Name: 유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라이브 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 마우스 유방암 모델에서 회전원반 공초점 현미경을 이용한 실시간 약물 침투 및 치료 반응 추적 방법을. 이 기술은 종양 미세환경에서 세포 사멸과 기질 반응을 단일 세포 수준에서 분석하여 항암 치료 효능을 평가합니다.

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우리는 기술 지원 J. Cappellani와 J. 키우 감사드립니다. 이 작품은 국립 암 연구소 (U01 CA141451), 스타 암 컨소시엄, 치료를위한 수잔 G. 코멘 유방암, ME에 유방암 반대 Manhasset 여성 연합 방지를 위해 롱 아일랜드 2 일 워크와의 자금에 의해 지원되었다 Congressionally 감독 유방암 연구 프로그램에서 미리 박사 교제, ESNESN에 미국은 또한 생명 과학의 왓슨 스쿨에서 레슬리 C. 빠르고 윌리엄 랜돌프 허스트 재단 동지의 수상자이다. 하는 노르웨이의 연구위원회 (160698/V40 및 151,882) 및 남동부 지역 보건 당국 (2,007,060)의 자금에 의해 지원되었다.

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저자는 공개 할 관심 충돌이 없습니다. 모든 동물 실험은 IACUC 승인 프로토콜에 따라 실시되었다.

