Name: 형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 효모 군집의 형광 패턴 분석을 위한 크라이오섹셔닝 기법을. 메탄올 고정과 OCT 임베딩을 활용하여 세포 공간 분포를 보존하고 형광 현미경으로 단면 이미징을 수행하는 방법입니다.

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우리는 그라 이오 스탯을 사용하는 권한에 대해 프레드 허친슨 암 연구 센터의 조나단 쿠퍼 연구소 감사드립니다. 이 작품은 NIH와 WM 중사 님 재단에 의해 지원되었다. BM은 생명 과학 연구 재단의 고든 무어와 베티의 동료입니다. 우리는 우리와의 고정 프로토콜을 공유 다니엘 Gottschling에 감사하고 있습니다.

1. 효모 커뮤니티 해결 <ol><li> 막 필터 (, 그림 2A 예를 들어, Millipore MF 막 필터)에 효모 커뮤니티를 성장. 이 프로토콜은 6mm 지름의 멤브레인 필터에 미만 2x10 8 셀의 전형적인 지역 사회에 해당합니다. </li><li> 잘 1cm 지름 (그림 2B)의 하단을 충당하기 위해 워트 먼지 541 필터 종이를 사용합니다. 이 워트 먼지 용지는 나중에 단계에서 지역 사회를 전송하는 캐리어로 사용됩니다. 잘에 1 ML 100 % 메탄올을 추가하고 평형을 할 수있는 온도 -20에서 잘 ° C 둡니다. </li><li> dewar의 액체 N 2 놔. 액체에 적어도 15 초 동안 지역 사회를 찍어 N 2 트위터 (그림 2C)를 사용하여 액체 질소에 지역 사회를 멈춰 봐. </li><li> -20 ° C의 메탄올 (그림 2D)의 우물 냉동 사회를 전송합니다. 메탄올에 잠수 할 때 지역 사회가 수평 유지되어 있는지 확인합니다.20 분 동안 기다리십시오. MF 막 필터는 메탄올에서 분해하기 시작합니다. </li><li> 잘 메탄올의 증발 (그림 2E)에 -20 ° C에서 보관 감기에 페트리 접시에 메탄올의 커뮤니티 캐리어를 사용하여 워트 먼지 541 필터 종이를 전송합니다. 전송하면, 캐리어 워트 먼지 필터의 상단에있는 지역 사회를 유지하고 추위를 페트리 접시에 올려 놓기 전에 두꺼운 워트 먼지 용지의 다른 부분을 사용하여 메탄올의 추가 하락을 멀리립니다. 이 증발 시간이 샘플에서 샘플에 일관성이 있는지 확인합니다. </li><li> 캐리어 워트 먼지 필터가 건조해질 때까지 증발하는 데 4 ~ 6 시​​간 정도 기다립니다. 부족 증발 sectioning을 방해 잔류 메탄올을 남긴다. 지역 사회에 원인의 균열과 변형을 걸쳐 건조. </li><li> -20 ° C의 냉동고의 샘플을보세요. 커뮤니티에 포함되지 워트 먼지 541 필터 종이를 멀리 자른다. </li><li> 샘플은 적어도 ~ 2mm 여백에서이되도록 충분히 큰 사각형 입방 알루미늄 호일 컨테이너를 확인각면 (그림 2F). 알루미늄 호일 컨테이너의 바닥 표면에 커뮤니티를 놓고, 즉시 3 10월와 샘플 ~ 지역 사회의 높이 위의 4mm을 다룹니다. 중요한 경우, 샘플의 방향은 컨테이너의 측면과 관련하여이 단계에서 조정할 수 있습니다. 10 분 기다립니다. </li><li> 고정하는 드라이 아이스에 금속 접시에 월 임베디드 샘플을 놓습니다. -20 ° C 또는 -80 ° C의 냉동고에서 냉동 커뮤니티를 저장합니다. </li></ol> 2. 형광 이미징을위한 냉동 커뮤니티 Sectioning <ol><li> -25 ° C에 cryosection 챔버의 온도를 설정하고 그 온도가 챔버의 온도를 도달 할 때까지 챔버에서 샘플을 둡니다. </li><li> 마운트에 10월 한 방울를 적용한 후에 cryo-마운트에 샘플을 탑재합니다. 10월 두께 2-3 MM이야 수 있도록 노출 워트 먼지 필터 종이 (컨테이너의 하단)와 시료의 측면에 균일하게 10월을 알리십시오. SE 전에 그라 이오 스탯 챔버 내부 10월 동결하자ctioning. 샘플의 모든 측면에 2~3밀리미터의 10월 마진을 보장하는 것은 섹션의 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 10월 샘플 블록의 측면은 샘플을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플이 블레이드에 대해 정렬되지 않은 경우 sectioning은 샘플의 구석 또는 측면에서 시작됩니다. 블레이드는 샘플 블록의 완벽한 수직 (또는 수평)의 얼굴을 잘라 수 있도록 마운트를 조정합니다. </li><li> 효모 지역 사회를위한 일반적인 섹션 ~ 14 μm 두께입니다. 섹션을 절단 한 후, 천천히 컷 섹션으로 슬라이드를 접근하여 섹션을 수집 실온에서 보관 현미경 슬라이드를 사용합니다. 섹션은 녹기과 현미경 슬라이드에 전송합니다. 18 섹션으로 하나의 슬라이드에 전송 할 수 있습니다. </li><li> 바람직하게는 -20 차가운 온도, ° C, 이미징 전에에서 슬라이드를 저장합니다. 4 ° C.에 1 주일 동안 보관했을 때 신호의 손실을 최소화합니다 최대 형광 신호를 들어, 영상은 바람직 sectioning 후 즉시 이루어집니다. </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 절차는 효모 지역 사회의 내부 구조를 검사 할 수있는 방법을 제공합니다. 메탄올 고정 단계 8 효모 식민지는 융통성하게하고 식민지의 무결성을 유지하지만, 또한 그 결과를 해석에 고려되어야 수축 8됩니다. 우리는 일반적으로 직접 구를 해결하지 않고 10월에 포함 된 식민지에 비해 효모 식민지의 높이에서 30 %의 수축을 참조하십시오. 수축을 방지하기 위해 cryosectioning에 대한 대안 접근 방식은 직접 10월에있는 커뮤니티를 포함하고이를 고정하는 것입니다. 형광은 직접 삽입에 따라 방법으로 보존하지만, 단점은 각 섹션 내에서 세포를 함께 구속하지 않는입니다. 그 결과, 거리에 섹션 부동, 그리고 섹션의 가장자리에있는 세포의 일부가 sectioning 과정에서 장애 (그림 4) 고통 가능성이 더 높습니다. 그는에 초점을 맞춘 아니지만다시, 효모 지역 사회의 크로스 섹션...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 100 % 메탄올 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 - 테크 10월 컴파운드 </td><td> Andwin 과학 </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 워트 먼지 학년 번호 541 수량 필터 종이 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF 막 필터 </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 cryosectioning

