한 감지 (streptavidin, 안티 - 파 등)에 대한 추가 단계가 넘는 박 DNA - 생선 하이브리드 전이나 후에 수행 할 수 있습니다. </li><li> 0.1 %에서 세포를 씻어 십대 초반 - 2​​0 / 1X PBS, 어둠 속에서 떨고있는 RT 세 번 5 분 거리에 있습니다. </li><li> 어둠 속에서 RT 10 분에 2 % paraformaldehyde / 1X PBS의 사후 수정 세포. </li><li> 위의 RNase A (단계 3.4)의 부화에서 DNA 생선을 계속합니다. </li></ol> 5. 3 차원 DNA 물고기 / Immuno - 물고기 - 두 번째 날 (~ 2 시간) <ol><li> 조심스럽게 조심스럽게 집게로 제거하고 세척 솔루션을 포함 우물에 넣고, 배 SSC과 함께 홍수 coverslips을 고무 시멘트를 제거합니다. </li><li> 37 번 30 분 ° 흔들림과 어둠 속에서 C에 2 배 SSC에 세포를 씻으십시오.</li><li> 흔들림과 어둠 속에서 RT 30 분 동안 2 배 SSC에 세포를 씻으십시오. </li><li> 흔들림과 어둠 속에서 RT 30 분 동안 1X SSC에 세포를 씻어 포름 아미드와 변성의 경우, 세차는 다음으로 대체되어야합니다 :. 3 세차를 배 SSC, 5 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC와 3 세차의 37 각을 분 ° C. </li><li> 총 DNA의 counterstaining에 대해 1.5 μg / ML DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)를 포함하는 골드 장착 매체 연장에 세포를 탑재합니다. Coverslips은 슬라이드에 미디어를 마운트의 10-15 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 매니큐어로 봉인되어 있습니다. 슬라이드는 -20 ° C.에 몇 달 동안 보관됩니다 </li></ol> 6. 3D 현미경 및 분석 <ol><li> 3D 이미지는 다른 현미경 시스템과 획득 할 수 있습니다. 우리의 실험에서, 0.3 μm로 구분하여 광학 섹션은 Leica SP5 AOBS 공 촛점 시스템 (음향 광학 빔 스플리터)를 수집합니다. 참고 그 optica 사이의 분리난 비행기가 분석의 유형에 따라 조정될 수 있습니다. </li><li> 3D 이미지 스택은 다른 소프트웨어와 도구를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 우리는 관심 loci 사이의 거리 측정을 평가하고 하위 핵 구획 또는 단백질과 관심 loci의 협회의 다른 유형을 분석 할 이미지 J 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 다른 셀 유형 또는 단계 사이의 비교, 관심의 다른 loci 사이의 비교 : 모든 통계 분석은 중요한 pairwise 평가 (들)과 (또는 이상) 다른 생물 조건을 두 비교 수행됩니다. 모든 통계 테스트에서 P-값 ≤ 5.00E-2 (= 0.05)이 (1.00E-2 중요 할로 이동합니다 ≤ P ≤ 5.00E-2 * 중요한, 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * 매우 중요한, P &lt;1.00E-3 *** 매우 중요). </li></ol> 두 대립 유전자 사이의 거리의 전체 분포의 통계적 분석. 우리가 처음 C우리가 nonparametric 두 샘플 Kolmogorov-스 미르 노프 (KS) 테스트 13,14을 사용하여 경험적 간 allelic 거리의 배포판의 차이의 중요성을 평가 두 alleles.To 사이의 측정 거리의 전체 범위에 걸쳐 누적 분포 주파수 곡선을 onstruct. 최적의 거리 컷 - 오프를 사용하여 두 개의 대립 유전자의 가까운 연결 (예 : 페어링)의 통계 분석. 2 개의 대립 유전자 또는 loci 사이의 거리에서 가장 강력한 차이의 범위를 확인하려면, 우리는 두 꼬리 피셔 정확한 테스트 15 s의 시리즈를 사용합니다. 즉, 각 측정 거리 조건이 하나이 크게 두 샘플 사이의 짧은 거리에서 오버 표시되어 있는지 여부를 우리가 시험에서. P-값의 분포에서 최소 두 대립 유전자의 가까운 연결 (예 : 페어링)의 컷 - 오프로 간주되어야 거리의 범위를 나타냅니다. 이후 두 꼬리 피셔 정확한 테스트는 t를 사용확인 된 컷 - 오프 값이 15에서 두 대립 유전자의 페어링의 중요성을 평가 Ø. 여러 테스트 수정 16을 수행 피셔 테스트의 총 수에 계정에 적용됩니다. 하위 핵 구획 또는 단백질과 관심 궤적의 협회의 통계 분석. 두 꼬리 피셔 - 정확한 ​​테스트는 서로 다른 구획 또는 단백질 15 관심 궤적의 협회의 중요성을 분석하는 데 사용됩니다.

