2012년 12월 26일
우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 - 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.
다음 실험의 전반적인 목표는 효모 군집의 단면을 생성하여 군집 내에서 다양한 형광 세포 집단의 공간적 분포를 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 군집을 동결한 다음 군집 내 세포의 공간적 분포를 보존하기 위해 메탄올을 사용하여 고정함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 메탄올을 증발시켜 임베딩 OCT 화합물의 침투를 허용합니다.
그런 다음 내장된 군집은 동결 절편을 준비하기 위해 동결됩니다. 다음으로, 극저온 오메 절편입니다. 군집과 단면은 형광 현미경으로 이미지화할 수 있으며, 군집 내부의 형광 세포 집단의 공간적 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
광학 절편화와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이러한 군집 내부 깊숙한 곳에 있는 개체군의 공간적 분포를 드러낸다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 멤브레인 필터에서 효모 군집을 성장시킵니다. 이 프로토콜은 영하 20도의 냉동고에 있는 직경 6mm 멤브레인 필터의 8개 셀에 대해 2배 미만의 일반적인 커뮤니티에 해당합니다.
더 높은 형광을 유지하려면 watman 5 4 1 여과지 조각을 사용하여 1cm 직경의 바닥을 덮습니다. 글쎄, 이 여과지는 커뮤니티를 옮기는 운반체로 사용됩니다.나중 단계에서 우물에 섭씨 영하 20도, 메탄올 100%를 1밀리리터를 첨가하고 온도가 평형을 이루도록 우물을 섭씨 영하 20도로 둡니다. 이제 핀셋을 사용하여 멤브레인 필터를 군집체와 함께 액체 질소에 최소 15초 동안 담가 효모 군집을 동결합니다.
다음으로, 얼어붙은 군집을 섭씨 영하 20도의 우물로 옮깁니다. 냉동실의 메탄올은 커뮤니티가 수평으로 유지되도록 합니다. 메탄올에 담그면 20분 동안 기다리면 멤브레인 필터가 메탄올에서 분해되기 시작합니다.
20분 후, 캐리어 와트만 여과지를 사용하여 메탄올 웰에서 섭씨 영하 20도로 유지되는 차가운 페트리 접시로 커뮤니티를 옮깁니다. 전송할 때 캐리어 Watman 필터의 맨 위에 커뮤니티를 유지하십시오. 차가운 페트리 접시에 넣기 전에 다른 두꺼운 와트만 종이를 사용하여 메탄올 한 방울을 더 떨어냅니다.
이렇게 하면 메탄올 증발 시간이 시료 간에 일정하게 유지됩니다. 메탄올이 증발할 때까지 4-6시간 기다립니다. 적시에 증발을 종료하는 것이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다.
샘플이 과도하게 건조되는 것을 방지하려면 메탄올이 증발하는 동안 증발하는 동안 효모 군집의 상태를 주기적으로 확인하십시오. 샘플이 각 측면에서 약 2mm 이상의 여백을 가질 수 있을 만큼 충분히 큰 직사각형 입방체 알루미늄 호일 용기를 만듭니다. 이 용기의 바닥에 OCT 한 방울을 추가하여 샘플이 모든 면에서 OCT로 둘러싸여 있는지 확인합니다.
증발이 완료되면 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 샘플을 꺼냅니다. 효모 군집에서 다루지 않는 여과지 부분을 잘라냅니다. 이 단계를 신속하게 수행하는 것이 중요합니다.
샘플이 과도하게 건조되는 것을 방지합니다. 알루미늄 호일 용기의 바닥 표면에 커뮤니티를 놓고 즉시 커뮤니티 높이보다 3-4mm 높은 OCT로 샘플을 덮습니다. 10분 동안 기다립니다.
마지막으로, OCT가 포함된 샘플을 드라이아이스 위의 금속판에 올려 얼어붙은 커뮤니티를 섭씨 영하 20도 또는 영하 80도에서 동결 보관합니다. 얼어붙은 군집을 절편화하기 위해 극저온 절편 챔버의 온도를 섭씨 영하 25도로 설정하십시오. 온도가 챔버의 온도에 도달할 때까지 샘플을 챔버에 그대로 두십시오.
