Name: 에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석 Plasmodium berghei ANKA에 감염된 마우스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 배우세요 뇌혈관에서 염증성 백혈구를 분리하고 유동세포측정법으로 면역표현형을 분석하는 방법을 Plasmodium berghei ANKA 감염 마우스 모델에서. 이 기술은 뇌말라리아 병리 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 기술 지원을 위해 양을 리아나 Mackiewicz 감사드립니다. 이 작품은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 및 호주 정부 국립 보건 의학 연구위원회 IRIISS 및 프로젝트 기금 1,031,212을 통해 가능하게되었다.

1. P.있는 마우스의 감염 berghei - ANKA <ol><li> 녹이 cryopreserved P.의 나누어지는 berghei ANKA pRBC. </li><li> 두 손으로 구속 기법을 사용하여 뇌성 말라리아에 저항력이 BALB / C 공여 마우스를 (8-12주짜리) 구속. 1 ML의 인슐린 주사기 (28G 바늘을)를 사용 pRBC의 100-200 μl와 마우스를 주입. 일상적으로, 1-2 기증자 마우스가 주입되어 있습니다. </li><li> 후 감염 4~5일에서 (PI) 케이지에서 기증자 마우스를 제거하고 워크 스테이션이나 일회용 작업 패드에 놓으십시오. </li><li> 부드럽게 꼬리의 끝 부분에 마우스를 구속하고 작은 가위를 사용하여 (약 1mm) 꼬리 끝을 잘라. 또는 25 G 바늘을 사용하여 작은 꼬리 구멍이 수행 될 수 있습니다. </li><li> 불투명 엔드 현미경 슬라이드의 끝 부분 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액 한 방울을 넣으십시오. </li><li> 45 ° 각도에 두 번째 슬라이드 (확장기)를 놓고 피 드롭으로 다시. 피가 가장자리를 따라 펼쳐지되면, 확장기 - 슬라이드 이브를 밀어핏자국을 할 수있는 현미경 슬라이드에 걸쳐 nly. 비방은 건조한 공기 할 수 있습니다. </li><li> 10 분에 신선하게 조리 된 Giemsa에서 슬라이드를 착색 한 후 30 초 100 %의 메탄올에 피 묻은 얼룩을 수정합니다. </li><li> 1 분에 물을 실행에 핏자국을 씻어, 공기 건조 할 수 있으며 현미경 (100x, 석유 침적)에서 슬라이드를 검사합니다. 1000 적혈구 내에서 pRBC을 열거하고 %의 parasitemia를 계산합니다. 그들이 실험 동물의 감염 출혈이되기 전에 기증자 마우스는 2.5-5 % 사이 parasitemia 수준에 도달해야합니다. </li><li> heparinized 마이크로 혈소판 모세관을 사용하여 복고풍 궤도 출혈에 의해 기증 마우스에서 혈액을 수집합니다. 모든 실험은 월터 엘리자 홀 연구소 및 동물 윤리위원회의 요구 사항을 준수 수행됩니다. 지역 동물 윤리위원회의 요구에 따라 다른 출혈이 절차를 사용할 수 있습니다. 1X10 6 pRBC/0.2 ML의 최종 농도에 RPMI 매체에서 혈액 필요한 양을 분해. 그을 고려일반 마우스 혈소판 ~ 6x10 9 적혈구 / 1 ML입니다. </li><li> intraperitoneally (IP) 1x10 6 pRBC/0.2 ML을 주입하여 실험 C57BL / 6 마우스 (8-12주 이전)를 감염. </li><li> 감염된 쥐 parasitemia 수준을 모니터링하려면 단계 1.3-1.8를 따르십시오. Parasitemia는 하루에 2 ~ 3 파이부터 2-3일 모든 결정해야 </li><li> 쥐가 hunched 모양과 같은 매니페스트 수도 C57BL에서 / 6 심한 말라리아의 증상은, 모피 및 낮은 활동을 주름 옷깃이 달린. 일부 마우스는이 단계에서 복구 할 수 있지만, 자기 righting 반사 손실에 진행은 돌이킬 수없는 질병을 나타냅니다과 동물은 euthanized해야합니다. </li></ol> 2. 마우스 및 뇌 추출의 Intracardial 재관류 <ol><li> 60cm 열 스탠드 상단에 부착 된 열 홀더에 500 ML 저장소를 확보하여 수동 중력 재관류 시스템을 조립. 저수지의 바닥 끝 부분에 플라스틱 튜브를 연결하고 버퍼 흐름을 제어 할 수있는 튜브 클램프를 고정하십시오. 23 G 바늘에 튜브를 연결합니다. FilPBS (22 ° C에 보관)과 저수지까지 내 말은, 클램프 및 모든 기포를 제거하는 튜브를 통해 실행하는 버퍼를 허용 엽니 다. </li><li> 안락사시켜야 P. CO 2 흡입하여 berghei ANKA에 감염된 마우스. 페달, 궤도 및 호흡기 반응의 부재에 의해 죽음을 확인합니다. </li><li> dorsally 플라스틱 트레이에 포함 된 스티로폼 분해 보드에 뒷다리와 앞 손으로 euthanized 마우스를 핀. 지역 동물 윤리위원회 요구 사항 마취에 따라 intracardial pefusion의 사전 개시를 관리 할 수​​있다. </li><li> 70 %의 에탄올과 복부 측면을 닦아주십시오. </li><li> 흉강을 노출하는 중간 선을 따라 피부를 열고 대형 가위와 집게를 사용하십시오. 측면에 접어 핀 피부. </li><li> 고급 집게로 가슴을 잡고 가로막을 절감하고 가슴의 양쪽을 따라 갈비뼈를 severing. 