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<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li>
<li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li>
<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

위에 설명 된 기술은 림프구에게 30,31 개발에 면역 글로불린 및 Tcra / D loci의 V (D) J 재조합의 규정을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 우리는이 기술이 다른 세포 유형의 다양한 핵 단백질, 핵 구획과 loci의 감지,에 적응 될 수 있다는 확신합니다. 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다,이 경우에 초점을 주요 단계는 다음과 같습니다. 첫째, permeabilization의 길이는 세포 종류에 따라 조정할 수 있습니다. 기본 항체 부화의 두 번째 길이는 또한 항체의 품질과 관심의 단백질 (예를 들어 경우에, 부화은 4 ° C에서 밤새 수행 할 수 있습니다)의 풍부한에 따라 조정할 수 있습니다. 중요한 것은 변성 단계를 적용 할 수 있으며, HCL 치료는 DNA 물고기 20 포름 아미드 3,4,34와 NaOH의 변성에 의해 대체 될 수 있습니다. 또한 반복액체 질소의 에드 냉동 해동 사이클은 고정 / 혼자 <...

Epigenetic 메커니즘을 트리거 설치 및 발달 및 세포 유형의 특정 전사의 프로필 상속. 한 수준에서이 활성 또는 자동 게놈 영역을 정의 염색질 포장 변조를 포함합니다. 큰 규모에서 게놈과 핵 건축의 글로벌 3D 조직은 전사 패턴의 제어 역할을한다. 따라서, 이러한 epigenomic 기능의 해부는 유전자 6-11을 규제하는 방법의 전체 이해 필수적입니다. 결합 immunofluorescence 및 3D DNA의 물고기는 특정 상호 작용 / 핵 내에서 DNA 시퀀스 및 / 또는 단백질의 연결을 평가하여 분자 및 생화학 분석을 보완 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 동안 또한, 같은 염색질 immunoprecipitation (칩 seq) 또는 깊은 시퀀싱와 결합 염색체 캡쳐 형태로 게놈 전체의 높은 처리량 기술 (4C-seq, 5C는, 하이-C) 글로벌 DAT를 제공합니다세포 인구 12, immunofluorescence / DNA 물고기 기술은 단일 세포 수준에서 분석 할 수 있습니다. 여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno - 물고기) 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 장점은 DNA와 단백질 구조의 보존을 결합 시각화입니다. 이 분야에 경험은 기존 프로토콜을 개선하고 단순화 할 수있게되었습니다. 우리가 재조합를 겪고 림프구에 DNA 이중 좌초 휴식을 감지하는이 프로토콜을 사용했지만,이 방법은 다른 단백질과 다른 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 어부 </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> 시그마 </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397에 대한 C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 또는 Cy5 dUTP </td><td> 어부 </td><td> # 45-001-XXX </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 로슈 </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA 폴 I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025 μm 필터 </td><td> Millipor전자 </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> 침대-1 DNA 1 MG / ML </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 MG / ML </td><td> 응용 유전학 </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> 연어 정자 </td><td> 시그마 </td><td> # D1626 </td><td> 분말은 H 2 O에 10 밀리그램 / ML에 resuspended 할 </td></tr><tr><td> NaAc (나트륨 아세테이트, 산도 5.2 완충 용액) </td><td> 시그마 </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (몰 Biol 학년) </td><td> 어부 </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (몰 Biol 학년) </td><td> 어부 </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran 황산 분말 </td><td> 시그마 </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (식염 - 나트륨 인산-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 20x 솔루션 </td&gt; <td> 어부 </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> 어부 </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 어부 </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 잘 접시 </td><td> 어부 </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS, </td><td> 어부 </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, prills, 95 % </td><td> 시그마 </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤-X-100, 몰 Biol 학년 </td><td> 시그마 </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (소 혈청 알부민) 분수 V </td><td> 어부 </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> 일반 염소 혈청 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 - 2​​0 몰 Biol 학년 </td><td> 시그마 </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (식염 나트륨 시트르산) 20x 솔루션 </td><td> 어부 </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 antifade 시약을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole) </td><td> 시그마 </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> 최고의 시험 한 코트 고무 시멘트 </td><td> 예술 또는 사무실 공급 상점 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 특정 시약 및 소형 장비. </td></tr></tbody></table>

3d 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3d 보존 된 계면 핵에 결합 immunofluorescence와 dna의 물고기

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

3D 공 촛점 현미경에 이어 3 치수 보존 핵에 DNA 프로브를 사용하여 원위치 하이브리드 화에 형광은 (3 차원 DNA 물고기) 각 셀의 하위 지역 염색체 유전자 loci의 위치, 또는 전체 지역을 시각화 할 수있는 가장 직접적인 방법을 나타냅니다. 분석이 유형의 핵의 글로벌 아키텍처뿐만 아니라 핵 공간 내의 특정 게놈의 loci와 지역의 행동에 대한 통찰력을 제공합니다. Immunofluorescence는 반면에, 핵 단백질의 검출을 (수정 histones, 히스톤 변형과 수식, 전사 기계 요소, 핵 하위 구획 등) 할 수 있습니다. immunofluorescence 및 3D DNA 물고기를 결합의 주요 과제는 핵의 3D 아키텍처뿐만 아니라 항체에 의해 검출 된 에피토프를 유지하기 위해 한 손에 있으며, 반면에, DNA 프로브의 침투가 감지 할 수 있도록 유전자 loci 또는 염색체 지역 1-5. 여기 3D 보존 핵의 게놈 loci과 염색질 수정 시각화를 결합한 프로토콜을 제공합니다.

