유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

이 절차의 전반적인 목표는 치료 약물 투여에 대한 약물 침투 및 치료 반응을 실시간으로 추적하는 것입니다. 이것은 먼저 동물에게 약물을 투여함으로써 달성됩니다. 다음으로, 종양을 포함하는 서혜부 유선은 피부 피판을 만들어 노출시킵니다.

그런 다음 마우스를 현미경 단계로 옮기고 혈중 산소, 포화도 및 맥박수를 측정하고 유체 및 약물 또는 염료 투여를 위한 내주선을 삽입합니다. 마지막으로, 이후 분석을 위해 타임랩스 이미지를 획득합니다. 궁극적으로, 마우스 유방 종양의 라이브 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 통해 약물에 대한 반응으로 세포 사멸 또는 종양 기질 상호 작용의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 종양의 다양한 기질 구성 요소가 치료에 대한 반응에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 종양 미세환경 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하기 전에 약물 투여 및 이미징에 대한 일반적인 일정에 대한 서면 프로토콜을 참조하십시오. 뜨거운 구슬 살균기를 켜고 섭씨 200도 이상에 도달하도록 합니다.

이빨이 있는 집게, 톱니 모양의 집게, 가위 두 쌍을 포함하여 수술 도구를 비누와 물로 씻은 후 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여 최소 30초 동안 살균합니다. 그렇다면 그들을 내버려 두십시오. 시원하다. 수술 플랫폼으로 사용할 스티로폼 뚜껑 위에 실험실 담그는 도구를 놓습니다.

실험실 테이프를 사용하여 마취 시스템에 선이 있는 노즈콘을 실험실 담그는 기계에 부착하고 테이프를 통해 특정 18 x 1.5인치 바늘을 콧방울 양쪽의 스티로폼 뚜껑에 부착하여 콧방울을 제자리에 고정합니다. Betadine 멸균 거즈를 따로 보관하십시오. 70% 이소프로판올 2개로 현미경 슬라이드, 슈퍼 접착제, 1/2인치 너비의 실험용 테이프 4개를 닦습니다.

유도실에서 동물을 마취한 후 동물이 심호흡을 하고 천천히 마우스를 복부 쪽이 위를 향하도록 하여 수술 플랫폼으로 옮깁니다. 높은 압력을 피하려면 수술 플랫폼으로 연결되는 마취 라인을 연 다음 유도 챔버의 마취 라인을 닫으십시오. 이소플루란의 농도를 4%에서 2.5%로 낮추십시오.발판 꼬집기를 수행하여 마취 깊이가 수술에 충분한지 확인하십시오.

동물이 반응하지 않으면 실험실 테이프 4개를 사용하여 팔다리를 수술 플랫폼에 고정하고 전기 면도기를 사용하여 복부 표면의 털을 제거합니다. 70% 이소프로판올 물티슈를 사용한 다음 멸균 거즈에 베타딘을 바르고 가위와 이빨이 있는 집게를 사용하여 동물의 복부 표면을 소독합니다. 요도 위 약 3mm에서 xiphoid process까지 피하 복부 정중선을 절개합니다.

가위와 톱니 모양의 집게로 복막에 구멍을 뚫거나 자르지 않도록 주의하십시오. 영상화할 종양이 포함된 서혜부 유선이 여전히 부착된 상태에서 복막강에서 피부를 부드럽게 분리했습니다. 유리 현미경 슬라이드를 피부 덮개에 대고 마우스를 무대에 올려 놓았을 때 종양의 대부분이 평평하게 놓이고 뒷다리에 의해 방해받지 않도록 합니다.

현미경 슬라이드가 올바르게 배치되면 슈퍼 글루를 사용하여 슬라이드를 피부 외부 표면에 부착합니다. 동물의 팔다리를 고정하고 있는 실험실 테이프를 제거합니다. 마취 라인을 현미경 스테이지로 연 다음 마취 라인을 수술 플랫폼으로 닫습니다.

동물을 현미경 스테이지로 빠르게 옮기기: 동물을 옮기면 마취 라인과 콧방울을 배치하고 고정하여 마우스가 마취 상태를 유지하고 편안한 자세를 유지할 수 있도록 합니다. 이소플루란의 농도를 1.5%로 감소종양을 노출시켜 현미경 스테이지의 유리로 덮인 이미징 포트 중 하나의 상단과 중앙에 위치하도록 합니다. 멸균 PBS 식염수 또는 프로피듐 요오드화물이 함유된 식염수가 포함된 1ml 주사기에 부착된 날개 달린 주입 세트가 부착된 내주 복강 내 라인을 삽입합니다.

복강내 라인이 삽입되면 동물에게 100마이크로리터의 식염수에 프로피듐 요오드화물을 주입하고 이미징 세션이 완료될 때까지 매시간 50마이크로리터의 식염수에 프로피듐 요오드화물을 계속 주입합니다. 안안렌즈를 사용하여 종양이 올바른 위치에 있는지 확인하고 현미경 슬라이드와 복강내 선을 부드럽게 테이프로 감습니다. 슬라이드는 조직으로의 혈류가 방해받지 않을 만큼 충분히 느슨하게 고정되어야 합니다.

현미경 슬라이드를 테이프로 줄이면 타임랩스 이미지를 획득하기 위해 동물의 호흡으로 인해 발생하는 이미징 아티팩트를 최소화하는 데 도움이 됩니다. 오픈 소스 소프트웨어 마이크로매니저를 사용하여 IRIS 또는 기타 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 컴파일 및 분석합니다. 형광 접합 DExT 가닥은 조직으로의 약물 전달을 위한 대리 마커로 사용할 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 유방암 세포에서 청색 형광 단백질을 발현하는 마우스에 주입된 fitzy conjugated two megadalton dextran IV의 도착입니다. 약물이 종양에 도착한 후 혈관 내 반감기 및 약물 분포를 결정하기 위해 혈관 외 및 확산을 이미지화할 수 있습니다. 여기서, 유방암 세포에서 청색 형광 단백질을 발현하고 골수성 세포에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 마우스에 주입된 LOR conjugated 10 kilodalton dextran IV의 유출 및 분포를 보여줍니다.

이미징은 암세포가 겪는 세포 사멸 유형에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기서, 괴사 또는 세포사멸을 나타내는 구조적 핵 변화는 hisone two b에 접합된 녹색 형광 단백질을 발현하는 마우스에서 관찰됩니다. 독소루비신 치료 후, 화학요법으로 인한 암세포 사멸은 종종 면역 세포를 종양으로 반응적으로 동원합니다.

다음은 유방암과 골수성 세포에서 각각 청색 및 녹색 형광 단백질을 발현하는 마우스에서 독소루비신을 사용한 급성 치료에 대한 이러한 기질 반응의 예입니다. 화학 요법에 대한 전반적인 기질 반응을 시각화하는 것 외에도 특수 기질 반응도 여기에서 시각화할 수 있습니다. 인접 세포에 의한 괴사 세포 물질의 식세포작용(phagocytosis)이 일단 숙달되면 보여진다.

이 기술은 30-60분 안에 완료할 수 있으며 적절하게 수행되면 12-40시간 동안 동물을 이미지화할 수 있습니다.