대용량의 혈관을 손상 않도록주의보십시오. </li><li> 머리를 느슨하게 옆에있는 흉골에 의해 흉곽을 고정. </li><li> 심실의 지혜를 개최H 고급의 포셉, 고급 가위로 조심스럽게 절개 우심방. </li><li> PBS가 실행되는 동안 오름차순 대동맥으로 왼쪽 심실에 비중 재관류 시스템에 부착 23G 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝의 0.5 cm를 삽입합니다. </li><li> 5 분 또는 유출 될 때까지 마우스를 Perfuse 것은 분명하다. </li><li> 고정 해제 마우스와 복부에 놓여 있었다. 70 %의 에탄올과 머리를 닦아주십시오. </li><li> 큰 가위를 사용하여, 그냥 자궁 경부 척추 영역 위에 몫을합니다. </li><li> 중간 꼬리 - 뱃 부리 장식이있는 컷이 두개골을 노출 떨어져 두개골의 기지에서 시작, 피부 껍질을 벗기면하기 위해 고급 가위를 사용합니다. </li><li> 머리 개최, 각 궤도 구멍에 작은 가위 블레이드를 배치하고 궤도 사이의 몫을합니다. </li><li> 시상 봉합을 따라 길이 방향 절단을 확인하고 조심스럽게 바깥쪽으로 각각의 뇌 반구에있는 두개골 껍질을 벗기면. </li><li> 주걱 사용하여 부드럽게 뇌를 들고 RPMI 매체를 포함하는 10 ML의 원심 분리기 튜브에 넣습니다. </li></ol>3. 뇌 - 분리 된 백혈구의 절연 (BSL) <ol><li> 안전 캐비닛에서 근무 곳 갓 RPMI 조직 문화 매체 3-5 ML을 포함하는 배양 접시에있는 스테인리스 스틸 셀 스트레이너 (40-60 메쉬 크기)의 상​​단에 뇌를 수확. </li><li> 작은 조각으로 뇌 조직을 잘라 버릴거야. </li><li> 크리스탈 플런저를 사용하여 셀 스트레이너를 통해 뇌 조직의 작은 조각을 밀어 넣습니다. </li><li> 4에 10 분 ° C.에 250 XG에서 10 ML 튜브와 원심 분리기에 뇌 homogenate를 전송 </li><li> 0.05 % Collagenase D 및 2U/ml DNAse I.를 포함 RPMI 매체의 3 ML에서 펠렛을 분해 </li><li> 실온에서 30 분을위한 혼합물을 회전합니다. 70 μm 나일론 셀 스트레이너 및 /를 통해 혼합물을 눌러 5 분 동안 얼음에 잠복기에 의한 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 실온에서 20 분 400 XG (브레이크)에서 7 ML 30 % Percoll 쿠션과 원심 분리기에 뇌 homogenate를 놓는다. </li><li> 5 분에 대한 얼음에 붉은 혈액 세포 용해 버퍼와 품다 1 ML에 Resuspend 펠릿intracardial 재관류에 의해 뇌에서 제거 할 수 없습니다 자기편 pRBC을 lyse. </li><li> RPMI 매체 9 ML을 추가, 4 ° C.에 10 분을 위해 250 XG에서 세포와 원심 분리기를 씻어 </li><li> RPMI 매체와 Eppendorf 튜브에 전송 세포의 50-100 μl에 Resuspend BSL 함유 펠렛. </li><li> 가능한 세포의 식별 Trypan 파란색으로 셀 샘플의 5-10 μl 나누어지는 1시 2분을 희석. </li><li> hemocytometer를 사용하여 현미경으로 가능한 셀을 계산합니다. 6 일 파이 (Π) 이후, P.에서 berghei ANKA에 감염된 마우스는 20,000-100,000 BSLs을 복구 할 수 있습니다, 신경 증상을 표시합니다. </li></ol> 4. 여러 가지 빛깔의의 유동 세포 계측법에 의해 BSL의 Immunophenotyping <ol><li> 4에 10 분 ° C에 250 XG에서 세포를 원심 분리기 (PBS, 1 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 2mm EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 착색 버퍼 50 μl의 표면에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 대기음. </li><li> anti-CD16/32 항체 (Fcblock)를 정화의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 1 세포를 배양얼음에 0 분. </li><li> 얼룩 버퍼 1 ML과 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> 필요한 형광 항체의 미리 정해진 최적의 dilutions 즉, 안티 - CD4, 항 CD8, 안티 TCR 및 안티 NK1.1를 포함하는 버퍼를 착색의 50 μl에 Resuspend 세포. </li><li> 얼음에 1 시간에 품다. </li><li> 얼룩 버퍼 1 ML과 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> PBS 100 μl에 세포를 Resuspend. </li><li> 유동 세포 계측법 플라스틱 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 흐름 cytometer를 사용, 적어도 5,000-10,000 이벤트를 취득. 필요에 따라 적절한 흠없는 셀 컨트롤과 fluorochrome 보상 샘플이 포함되어야합니다. </li><li> 적절한 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. </li></ol>