생체의 조직 요법에 대한 종양의 반응은 microenvironment의 급성 반응 및 재발 5를 동시에 영향을 미치는으로 체외에서 암 세포의 자에게 크게 다를 수있다. 생체의 chemoresistance 경로에 explicating에 가장 큰 장애물 중 하나는 암 세포와 microenvironment 사이의 상호 작용의 복잡성입니다. 특히, 고체 종양은 암과 같은 안티 - 암 치료시 발생하는 세포 죽음 stromal 세포, 하나의 구성 요소의 섭동, 사이의 균형을 개발했기 때문에, 조직 조직에 드라마틱 한 효과가 발생할 수 있습니다. 여기에 제공된 intravital 이미징 기술은 안티 - 암 약물 치료를하는 동안 라이브, anesthetized 마우스의 종양에서 암 세포 기질 상호 작용의 직접적인 시각화 할 수 있습니다. 우리는 (17을 참조하십시오 상대 제한된 침투 깊이가 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용 </)&gt;를 한모금,하지만 우리 수술 및 라벨 기술이 현미경 다른 종류의와 함께 사용할 수 있습니다. 이 실험에서 얻은 영화는 형광 강도의 변화 (예를 들어 세포 죽음의 표시 인구 나 유도의 침투로 인해), 세포 운동성, injectables의 배포 (혈관 누출을 추적 할 수 등), 그리고 공동을 포함 프로세스를 추적하는 데 사용할 수 있습니다 형광 신호 5,12,17,20의 국산화. 우리는 정기적으로 이미지 6 이상 시간 마우스 및 18 세 이상 시간도 수행 이미징. 이 이러한 긴 시간 동안 지속적으로 마취 하에서 쥐를 유지해야합니다. 적절한 마취를 통해 우리 동물의 90 % 이상이 6 시간 생존, 약 80 %가 18시간 이상 생존. 장기 마취를 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 이전에 19 게시했습니다. 우리의 경험에서 다섯 요소가 중요합니다 : u는, 저체온증 피하고 탈수를 피하고 생리 혈액 산소 포화 수준을 유지isoflurane에 대한 humidified 캐리어 가스를 노래하며, 고통의 흔적을 표시하지 않습니다되는 마취의 가장 낮은 수준에서 동물을 유지. 체온을 유지하기 위해, 우리는 (38 ° C에서) 온수 담요 쥐를 유지. 탈수를 방지하기 위해, 우리는 전체 이미징 절차를 통해 생리 IP의 작은 볼륨을 주입. 생리 혈액 산소 포화 수준을 유지하기 위해, 우리는 캐리어 가스 (대신 일반적으로 사용되는 100 %보다)의 21 % 산소로 시작합니다. 시간을 실험에 - - 우리가 마우스하면 흡입 산소 수준을 향상 할 수 있도록 혈액 산소 포화도의 감소를 보여줍니다. 우리의 경험에서, 시간 (30~40%에 등)에서 흡입 산소 수준을 증가시키는 것은 거의 항상 추가 영상의 시간 동안 수 있도록 동물을 안정화합니다. 마취의 최적 수준은 60-65/min와 400-450/min의 펄스 속도의 호흡 속도의 1-1.5 % isoflurane과 결과를 달성 대부분의 마우스입니다. 우리의 이미징 실험에서, 우리는 주로 유전자 변형 마우스 모델을 사용s은 (는) (MMTV-PyMT와 C3 [1] - 태그)하는 종양은 단일 이미지 세션에서 여러 X, Y 위치에서 병렬 종양 진행의 다양한 단계에 여러 개의 병변의 이미징을 허용, multifocal 있습니다. 이 단계에 따라 달라 치료 반응을 확인하기위한 실험에 대해 마우스에 마우스 변화에 대한 우려를 감소, 및 이미징에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다. intravital 이미징 동안 수행 할 수 있습니다 종양 병변의 병리학 준비가 덜 상세 다른이며, 비록 MMTV-PyMT 모델 (및 기타 자연 암 모델)의 그것보다, intravital 영상 중에 인식 할 수 진보적 인 histopathological 단계를 거칩니다 조직 학적 섹션 5,17. 암 세포는 일반적으로 말기 악성 종양에서 분리 될 때 대조적으로, 이식 모델은 가장 늦게 무대 종양을 반영하는 경향이 있습니다. 