3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

이 절차의 전반적인 목표는 3D 컨포칼 현미경을 사용하여 염색질 변형과 DNA 염기서열을 동시에 검출하는 것입니다. 먼저 특이적 DNA 프로브를 생성합니다. 한편, 실험 세포는 고정 perme 및 immuno 염색됩니다. 관심있는 히스톤 마커의 경우.

그런 다음 세포가 변성되고 밤새 몸 안에서 형광이 생깁니다. 혼성화 또는 어류는 하나 이상의 DNA 프로브를 사용하여 수행됩니다. 마지막으로, 세포를 세척하고 3D 형광을 위해 장착합니다.

결과 이미지의 현미경 분석은 관심 유전자 자리의 핵 국소화 및 특정 결석 변형과의 연관성을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 보존 핵에서 게놈 유전자좌가 있는 결석을 포함한 핵 단백질의 시각화를 결합하고 염색질 후성유전학적 핵 조직 또는 유전자 조절 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다는 것입니다. 이 절차의 경우, 백 플라스미드 또는 PCR 산물을 라벨링에 사용할 수 있습니다.

이것들은 함께 제공되는 텍스트에 설명된 대로 준비해야 합니다. 강력한 물고기 신호를 위해 프로브는 최소 10킬로베이스 쌍을 소비해야 합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 1마이크로그램의 DNA와 0.17마이크로그램의 RNA A를 결합하여 이 절차를 시작합니다.

섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 얼음에서 RNA A를 잠시 비활성화하고 적절한 양의 Nick translation을 추가합니다. 섭씨 16도에서 2시간 동안 냉장 수조 또는 시원한 블록에서 혼합하여 배양하여 반응을 비활성화합니다.

튜브를 섭씨 영하 80도에서 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 섭씨 영하 20도에 놓습니다. 다음으로, 2%agros 겔에서 프로브 크기를 결정합니다. 도말은 101, 000 염기쌍 사이여야 하며 대다수는 약 300 - 500 염기쌍이어야 합니다.

공상 과학 프로브의 번짐은 보이지 않습니다. 크기가 결정되면 0.02에 투석하여 프로브를 정제합니다. 물이 채워진 2리터 비커에 5mm 필터.

200마이크로그램의 프로브를 각 플로팅 필터의 중앙에 부드럽게 피펫팅한 다음 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 피펫을 사용하여 프로브를 필터에서 새 마이크로 원심분리 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 다음으로, 다음과 같이 프로브에 차단 계수를 추가합니다.

CO 1D NA 1마이크로그램. 1마이크로그램의 DNA 프로브 및 믹스에 대한 1마이크로그램의 하이 블록 DNA와 10마이크로그램의 연어 정자는 DNA 프로브를 섭씨 음의 20도에서 보관합니다. 물고기 절차가 있는 날에는 프로브를 침전시키고 사용할 준비를 합니다. 비디오의 이 섹션에 설명된 단계는 다음 섹션의 단계와 병렬로 수행해야 합니다.

프로브를 침전시키려면 프로브를 따라 pH 5.2에서 0.1 부피의 3 몰 아세트산 나트륨 및 2.5 부피의 100 % 에탄올과 결합하여 섭씨 영하 80도에서 1 시간 동안 배양합니다. 배양 후 프로브를 섭씨 4도에서 16, 000회 G로 30분 동안 회전시킵니다. 스핀 후 상등액을 버리고 어둠 속에서 펠릿을 자연 건조시킵니다.

프로브의 양과 색상에 따라 펠릿이 보이거나 보이지 않을 수 있습니다. Resus는 테스트 조건에 따라 15마이크로리터의 혼성화 버퍼에 펠릿을 현탁시키고 섭씨 37-45도의 어둠 속에서 Einor Thermo Mixer를 사용하여 약 20분 동안 흔듭니다. 다음으로 프로브는 섭씨 75도에서 95도에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 프로브를 사전 사용하려면 온도 혼합기에서 30-60분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양 직후, 프로브는 비디오의 다음 섹션에 설명된 대로 커버 슬립의 세포에 적용됩니다. 다음 단계에서는 사용되는 항체 및 세포에 따라 배양 시간을 필요에 따라 수정해야 합니다.

비디오의 이 섹션에 설명된 단계는 함께 제공되는 텍스트에 설명된 대로 이전 섹션의 단계와 병렬로 수행해야 합니다. 폴리라이신으로 코팅된 커버 슬립 위에 비부착성 세포를 6개의 웰 플레이트로 구성된 웰에 떨어뜨리고 5분 동안 부착하도록 합니다. 그런 다음 PBS 인큐베이트에 2%파라폼 알데히드 2ml를 부드럽게 첨가하고 배양 후 실온에서 10분 동안 배양합니다.

PB S3로 각 웰을 헹군 다음 세포가 투과될 때까지 헹구고, PBS에 0.4%Triton X 100의 얼음처럼 차가운 2ml를 넣고 얼음에서 5분 동안 배양합니다. 투과액을 흡인한 후 DNA fish가 면역형광과 결합될 경우 다음과 같이 진행한다. 첫 번째 피펫 100 마이크로 리터의 차단 용액을 가습 챔버의 param

커버 슬립 셀 쪽을 아래로 향하게 하여 차단 용액 위에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로 전송합니다. 덮개는 차단 용액에 희석된 1차 항체의 100마이크로리터 방울로 미끄러집니다.

여기서 사용 된 항체는 인산화 된 시리아 1 39 H 2 A x 또는 감마 H 2 A x를 인식합니다. 슬라이드를 실온에서 1 시간 동안 가습 챔버에서 배양합니다. 배양 후에는 집게를 사용하여 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다.