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<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

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BSL의 절연 및 분석은 특성화 및 실험 마우스 모델에서 조직 부상이나 감염에 대한 응답으로 뇌에 이주하는 염증 세포의 정량화 할 수있는 방법입니다. 장기 추출 및 후속 전지 분리하기 전에 혈액 구획의 제거를위한 intracardial 재관류 단계의 도입은 비 염증성 순환 백혈구와 염증 세포의 오염을 방지하기 위해 유용합니다. 이 염증 세포가 뇌 실질 5 침투하는 등 손쥐 뇌척수염 바이러스 등의 neurotropic 감염에 필수적인 요건이 될하지만, 감염된 적혈구와 염증 백혈구가 남아 혈관 내에서 분리 된 것이 아니라 뇌 조직에 침투하는, 쥐 말라리아에 특히 관련이 없을 수도 . 따라서, 말라리아에 감염된 쥐 intracardial 재관류는 BSL의 분석을 권장해서는 안뿐만 아니라 유용 할 수 있습니다기생충 - 조직 격리 10,11의 평가. 비 염증 순환 백혈구와 마찬가지로, 말라리아 기생충의 미숙 한 형태의 혈관 내피을 준수 할 수 있으며, 재관류 절차에 의해 제거해야합니다. 반면, 점...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 및 버퍼 </td></tr><tr><td> Giemsa의 다 쥐르 eosin의 메틸렌 블루 용액 </td><td> 머크 Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 증류수에 희석 1시 10분 </td></tr><tr><td> RPMI 배지 </td><td></td><td></td><td> 마우스 tonicity </td></tr><tr><td> 마우스 tonicity PBS </td><td></td><td></td><td> 20 밀리미터 인산 나트륨, 0.149 NaCl, pH를 7.3 </td></tr><tr><td> 0.4 % Trypan 파랑 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> T-8154 </td><td> 1시 2분 희석 </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> 생물 화학 워딩 턴 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) I </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> D4263-5VL </td><td> 소 췌장에서 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-0891-01 </td><td> PBS의 30 % 솔루션 </td></tr><tr><td> Ultrapure 트리스 </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> 염화 암모늄 (NH 4 망할 CIA) </td><td> AnalaR </td><td> 10,017 </td><td></td></tr><tr><td> 적혈구 용해 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 17 MM 트리스, 14nM NH 4 CIA 같으니, pH를 7.2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나트륨 소금 </td><td> 머크 </td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M, pH를 7.2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 항체 conjugates </td></tr><tr><td> 안티 마우스 CD16/CD32 (FC 블록), 클론 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;TD&gt; 553142 </td><td> 50 μl 착색 버퍼 1 μl (0.5mg/50 ML) </td></tr><tr><td> FITC - 안티 - 마우스 CD4, 클론 H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-안티 - 마우스 NK1.1, 클론 PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 - 안티 - 마우스 CD8, 클론 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC - 반 마우스 TCR-β, 클론 H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-안티 - 마우스 CXCR3, 클론 220,803 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated - 안티 - 마우스 CCR5, 클론 C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin - PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 및 재료 </td></tr><tr><td> SuperFrost 현미경 슬라이드 </td><td> Lomb Menzel - Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 분해 집게, 가위 </td><td> 레다 Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ML PBS 저수지 </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 고무 튜빙 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G 바늘 </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 분리 키트는 금속 체를 포함하는 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 μm 나일론 셀 스트레이너 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH의 Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> 유동 세포 계측법 관 </td><td> BD 매 </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; anka에 감염된 마우스