DNA와 immuno-생선은 B와 T 림프구 개발하는 동안 항원 수용체 loci의 V (D) J 재조합의 과정과 관련된 핵 조직의 변화를 연구하기 위해 Skok 실험실에 사용됩니다. 위에 설명 된 기법은) 우리는 전 현장의 두 끝 (수축) 사이) 측정 거리에 ii) 대립 유전자 또는 loci (페어링) 사이를 측정 거리, III)가, loci에서 IV를 발생하는 DNA 손상을 분석 가능하게 대립 유전자의 위치를​​ 평가 및 하위 구획 (우리의 연구에서 억압 pericentromeric heterochromatin) 핵에 상대적으로, 그리고 V loci)는 대립 유전자와 loci (우리의 연구에서 phosphorylated 히스톤 γ-H2AX 협회)에 핵 단백질의 연결을 신고 할 수 있습니다. 특히, 우리는 B 세포 17-30을 개발 면역 글로불린 loci의 V (D) J 재조합의 규정에 현장 역학의 역할을 분석하고, CD4 사이의 계보 (Lineage) 헌신의 규정에 +와...

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

이 절차의 전반적인 목표는 3D 컨포칼 현미경을 사용하여 염색질 변형과 DNA 염기서열을 동시에 검출하는 것입니다. 먼저 특이적 DNA 프로브를 생성합니다. 한편, 실험 세포는 고정 perme 및 immuno 염색됩니다. 관심있는 히스톤 마커의 경우.그런 다음 세포가 변성되고 밤새 몸 안에서 형광이 생깁니다. 혼성화 또는 어류는 하나 이상의 DNA 프로브를 사용하여 수행됩니다. 마지막으로, 세포를 세척하고 3D 형광을 위해 장착합니다.결과 이미지의 현미경 분석은 관심 유전자 자리의 핵 국소화 및 특정 결석 변형과의 연관성을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 보존 핵에서 게놈 유전자좌가 있는 결석을 포함한 핵 단백질의 시각화를 결합하고 염색질 후성유전학적 핵 조직 또는 유전자 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다는 것입니다. 이 절차의 경우, 백 플라스미드 또는 PCR 산물을 라벨링에 사용할 수 있습니다.이것들은 함께 제공되는 텍스트에 설명된 대로 준비해야 합니다. 강력한 물고기 신호를 위해 프로브는 최소 10킬로베이스 쌍을 소비해야 합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 1마이크로그램의 DNA와 0.17마이크로그램의 RNA A를 결합하여 이 절차를 시작합니다.섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 얼음에서 RNA A를 잠시 비활성화하고 적절한 양의 Nick translation을 추가합니다. 섭씨 16도에서 2시간 동안 냉장 수조 또는 시원한 블록에서 혼합하여 배양하여 반응을 비활성화합니다.튜브를 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 섭씨 영하 20도에 놓습니다. 다음으로, 2%agros 겔에서 프로브 크기를 결정합니다. 도말은 101, 000 염기쌍 사이여야 하며 대다수는 약 300 - 500 염기쌍이어야 합니다.공상 과학 프로브의 번짐은 보이지 않습니다. 크기가 결정되면 0.02에 투석하여 프로브를 정제합니다. 물이 채워진 2리터 비커에 5mm 필터.200마이크로그램의 프로브를 각 플로팅 필터의 중앙에 부드럽게 피펫팅한 다음 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 피펫을 사용하여 프로브를 필터에서 새 마이크로 원심분리 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 다음으로, 다음과 같이 프로브에 차단 계수를 추가합니다.CO 1D NA 1마이크로그램. 1마이크로그램의 DNA 프로브 및 믹스에 대한 1마이크로그램의 하이 블록 DNA와 10마이크로그램의 연어 정자는 DNA 프로브

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 아닌 방사성을...

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

사전 이식 유전자 진단 생선

이 비디오에서는 방사선 조사된 세포핵의 이중 가닥 DNA 절단 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1의 국소화를 시각화하기 위한 면역형광 방법에 대해 설명합니다.

DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

3D 다색 DNA FISH는 3D 보존 핵 내에서 다중 게놈 궤시를 시각화하는 도구를 나타내며, 단일 세포 수준에서 핵 공간 내에서 상호 상호 작용 및 국소화를 명확하게 정의합니다. 여기서, 단계별 프로토콜은 인간 1차 세포의 광범위한 스펙트럼에 대해 기재된다.

인간의 1 차 세포에서 핵 아키텍처를 연구하는 3D 다색 DNA FISH 도구

우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

학습하세요 3D 공초점 현미경을 이용한 면역형광과 DNA FISH 결합 기법으로 염색질 변형과 DNA 서열을 동시에 검출하는 방법을. 이 기술은 세포생물학 및 유전학 연구자들이 핵 내 단백질과 게놈 위치를 3차원으로 시각화하여 염색질 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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