이러한 모델은 따라서 종양 - 기질을 공부에 더 의무 아르다른 단계 사이의 이러한 상호 작용의 차이보다 늦게 무대 종양의 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 우리는 어떻게 치료에 의해 유도 세포 사망 한 후 발생할 이미지 핵 구조 변화에의 예를 보여줍니다. 항암제 치료의 부재에서이 라벨 전략 대신 elucidating, 원위치에서 이미지 세포 분열에 사용할 수 있습니다 예를 들어, 세포 증식과 휴지는 microenvironment에 얼마나 영향을받습니다. 앞으로 mitochondrial 구성 요소의 형광 라벨은 apoptotic 세포 사망하는 동안 발생하는 이미지 mitochondrial 변경하는 것이 가능하게 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 또한 다른 microenvironmental 구성 요소는 시각화 및 이미징 될 수있는 방법을 치료 한 후 이미지 암 세포 면역 세포의 상호 작용에 있지만,의 예를 보여 주었다. stromal 구성 요소에 대한 기존의 형질 기자 라인 (예., FSP1-EGFP 17 αSMA - RFP 21 COL1A1-EG 섬유 아세포를위한 사람들을 포함FP 21) 또는 vasculature의 세포 (예 : Tie2-GFP 22, VEGF-GFP 23). Intravital 이미징은 생체 다음과 같은 화학 요법 관리에서 발생하는 상호 작용과 프로세스의 실시간 시각화 할 수 있습니다. 기술이 현재로, 우리는 치료 반응에 영향을 미치는 방법에 골수 양 세포 이해의 주요 진전을 만들었습니다, 종양 microenvironment은 너무나 복잡하기 때문에 그러나, 주요 발전은 여전히​​ 환경 매개 약물 저항을 근간 프로세스에 mechanistically 탐구하기 시작 필요합니다. 여전히 필요한 가장 중요한 발전 중 하나는 특정 세포 집단을위한 더 나은 마커의 식별합니다. 더 나은 마커의 중요성은 잘 유방 종양의 microenvironment, 섬유 아세포와 면역 세포의 가장 눈에 잘 띄는 stromal 세포 구성 요소의 두 사람과 함께 도시된다. α-부드러운 근육 고를 (αSMA)가 자주 식별하는 데 사용됩니다섬유 아세포하지만, 단백질은 혈관 평활근 세포와 세포 myoepithelial (24)에 의해 표시됩니다. αSMA-GFP의 기자 마우스가 존재하지만 따라서, 특정 세포 유형을 결정하는 것은 intravital 이미징 실험이 진행되는 동안 다음이되는 것은 도전이다. 마찬가지로, C-FMS 프로모터에서 표현 등 EGFP와 같은 단일 형광 마커는 종종 12,17 면역 세포의 여러 subpopulations를 식별합니다. 하나가 이상적으로 특정 세포 유형을 식별하는 단일 마커를 사용하고자하지만 따라서, 기본 생물의 복잡성이 접근법을 사용하여의 주요 과제를 안겨주고 있습니다. 이 문제에 대한 하나의 일부 솔루션은 또한 같은 형광 기자를 표현하는 세포의 subpopulations을 차별화하는 데 injectable 라벨을 사용하는 것입니다. 예를 들어, 형광 dextrans는 대 식세포에 의해 촬영되고 C-FMS-EGFP와 Fsp1-EGFP 유전자 변형의 기자 마우스에 의해 표시하는 대 식세포 subpopulations 라벨을 사용할 수 있습니다 <sup&gt; 17. 형광 프로브에 복합 항체는 특정 subpopulations를 (C-FMS-EGFP 기자 17에 의해 분류 골수 양 세포의 Gr1 - 긍정적 인 인구 등) 식별하는 데 사용되었습니다. 어떻게 왜 종양 동물의 큰 무리를 필요로 다른 시간 지점에서 수확 한 조직에서 파생 된 관리 치료, 또는 조직 학적 시리즈에 응답에 대한 약간의 기계론의 정보를 제공 캘리퍼스 측정,에 의해 생성 된 종양 응답 곡선과는 달리, 우리의 기술은 직접, 객관적 정보를 제공합니다 세포 죽음의 역학에 작은 무리의 암 세포와 stromal 세포의 상호 작용에. 따라서, 여기에보고 된 절차를 사용하는 장점은 실시간으로 그대로 종양의 microenvironment의 맥락에서 약물 반응에 대한 동적 정보를 제공한다는 것입니다. 이러한 정보는 5 치료 반응을 유도하는 기본 프로세스에 중요한 통찰력을 초래할 수 &lt;/&gt;를 논의하게 될 것입니다.