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

미생물은 일반적으로 지역 사회에 살고 있습니다. 지역 사회 내에서 세포의 공간적 조직은 지역 사회 (1)의 생존과 기능에 영향을 미칠 것으로되어 있습니다. 공 촛점과 두 광자 현미경 등의 광학 sectioning 기술, 박테리아 및 archaeal 지역 사회 2,3의 공간 조직을 관찰하는 데 유용 입증했습니다. 공 촛점 이미징 및 효모 식민지의 물리적 sectioning의 조합이 세포 4의 내부 조직을 밝혔다. 그러나, 공 촛점 또는 두 광자 현미경을 사용하여 직접 광학 sectioning는 효모 식민지에 깊은 몇 가지 세포 레이어에 도달 할 만 수있었습니다. 이 제한 때문에 효모 세포 4 빛의 강력한 분산의 가능성이 높습니다. 여기, 우리는 고정와 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회 내에서 형광 세포의 공간적 분포를 얻기 위해 cryosectioning에 따라 방법을 제시한다. 우리는 정착액 에이전트로 메탄올을 사용하여세포의 공간적 분포를 유지합니다. 고정 사회는 그라 이오 스탯에 10월 화합물, 냉동 및 cryosectioned으로 침투하고 있습니다. 섹션의 형광 이미징은 지역 사회의 형광 세포의 내부 조직을 드러내고있다. 빨간색과 녹색 형광 단백질을 표현 변종으로 구성된 효모 지역 사회의 예로는뿐만 아니라 효모 식민지 2,3에서 유전자 발현의 같은 형광 세포의 공간 분포를 표시하는 방법 cryosectioning 방법의 가능성을 보여줍니다. 우리의 초점을 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회에있다하더라도, 같은 방법은 잠재적으로 다른 미생물 커뮤니티를 검사하기 위해 적용 할 수 있습니다.