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

우리는 P.의 뇌 혈관의 점착성의 염증 세포의 분리 및 특성에 대한 방법을 설명 berghei ANKA에 감염된 쥐. 실험 뇌성 말라리아의 유도, neurologic 증후군이 기생충 변형 결과를 따르게 마우스 변종의 감염 인간 1,2에서 Plasmodium falciparum로 인한 심각한 말라리아 recapitulates 특정 중요한 측면이. 혈액 단계 말라리아의 중년 여인 형태들이 혈관 내피 세포에 바인딩 할 수 있습니다 감염된 적혈구의 표면에 기생 단백질을 표현한다. 이 과정은 hypoxia와 haemorrhages 3 결과, 혈액의 흐름에 장애물을 유도하며 기생충 격리의 사이트에 염증 백혈구의 모집을 자극. 다른 감염, 즉 neutrotopic 바이러스 4-6 말라리아-parasitized 적혈구 (pRBC)뿐만 아니라 관련 inflamm 모두는 달리atory 백혈구는 혈관 내에서 오히려 뇌 실질에 침투보다 분리 된 상태로 유지됩니다. 따라서 비 염증 순환 세포, 장기의 추출 및 조직 처리하기 전에 감염된 - 쥐의 광범위한 intracardial 재관류로 분리 된 백혈구의 오염을 방지하는 것은 혈액 구획을 제거하는이 절차가 필요합니다. 재관류 후, 머리가 수확되고 작은 조각으로 해부 했어요. 조직 구조는 더욱 그 결과 뇌 homogenate 그때 myelin 및 기타 조직 쓰레기들로부터 뇌를 분리 백혈구의 분리 (BSL)을 할 수있는 Percoll 기울기에 centrifuged되어 Collagenase D 및 DNAse I.있는 효소 처리에 의해 방해된다. 절연 셀이 후 씻어 있으며, 유동 세포 계측법에 의한 후속 분석을 위해 형광 항체와 hemocytometer과 스테인드을 사용하여 계산. 이 절차는 염증성 백혈구의 종합적인 phenotypic 특성을 다시에있는 뇌로 마이그레이션 할 수 있습니다뇌졸중뿐만 아니라 바이러스 또는 기생충 감염 등 다양한 자극에 sponse. 방법은 또한 사전 임상 동물 모델에서 소설 항 염증성 치료의 평가에 유용한 도구를 제공합니다.

그림의 결과입니다. 이 쇼 비율과 perfused 또는 unperfused 말라리아에 감염된 그리고 나이브 제어 마우스의 뇌에서 발견 한 다른 BSL 인구의 절대 숫자. 프로토콜 텍스트에 표시된대로 절연 BSL는 PE - 반 NK1.1과 APC-반 TCR-β 항체 물들했다. 이전 결과 7-9에 의거하여 αβTCR + T 세포는 perfused 말라리아에 감염된 쥐 (6 일 PI)의 뇌에있는 BSL 수영장의 높은 비율을 구성. 이 인구는 크게 (그림 2A-B) 비 perfused 동물의 뇌에 제대로 이루어지지 못해 것으로 나타났다. 이 동물 (그림 2A-B) 비 perfused 뇌에 T 세포 주파수의 명백한 감소는 상당히 높은 비율을 더블 부정적인 세포의 총 수 (- - NK1.1 αβTCR)과 관련된되었습니다. unperfused 뇌에 두 번 부정적인 세포에서 높은 비율과 숫자가 아니라 NA &amp; IU의 말라리아에 감염된 쥐에서만 발견하지 못했습니다ML, VE 컨...