종양이 성장 1 적절한 환경을 유지하는 데 도움이 암 세포와 stromal 성분 (세포와 비 휴대폰 모두) : 고체 종양은 두 가지 주요 격실로 구성되어 있습니다. 이 stromal 성분은 유방 2-5의 일정을 포함 암의 많은 종류의 개발, 진행 및 전이에 중요한 역할을 재생합니다. stromal 환경은 또한 치료 반응 할 2,4,5 영향을 미칩니다. 따라서, 암 세포가 손상 microenvironment의 컨텍스트 내에서 기존과 소설 치료에 응답 방법을 결정하는 것은 암 생물학에 대한 우리의 이해를 발전 및 현재 치료 전략 개선을위한 중요합니다. 또한, 암 세포 기질의 상호 작용은 치료의 관리에 따라 변경하는 방법 정의하는 것은 종양 재발의 생물학을 이해하는 데 중요합니다. Organotypic 공동 배양 시스템은 종양 - 기질 상호 작용을 연구하는 데 유용되었습니다 <s6&gt;까지하지만, 현재 사용할 수있는 방법을 성공적으로 면역 세포의 혈관 기능 및 채용에 대하여 특히 체외에서 그대로 종양의 microenvironment를 요점을 되풀이 할 수 분명하다. 사실, 체외에서 관찰 요법으로 암 세포 응답은 종종 microenvironment 5 그대로 생체에서 관찰 것과 크게 다릅니다. 따라서, 치료 반응에 종양이 - 기질 상호 작용하고 영향을 공부 생체 모델에 더 나은 임상 적으로 관련성이 높은 메커니즘에게 7 반영 될 수 있습니다. 생체의 항 암 치료에 반응을 연구의 주요 수단은 종양 크기와 처리 동물이나 환자에서 파생 된 조직의 조직 학적 평가의 측정을 겪었습니다. 그러나 지난 20 년 동안 현미경과 형광 기자의 진보는 간 및 세포 내 프로세스의 시각화을 사용하도록 설정 한라이브, anesthetized 동물의 고해상도 (intravital 영상) 8시. 이 intravital 현미경 기술은 spatially과 시간적 셀룰러 및 하위 세포의 해상도 8,9에서 종양 - 기질 상호 작용의 생체 역학에을 해부 특히 도움이 될 입증되었습니다. intravital 이미징에 의해를 풀 된 프로세스 안티 종양 T 세포의 세포 독성 10,11, T 세포와 골수 양 세포 12 사이의 상호 작용, 치료 치료 13 대 식세포에 의존 암 세포 intravasation 및 전이에 따라 콜라겐 성분과 조직의 변화의 역학을 포함 14 및 혈관 투과성 15. intravital 이미지에 대한 세 가지 주요 요구 사항이 있습니다. 다음은 적절한 준비와 노출 조직의 이미징, 관심의 조직 구성 요소의 형광 라벨을위한, 그리고 페어 현미경 카메라을 포함이미지 16을 획득 할 수 ystem. 이러한 요구 사항을 해결하는 데 사용되는 가장 일반적인 전략은 다음과 같습니다 : 1) heterotopic 준비 (예 : 귀 및 눈 궤도의 접종), 영구적 인 이미지 창 또는 exteriorized 준비 (예를 들어, 등쪽 피부 플랩), 2) 유전자 변형 형광 기자입니다.. 형광 injectables는 조직 구성 요소에 라벨을 지정하기 위해, 그리고 3) multiphoton 또는 공 촛점 현미경 시스템은 각각 9 광전자 증 튜브 또는 전하 결합 소자 (CCD) 카메라,와 페어링. 우리는 형광 기자 인코딩 transgenes을 표현 anesthetized 동물 이미징의 사타구니 유선 노출 할 수있는 수술 준비 피부 플랩 모델을 사용합니다. 이미지는 4 레이저 회전 디스크 공 촛점 현미경 시스템 17와 짝을 강화 CCD (ICCD) 카메라를 사용하여 12~40시간 기간 동안 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로 이미징은 우리가 생체 의약품 유통, 단계에 따라 달라 채널에서 같은 과정을 연구 할 수있다emotherapeutic 반응, 화학 요법 유도 된 세포의 죽음, 그리고 골수 양 세포의 행동 5 종류. 우리는 항암제 치료, 유방암의 마우스 모델에서 종양 - 기질 상호 작용에 암 세포 응답의 intravital 이미징을위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 하나의 이미지 세션 40 시간까지의 기간에 대한 유전자 변형과 이식 두 가지 모델에서 유전자 변형과 injectable 형광 라벨의 다양한 다양한 암 세포와 stromal 구성 요소를 모두의 행동과 죽음을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1) 태그 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 13,591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB - ECFP 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 개 PBS </td><td> - 집에서 제작 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, Fluorescein-복합 </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> 1 개 PBS에 희석 1 MG / ML, DH 2 O (-20 ° C 4 MG / ML, 저장)에 Reconstitute </td></tr><tr><td> 10 KD Dextran, 알렉사 형석 647-복합 </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> 1 개 PBS에 희석 1 MG / ML, DH 2 O (-20 ° C 4 MG / ML, 저장)에 Reconstitute </td></tr><tr><td> Doxorubicin 염산염 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 44,583 </td><td> 4 번 DH 2 O와 매장에서 Reconstitute는 ° C, 1 개 PBS에 희석 </td></tr><tr><td> Isothesia (Isoflurane) </td><td> 버틀러 동물 건강 공급 </td><td> 029450 </td><td> 250 ML </td></tr><tr><td> Propidium의 요오드화물 </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 MG / ML, 희석 1시 15분 1 개 PBS에 </td></tr><tr><td> 질소 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 산소 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 18G × 1 ½ &quot;일반 베벨 바늘 </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> 베일 연구소, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro - manager.org</a> </td><td> 오픈 소스 소프트웨어 </td></tr><tr><td> 알코올 면봉 </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% 이소 프로필 알콜 면봉 </td></tr><tr><td> 마취 시스템 </td><td> 분자 이미징 제품, (주) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 커버 </td><td> 코닝 </td><td> 2940-245 </td><td> 1 ½, 24x50 mm 번호, 70% 이소프로판올 잎사귀와 소독 </td></tr><tr><td> Curity의 거즈 스폰지 (무균) </td><td> 켄달 </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 현미경 슬라이드 </td><td> 코닝 </td><td> 2948-75x25 </td><td> 미리 청소, 미리 청소하지 않을 경우 70 % 이소프로판올 잎사귀와 소독 </td></tr><tr><td> 강화 된 고급 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14090-11 </td><td> 이쌍, 스테인레스 강, 날카로운 날카로운 팁, 스트레이트 팁, 26mm 절단 가장자리, 11cm 길이 </td></tr><tr><td> 가열 담요 </td><td> Gaymar 산업 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 핫 비드 살균기 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 18000-45 </td><td> 사용하기 전에 약 30 분을 켜십시오;&gt; 200 도구를 소독 ° C 30 초에 </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy 접착제 </td><td> 엘머의 제품 </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> 연구실 테이프 (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 연구실 테이프 (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에 뚜껑스티로폼 배송 쿨러 </td><td></td><td></td><td> 이것은 수술 플랫폼으로 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 마이크로 해부 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 치아, 약간의 곡선, 0.8 mm 팁 폭, 4 &quot;길이 </td></tr><tr><td> 마이크로 해부 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> 톱니 모양의, 약간의 곡선, 0.8 mm 팁 폭, 4 &quot;길이 </td></tr><tr><td> 현미경 </td><td></td><td></td><td> 스피닝 디스크 공 촛점, XYZ 압전 단계, epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> 현미경 무대 삽입 </td><td> 응용 과학 계측 </td><td></td><td> 사용자는 두 원형 영상 포트와 함께, 제조 </td></tr><tr><td> MouseOx 산소 농도계, 소프트웨어 및 센서 </td><td> 스타 생명 과학 </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene 슈퍼 Versi - 드라이 연구소 soakers </td><td> 열 과학 </td><td> 74218-00 </td><td> 수술 플랫폼을 늘어서에 4 분에 잘라 내기 </td></tr><tr><td> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 </td><td> 제염업자 연구소 </td><td> 8901 </td><td> 가스를 ...을 축이다하는 데 사용하는, 폐 조직의 염증을 방지 </td></tr><tr><td> 슬립 - 팁 일회용 투베르쿨린 주사기 (1 ML) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo 날개 달린 주입 세트 </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G X ¾ &quot;매우가는 바늘, 12&quot;튜브 </td></tr><tr><td> Betadine 스프레이 </td><td> 퍼듀 제약 </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