붉은 색과 녹색으로 태그 경쟁력 인구에게 6를 포함하는 효모 지역 사회의 수직 교차 부분의 형광 이미지는 그림 3에 표시됩니다. 이러한 커뮤니티, 효모 및 공간 등의 공유 자원, 대한 경쟁의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 그들의 수직 교차 섹션에 표시 주상 패턴 7로 연결됩니다. 단일 셀 해상도 아래는 크로스 섹션에서 해결 할 수 있습니다. 그림 3은 그림 1의 프로토콜 다음과 같은 (아래)와 (위) 메탄올 - 고정하지 않고 얻은 복제 사회의 크로스 섹션을 비교합니다. 고정하지 않고 효모 커뮤니티를 cryosectioning를 들어, 프로토콜은 단계 1.8부터 시작을합니다. 형광 신호는 수정하지 않고 지역 사회의 섹션에 보존되어 있지만, 지역 사회의 무결성이 손상됩니다. 결과 : (1) 일부 셀 부분의 가장자리 주위에 거리에 떠 있으며, (2) 전체 순연령 (즉, 섹션의 일부 sectioning ...

우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 - 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.

형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

다음 실험의 전반적인 목표는 효모 군집의 단면을 생성하여 군집 내에서 다양한 형광 세포 집단의 공간적 분포를 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 군집을 동결한 다음 군집 내 세포의 공간적 분포를 보존하기 위해 메탄올을 사용하여 고정함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 메탄올을 증발시켜 임베딩 OCT 화합물의 침투를 허용합니다.그런 다음 내장된 군집은 동결 절편을 준비하기 위해 동결됩니다. 다음으로, 극저온 오메 절편입니다. 군집과 단면은 형광 현미경으로 이미지화할 수 있으며, 군집 내부의 형광 세포 집단의 공간적 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.광학 절편화와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이러한 군집 내부 깊숙한 곳에 있는 개체군의 공간적 분포를 드러낸다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 멤브레인 필터에서 효모 군집을 성장시킵니다. 이 프로토콜은 영하 20도의 냉동고에 있는 직경 6mm 멤브레인 필터의 8개 셀에 대해 2배 미만의 일반적인 커뮤니티에 해당합니다.더 높은 형광을 유지하려면 watman 5 4 1 여과지 조각을 사용하여 1cm 직경의 바닥을 덮습니다. 글쎄, 이 여과지는 커뮤니티를 옮기는 운반체로 사용됩니다.나중 단계에서 우물에 섭씨 영하 20도, 메탄올 100%를 1밀리리터를 첨가하고 온도가 평형을 이루도록 우물을 섭씨 영하 20도로 둡니다. 이제 핀셋을 사용하여 멤브레인 필터를 군집체와 함께 액체 질소에 최소 15초 동안 담가 효모 군집을 동결합니다.다음으로, 얼어붙은 군집을 섭씨 영하 20도의 우물로 옮깁니다. 냉동실의 메탄올은 커뮤니티가 수평으로 유지되도록 합니다. 메탄올에 담그면 20분 동안 기다리면 멤브레인 필터가 메탄올에서 분해되기 시작합니다.20분 후, 캐리어 와트만 여과지를 사용하여 메탄올 웰에서 섭씨 영하 20도로 유지되는 차가운 페트리 접시로 커뮤니티를 옮깁니다. 전송할 때 캐리어 Watman 필터의 맨 위에 커뮤니티를 유지하십시오. 차가운 페트리 접시에 넣기 전에 다른 두꺼운 와트만 종이를 사용하여 메탄올 한 방울을 더 떨어냅니다.이렇게 하면 메탄올 증발 시간이 시료 간에 일정하게 유지됩니다. 메탄올이 증발할 때까지 4-6시간 기다립니다. 적시에 증발을 종료하는 것이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다.샘플이 과도하게 건조되는 것을 방지하려면 메탄올이 증발하는 동안 증발하는 동안 효모 군집의 상태를 주기적으로 확인하십시오. 