그런 다음 샘플에서 호일을 제거하고 여분의 OCT를 잘라냅니다. 극저온 마운트에 OCT 한 방울을 바르고 샘플을 극저온 마운트에 장착합니다. OCT 두께가 2-3mm가 되도록 노출된 watman 필터 용지가 있는 샘플 측면에 OCT를 균일하게 펴 바릅니다.
샘플의 모든 측면에서 2-3mm의 OCT 마진을 보장하면 섹션의 무결성을 보존하는 데 도움이 됩니다. 절편하기 전에 OCT를 저온 유지 장치 챔버 내부에서 동결시킵니다. OCT 샘플 블록의 측면을 사용하여 블레이드에 대해 샘플을 정렬합니다.
샘플이 블레이드에 대해 정렬되지 않은 경우 샘플의 모서리 또는 측면에서 절단이 시작됩니다. 블레이드가 샘플 블록의 완벽하게 수직면을 절단하도록 마운트를 조정하십시오. 효모 군집의 일반적인 단면은 두께가 약 14마이크로미터입니다.
단면을 절단한 후에는 실온에 보관된 현미경 슬라이드를 사용하여 단면을 수집합니다. 슬라이드를 절단 부분으로 천천히 이동하면 섹션이 녹아 현미경으로 전송됩니다. 최대 18개의 섹션을 하나의 슬라이드로 전송할 수 있습니다.
이미징하기 전에 슬라이드를 저온, 가급적이면 섭씨 영하 20도의 낮은 온도에서 보관하십시오. 최대 형광 신호를 위해 섭씨 4도에서 일주일 동안 유지하면 신호 손실이 최소화됩니다. 이미징은 절편 직후에 수행해야 합니다.
동일한 조건에서 성장한 효모 군집의 수직 단면에 대한 대표적인 형광 이미지가 여기에 나와 있습니다. 군집은 형광 단백질로 태그가 지정된 visier의 두 가지 광방성 균주로 구성됩니다. M cherry는 빨간색으로 시각화되고 Y-E-G-F-P는 녹색으로 시각화되어 공간을 포함한 공유 자원에 대한 경쟁은 수직 단면에 표시되는 기둥 패턴으로 이어집니다.
단일 셀까지의 해상도는 단면에서 분해될 수 있습니다. 이 그림은 하단 패널에 표시된 메탄올 고정과 상단 패널에 표시된 메탄올 고정 없이 얻은 단면을 비교합니다. 형광 신호는 커뮤니티 섹션에서 수정되지 않고 보존되지만 커뮤니티의 무결성이 손상됩니다.
그 결과, 일부 세포는 단면의 가장자리 주위를 떠다니며 전체 수율은 고정된 군집에 비해 낮습니다. 메탄올 고정은 군집 세포를 함께 유지하지만 군집 높이의 감소에서 관찰되는 것처럼 수축을 유발합니다. 이 그림은 DS RED 및 YFP 형광 단백질로 된 바이시어 티의 두 가지 프로토픽 균주로 구성된 효모 군집의 대표적인 명시야 및 형광 수직 단면을 보여줍니다.
군집 상부에 있는 세포는 모세포와 구별되는 크라운을 형성하며, 명시야에서 더 강한 산란과 더 밝은 형광을 특징으로 합니다. 이러한 패턴은 효모 군체에서 보고된 분화 패턴과 일치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 효모 군집 내의 형광 su 공간 패턴을 검사하기 위해 냉동 절편을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰하기 위해 효모 군집을 동결 및 냉동 단면하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 메탄올 고정 및 OCT 임베딩을 활용하여 형광 단백질을 보존하면서 세포의 공간 분포를 유지합니다.
Understanding spatial organization in microbial communities is critical for de-risking target validation in antimicrobial and microbiome therapeutics. Cryosectioning yeast communities enables high-resolution fluorescence mapping of gene expression and cell distribution, supporting mechanistic insights into community function and stability. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native spatial architecture without disrupting fluorescent reporters.
The method integrates into discovery biology workflows by enabling spatially resolved fluorescence readouts that inform target engagement and pathway modulation in microbial systems.