유방암의 마우스 모델에서 종양 microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

종양 microenvironment는 종양 개시, 진행, 전이, 그리고 안티 - 암 치료에 대한 반응에 중추적 인 역할을 담당하고 있습니다. 입체 공동 문화 시스템은 자주 약물 반응에서의 역할 등의 종양 - 기질 상호 작용을 설명하다하는 데 사용됩니다. 그러나, 손상 microenvironment의 생체에서 발생하는 상호 작용의 많은 완전히 체외 설정에서 이러한 복제 할 수 없습니다. 따라서, 실시간으로 해당 프로세스를 직접 시각화 요법에 종양 반응을 이해하고 암 세포 이러한 반응에 영향을 미칠 수있는 기질 사이의 상호 작용을 식별하는 중요한 도구로 자리 잡았습니다. 여기에 직접 약물 배포, 암 세포 반응과 유방암 모델에서 전신 치료의 관리에 따라 종양 - 기질 상호 작용의 변화를 관찰 할 라이브, anesthetized 마우스 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하는 방법을 제공합니다. 우리는 labeli위한 절차를 설명NG 다른 종양 부품, 치료 반응을 관찰을위한 동물의 치료, 40 시간 영상에 대한 종양 조직을 노출하기위한 수술. 이 프로토콜에서 얻은 결과는 약물 침투, 암 세포의 죽음과 stromal 세포 마이그레이션과 같은 프로세스가 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 평가 될 수있는 시간 경과 영화입니다.

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을 설명<em&gt; 생체 내</em&gt; 및 단일 셀 해상도.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