샘플이 각 측면에서 약 2mm 이상의 여백을 가질 수 있을 만큼 충분히 큰 직사각형 입방체 알루미늄 호일 용기를 만듭니다. 이 용기의 바닥에 OCT 한 방울을 추가하여 샘플이 모든 면에서 OCT로 둘러싸여 있는지 확인합니다.증발이 완료되면 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 샘플을 꺼냅니다. 효모 군집에서 다루지 않는 여과지 부분을 잘라냅니다. 이 단계를 신속하게 수행하는 것이 중요합니다.샘플이 과도하게 건조되는 것을 방지합니다. 알루미늄 호일 용기의 바닥 표면에 커뮤니티를 놓고 즉시 커뮤니티 높이보다 3-4mm 높은 OCT로 샘플을 덮습니다. 10분 동안 기다립니다.마지막으로, OCT가 포함된 샘플을 드라이아이스 위의 금속판에 올려 얼어붙은 커뮤니티를 섭씨 영하 20도 또는 영하 80도에서 동결 보관합니다. 얼어붙은 군집을 절편화하기 위해 극저온 절편 챔버의 온도를 섭씨 영하 25도로 설정하십시오. 온도가 챔버의 온도에 도달할 때까지 샘플을 챔버에 그대로 두십시오.그런 다음 샘플에서 호일을 제거하고 여분의 OCT를 잘라냅니다. 극저온 마운트에 OCT 한 방울을 바르고 샘플을 극저온 마운트에 장착합니다. OCT 두께가 2-3mm가 되도록 노출된 watman 필터 용지가 있는 샘플 측면에 OCT를 균일하게 펴 바릅니다.샘플의 모든 측면에서 2-3mm의 OCT 마진을 보장하면 섹션의 무결성을 보존하는 데 도움이 됩니다. 절편하기 전에 OCT를 저온 유지 장치 챔버 내부에서 동결시킵니다. OCT 샘플 블록의 측면을 사용하여 블레이드에 대해 샘플을 정렬합니다.샘플이 블레이드에 대해 정렬되지 않은 경우 샘플의 모서리 또는 측면에서 절단이 시작됩니다. 블레이드가 샘플 블록의 완벽하게 수직면을 절단하도록 마운트를 조정하십시오. 효모 군집의 일반적인 단면은 두께가 약 14마이크로미터입니다.단면을 절단한 후에는 실온에 보관된 현미경 슬라이드를 사용하여 단면을 수집합니다. 슬라이드를 절단 부분으로 천천히 이동하면 섹션이 녹아 현미경으로 전송됩니다. 최대 18개의 섹션을 하나의 슬라이드로 전송할 수 있습니다.이미징하기 전에 슬라이드를 저온, 가급적이면 섭씨 영하 20도의 낮은 온도에서 보관하십시오. 최대 형광 신호를 위해 섭씨 4도에서 일주일 동안 유지하면 신호 손실이 최소화됩니다. 이미징은 절편 직후에 수행해야 합니다.동일한 조건에서 성장한 효모 군집의 수직 단면에 대한 대표적인 형광 이미지가 여기에 나와 있습니다. 군집은 형광 단백질로 태그가 지정된 visier의 두 가지 광방성 균주로 구성됩니다. M cherry는 빨간색으로 시각화되고 Y-E-G-F-P는 녹색으로 시각화되어 공간을 포함한 공유 자원에 대한 경쟁은 수직 단면에 표시되는 기둥 패턴으로 이어집니다.단일 셀까지의 해상도는 단면에서 분해될 수 있습니다. 이 그림은 하단 패널에 표시된 메탄올 고정과 상단 패널에 표시된 메탄올 고정 없이 얻은 단면을 비교합니다. 형광 신호는 커뮤니티 섹션에서 수정되지 않고 보존되지만 커뮤니티의 무결성이 손상됩니다.그 결과, 일부 세포는 단면의 가장자리 주위를 떠다니며 전체 수율은 고정된 군집에 비해 낮습니다. 메탄올 고정은 군집 세포를 함께 유지하지만 군집 높이의 감소에서 관찰되는 것처럼 수축을 유발합니다. 이 그림은 DS RED 및 YFP 형광 단백질로 된 바이시어 티의 두 가지 프로토픽 균주로 구성된 효모 군집의 대표적인 명시야 및 형광 수직 단면을 보여줍니다.군집 상부에 있는 세포는 모세포와 구별되는 크라운을 형성하며, 명시야에서 더 강한 산란과 더 밝은 형광을 특징으로 합니다. 이러한 패턴은 효모 군체에서 보고된 분화 패턴과 일치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 효모 군집 내의 형광 su 공간 패턴을 검사하기 위해 냉동 절편을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning

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