커버 슬립을 집어내기 어려운 경우 PBS를 주입하고 다시 시도하십시오. 각 슬라이드를 6의 우물로 옮깁니다. PBS에서 0.2%BSA 0.1%tween 20 2밀리리터를 함유한 웰 플레이트는 이 용액의 커버 슬립을 실온에서 5분 동안 3회 세척하고 흔들어 세척한 다음 param의 어둡고 습한 챔버에서 실온에서 1시간 동안 차단 용액에 희석된 적절한 형광단 접합 2차 항체로 세포를 배양합니다.

배양을 따르기 전과 같이, 세포를 0.1 % 트윈 20 PB S3에서 5 분 동안 암흑 속에서 실온에서 5 분 동안 헹구고, 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 PBS의 2 % 파라 포름 알데히드 2 밀리리터에 담그십시오. 세포가 염색되거나 염색되지 않은 경우 PBS에서 커버 슬립을 세 번 헹구어 DNA 물고기를 계속합니다. 그런 다음 덮개가 셀 쪽을 아래로 밀어 100밀리리터당 0.1밀리그램의 100마이크로리터 방울에 놓습니다.

RNA는 가습 챔버에서 param에 있고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 PBS에서 덮개를 세 번 헹군 다음 어두운 곳에서 얼음 위에서 10 분 동안 0.1 몰 염산에 0.7 % Trix 100을 얼음으로 차갑게 헹굽니다. PBS에서 3 회 헹굼 한 후 1.9 몰 염산에서 암흑 속에서 실온에서 30 분 동안 세포를 변성시키고 얼음처럼 차가운 PBS에서 3 회 더 세척하여 프로브와 세포를 혼성화합니다.

이 비디오의 이전 섹션에서 준비한 15마이크로리터 프로브의 드롭 위에 커버 슬립 셀 면을 아래로 향하게 하여 현미경 슬라이드에 놓고 고무 시멘트로 슬라이드를 밀봉한 다음 어두운 가습 챔버에서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 집게를 사용하여 슬라이드에서 고무 시멘트를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 독감은 두 개의 Acts SSC로 커버 슬립을 제거하고 집게를 사용하여 세포와 함께 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 세척액이 들어있는 우물에 넣으십시오. 다음으로, 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 동안 2개의 XSSC, 실온에서 30분 동안 2개의 XSSC, 실온에서 30분 동안 1개의 XSSC를 흔들어 슬라이드를 장착하고, 매니큐어로 밀리리터당 1.5밀리그램의 DPI 씰을 포함하는 10-15마이크로리터 드롭의 연장된 금 장착 매체에 커버 슬립 셀 측면을 아래로 놓습니다. 슬라이드는 섭씨 영하 20도에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

슬라이드가 준비되면 0.3미크론으로 분리된 광학 절편이 있는 3D 이미지를 수집하고 첨부 문서에 설명된 대로 분석하여 항원 수용체 유전자좌의 두 대립유전자의 연관성 변화가 림프구 발달 중 VDJ 재조합 과정의 조절과 관련이 있는지 여부를 확인하고, 재조합효소 단백질 rag one이 결핍된 야생형 및 돌연변이 세포를 사용하여 DNA를 사용하여 관심 부위를 검사했습니다. 게놈 영역을 포함하는 약 200 킬로베이스 쌍에 걸쳐 있는 등에서 생성된 물고기 프로브. 대립유전자 사이의 거리는 3D 이미지 스택, 점선 원, 윤곽선 핵 모양에서 각 백 신호의 질량 중심 사이를 측정했습니다. 표시된 스케일 바는 1미크론 누적 빈도 분포 곡선을 생성하여 야생형 및 돌연변이 세포에서 측정된 두 대립유전자 사이의 전체 거리 범위를 표시했습니다.

그런 다음 비모수 2표본 KS 검정을 사용하여 두 분포 간 차이의 유의성을 평가했습니다. 대립형질간 거리에서 가장 강력한 차이의 범위는 파란색 점으로 표시된 일련의 두 꼬리 낚시꾼 정확한 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 더 높은 점으로 표시된 가장 강력한 P 값은 약 1미크론 거리에서 발견되었습니다.

따라서, 두 대립유전자의 밀접한 결합 또는 쌍을 이루기 위한 컷오프는 1미크론으로 설정되었습니다. 여기에 표시된 누적 빈도 곡선은 두 가지 다른 생물학적 조건에서 0에서 1.5미크론까지 두 대립유전자의 긴밀한 연관을 위한 거리 범위를 나타냅니다. 두 대립유전자의 쌍을 이루는 것의 중요성은 1미크론에서 컷오프에 대한 두 꼬리 피셔 정확 테스트를 사용하여 평가되었습니다.

이 그래프는 돌연변이 조건에서 두 대립유전자가 야생형에서와 같이 고주파와 관련이 없음을 보여줍니다. 따라서, 누락된 단백질 헝겊 하나는 inic pairing과 관련이 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 면역형광과 DNA 물고기를 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 핵 구조의 전 세계적인 변화, 핵 공간 내 특정 게놈 위치 및 영역의 거동, 이 지역 내 특정 핵 단백질의 연관성에 대한 통찰력을 제공함으로써 연구자들을 위한 길을 열었습니다. 또한 이 절차에 따라 다양한 질병의 기저에 있는 메커니즘을 이해하는 데 도움이 됩니다. 염색질, 면역 침전 또는 칩 탐색 또는 염색체 캡처 확인과 같은 게놈 전체 얼음 처리량 기술과 같은 다른 방법을 fore five C 또는 IC와 같은 심층 염기서열분석과 결합하여 세포 집단에 대한 글로벌 데이터를 제공할 수 있습니다.