이 절차의 전반적인 목표는 치료 약물 투여에 대한 약물 침투 및 치료 반응을 실시간으로 추적하는 것입니다. 이것은 먼저 동물에게 약물을 투여함으로써 달성됩니다. 다음으로, 종양을 포함하는 서혜부 유선은 피부 피판을 만들어 노출시킵니다.그런 다음 마우스를 현미경 단계로 옮기고 혈중 산소, 포화도 및 맥박수를 측정하고 유체 및 약물 또는 염료 투여를 위한 내주선을 삽입합니다. 마지막으로, 이후 분석을 위해 타임랩스 이미지를 획득합니다. 궁극적으로, 마우스 유방 종양의 라이브 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 통해 약물에 대한 반응으로 세포 사멸 또는 종양 기질 상호 작용의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 종양의 다양한 기질 구성 요소가 치료에 대한 반응에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 종양 미세환경 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하기 전에 약물 투여 및 이미징에 대한 일반적인 일정에 대한 서면 프로토콜을 참조하십시오. 뜨거운 구슬 살균기를 켜고 섭씨 200도 이상에 도달하도록 합니다.이빨이 있는 집게, 톱니 모양의 집게, 가위 두 쌍을 포함하여 수술 도구를 비누와 물로 씻은 후 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여 최소 30초 동안 살균합니다. 그렇다면 그들을 내버려 두십시오. 시원하다. 수술 플랫폼으로 사용할 스티로폼 뚜껑 위에 실험실 담그는 도구를 놓습니다.실험실 테이프를 사용하여 마취 시스템에 선이 있는 노즈콘을 실험실 담그는 기계에 부착하고 테이프를 통해 특정 18 x 1.5인치 바늘을 콧방울 양쪽의 스티로폼 뚜껑에 부착하여 콧방울을 제자리에 고정합니다. Betadine 멸균 거즈를 따로 보관하십시오. 70% 이소프로판올 2개로 현미경 슬라이드, 슈퍼 접착제, 1/2인치 너비의 실험용 테이프 4개를 닦습니다.유도실에서 동물을 마취한 후 동물이 심호흡을 하고 천천히 마우스를 복부 쪽이 위를 향하도록 하여 수술 플랫폼으로 옮깁니다. 높은 압력을 피하려면 수술 플랫폼으로 연결되는 마취 라인을 연 다음 유도 챔버의 마취 라인을 닫으십시오. 이소플루란의 농도를 4%에서 2.5%로 낮추십시오.발판 꼬집기를 수행하여 마취 깊이가 수술에 충분한지 확인하십시오.동물이 반응하지 않으면 실험실 테이프 4개를 사용하여 팔다리를 수술 플랫폼에 고정하고 전기 면도기를 사용하여 복부 표면의 털을 제거합니다. 70% 이소프로판올 물티슈를 사용한 다음 멸균 거즈에 베타딘을 바르고 가위와 이빨이 있는 집게를 사용하여 동물의 복부 표면을 소독합니다. 요도 위 약 3mm에서 xiphoid process까지 피하 복부 정중선을 절개합니다.가위와 톱니 모양의 집게로 복막에 구멍을 뚫거나 자르지 않도록 주의하십시오. 영상화할 종양이 포함된 서혜부 유선이 여전히 부착된 상태에서 복막강에서 피부를 부드럽게 분리했습니다. 유리 현미경 슬라이드를 피부 덮개에 대고 마우스를 무대에 올려 놓았을 때 종양의 대부분이 평평하게 놓이고 뒷다리에 의해 방해받지 않도록 합니다.현미경 슬라이드가 올바르게 배치되면 슈퍼 글루를 사용하여 슬라이드를 피부 외부 표면에 부착합니다. 동물의 팔다리를 고정하고 있는 실험실 테이프를 제거합니다. 마취 라인을 현미경 스테이지로 연 다음 마취 라인을 수술 플랫폼으로 닫습니다.동물을 현미경 스테이지로 빠르게 옮기기: 동물을 옮기면 마취 라인과 콧방울을 배치하고 고정하여 마우스가 마취 상태를 유지하고 편안한 자세를 유지할 수 있도록 합니다. 이소플루란의 농도를 1.5%로 감소종양을 노출시켜 현미경 스테이지의 유리로 덮인 이미징 포트 중 하나의 상단과 중앙에 위치하도록 합니다. 멸균 PBS 식염수 또는 프로피듐 요오드화물이 함유된 식염수가 포함된 1ml 주사기에 부착된 날개 달린 주입 세트가 부착된 내주 복강 내 라인을 삽입합니다.복강내 라인이 삽입되면 동물에게 100마이크로리터의 식염수에 프로피듐 요오드화물을 주입하고 이미징 세션이 완료될 때까지 매시간 50마이크로리터의 식염수에 프로피듐 요오드화물을 계속 주입합니다. 안안렌즈를 사용하여 종양이 올바른 위치에 있는지 확인하고 현미경 슬라이드와 복강내 선을 부드럽게 테이프로 감습니다. 슬라이드는 조직으로의 혈류가 방해받지 않을 만큼 충분히 느슨하게 고정되어야 합니다.현미경 슬라이드를 테이프로 줄이면 타임랩스 이미지를 획득하기 위해 동물의 호흡으로 인해 발생하는 이미징 아티팩트를 최소화하는 데 도움이 됩니다. 오픈 소스 소프트웨어 마이크로매니저를 사용하여 IRIS 또는 기타 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 컴파일 및 분석합니다. 형광 접합 DExT 가닥은 조직으로의 약물 전달을 위한 대리 마커로 사용할 수 있습니다.여기에 표시된 것은 유방암 세포에서 청색 형광 단백질을 발현하는 마우스에 주입된 fitzy conjugated two megadalton dextran IV의 도착입니다. 약물이 종양에 도착한 후 혈관 내 반감기 및 약물 분포를 결정하기 위해 혈관 외 및 확산을 이미지화할 수 있습니다. 여기서, 유방암 세포에서 청색 형광 단백질을 발현하고 골수성 세포에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 마우스에 주입된 LOR conjugated 10 kilodalton dextran IV의 유출 및 분포를 보여줍니다.이미징은 암세포가 겪는 세포 사멸 유형에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기서, 괴사 또는 세포사멸을 나타내는 구조적 핵 변화는 hisone two b에 접합된 녹색 형광 단백질을 발현하는 마우스에서 관찰됩니다. 독소루비신 치료 후, 화학요법으로 인한 암세포 사멸은 종종 면역 세포를 종양으로 반응적으로 동원합니다.다음은 유방암과 골수성 세포에서 각각 청색 및 녹색 형광 단백질을 발현하는 마우스에서 독소루비신을 사용한 급성 치료에 대한 이러한 기질 반응의 예입니다. 화학 요법에 대한 전반적인 기질 반응을 시각화하는 것 외에도 특수 기질 반응도 여기에서 시각화할 수 있습니다. 인접 세포에 의한 괴사 세포 물질의 식세포작용(phagocytosis)이 일단 숙달되면 보여진다.이 기술은 30-60분 안에 완료할 수 있으며 적절하게 수행되면 12-40시간 동안 동물을 이미지화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

난소암의 Orthotopic 동물 모델은 더 나은 인간의 질병을 복제하기 때문에 암 진행 및 치료 종양 반응의 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 마우스 모델 루시페라제 - 표현 난소 종양 세포의 intrabursal 주사를 받게됩니다. 치료는 경구 gavage를 통해 관리합니다. 종양 성장에 의해...

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

뼈 전이의 실험 마우스 모델은 루시페라제 내유 종양 세포를 표현 intracardiac 배달 아래 설립되었습니다. 종양 개발 및 osteolytic 병변을 발생은 bioluminescence과 마이크로 중부 표준시 이미징과 길이 방향 감시했다.

Bioluminescence 및 마이크로 중부 표준시 이미징과 함께 종양의 Metastases 및 Osteolytic 조직 손상을 모니터링

hypoxia inducible 인자 - 1α 활동 Bioluminescence 이미징은 유방암 뇌 전이의 마우스 모델에서 종양 intracranial hypoxia 개발을 모니터에 적용됩니다.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

근원:마리나 아란테스 라디키1, 빅터 카를로스 멜로1,빅토리아 파스 마차도1, 마르시아 크리스티나 올리베이라 다 로샤1, 자클린 바즈 데 올리베이라1, 루아나 크리스티나 카마르고1,2, 루이스 알렉상드르 뮐만1, 리카르도 벤테스 아제베도1, 소니아 나이르 바오1, 주앙 파울로 피게이로 롱고11브라질리아 대학교 생물과학연구소, 2브라질리아대학교 심리학연구소 기초심리과정학과이 비디오는 루시페라아제 발현 유방 선암종 세포를 암컷 마우스에 주입하고 생물발광 신호를 모니터링하여 시간 경과에 따른 원발성 및 전이성 종양 성장을 평가함으로써 생체 내에서 종양 진행을 추적하는 절차를...

암컷 마우스 모델에서 유방 종양 진행의 생물발광 이미징

동소 유방암 차 종양 모델 원발 종양의 외과 적 제거가 기재되어 자발적 전이를 생성하는 마우스의 수명을 연장한다. 종양 성장 및 진행 모니터링하고 루시퍼 형광 이미징에 의해 정량화된다.

자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

여기에서, 우리는 다양한 유방암 세포주에서 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질 발현을 수반하는 비침습적 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 마우스에서 실시간으로 종양 형성 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 기술을 제공한다.

생체 발광을 사용하여 마우스의 유방암 성장 및 전이성 콜로니 형성 모니터링

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

여기에서는 동물 모델에서 RNA 올리고머를 운반하는 자성 산화철 나노입자를 전이성 유방암으로 생체 내 전달하기 위한 프로토콜을 설명하여 발암성 핵산의 치료적 침묵을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공합니다.

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

학습하세요 마우스 유방암 모델에서 회전원반 공초점 현미경을 이용한 실시간 약물 침투 및 치료 반응 추적 방법을. 이 기술은 종양 미세환경에서 세포 사멸과 기질 반응을 단일 세포 수준에서 분석하여 항암 치료 효능을 평가합니다.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

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