의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한 방법<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 쥐들이 설명되어 있습니다. 방법은 유동 세포 계측법에 의해 형광 항체와 후속 분석과 얼룩 후 정량화뿐만 아니라 절연 백혈구의 phenotypic 특성 수 있습니다.

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

이 절차의 전반적인 목표는 실험적 뇌성 말라리아를 유발하기 위해 plasmodium burge eye anca 감염 마우스의 뇌 혈관에서 부착 염증성 백혈구를 분리하는 것입니다. 생쥐는 주사에 의해 plasmodium berge eye anca 기생된 적혈구에 감염됩니다. 생쥐가 질병의 징후를 보이기 시작한 후, 말라리아에 감염된 쥐의 순환 세포는 구강 내 관류에 의해 제거됩니다.그런 다음 뇌를 채취하고 조직을 효소로 소화하여 염증성 백혈구를 분리할 수 있습니다. 그런 다음 면역 표현형을 위해 Multicolor 유세포 분석을 수행합니다. 결과 데이터에 대한 뇌 격리 백혈구 분석은 말라리아에 감염된 쥐의 뇌로 이동하는 백혈구의 비율과 절대 수를 보여줍니다.이 방법은 다양한 실험 조건에서 감염된 동물의 뇌에 있는 기생충 격리 부위로 어떤 유형의 염증 세포가 이동하는지와 같은 말라리아 발병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 관류 단계는 중요한 혈관을 손상시키지 않기 위해 속도와 주의가 모두 필요하기 때문에 배우기가 어렵습니다.이 절차의 일부를 시연하는 사람은 동물 기술자인 Leanna Mcic, 박사 과정 학생인 Ms.Victoria, Rick, 그리고 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Lisa Aez입니다.이 프로토콜을 시작하려면 P berge eye anca 기생 적혈구 또는 PBCS의 냉동 보존된 분취액인 P berge eye anca defrost를 실온에 두어 감염시킵니다. 8주에서 12주 된 기증자 마우스를 케이지에서 꺼내 워크스테이션에 놓습니다. 집게손가락과 엄지손가락 사이의 목덜미를 잡습니다.마우스를 뒤집어 100-200마이크로리터의 plasmodium berge eye를 복막강에 주입합니다. 일상적으로 두 마리의 기증자 마우스에 pbcs를 주입합니다. 주사 후 감염 후 4-5일 후에 쥐를 케이지에 넣습니다.케이지에서 기증자 마우스를 꺼내 워크스테이션에 놓습니다. 쥐의 꼬리 정맥에서 나온 혈액 한 방울을 젖빛 끝 현미경 슬라이드의 끝 부분에 놓습니다. 두 번째 슬라이드를 45도 각도로 놓고 핏방울 속으로 되돌립니다.혈액이 가장자리를 따라 퍼지면 스프레더 슬라이드를 현미경 슬라이드를 가로질러 고르게 밀어 혈액을 번뜨립니다. 혈액 도말자를 고정하기 위해 도말이 자연 건조되도록 합니다. 슬라이드를 100% 메탄올에 30초 동안 담급니다.그런 다음 GIM ZA로 염색한 후 갓 준비한 GIM ZA에 10분 동안 슬라이드를 염색하고 흐르는 물로 30초 동안 슬라이드를 헹굽니다. 슬라이드를 자연 건조시킨 다음 100 x 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 현미경으로 검사합니다. 1,000개의 적혈구 내에서 PRBC를 열거하고 기증자 마우스가 2.5 - 5%의 필요한 수준에 도달한 경우 백분율 파라를 계산합니다.Parsit 헤파린화된 마이크로 헤마토크릿 모세혈관을 사용하여 마취 또는 후안와 출혈 하에 심장 천자로 기증자 마우스로부터 혈액을 수집합니다.혈액을 RPMI 배지에 1 곱하기 10의 최종 농도에서 마우스 당 0.2 밀리리터 당 6 PRBC로 용해시킵니다. 정상적인 쥐의 적혈구 용적혈구는 10의 약 6배에서 1밀리리터당 9번째 적혈구라고 생각해 보십시오. 실제로, 8-12 주 된 실험 C 57 블랙 6 마우스는 이전과 같이 0.2 밀리리터의 복강 내에서 6 번째 PRBC에 10 번 1을 주입했습니다.감염된 마우스의 파라 수치를 모니터링하려면 이전과 같이 혈액 도말 검사를 준비합니다. 파라는 감염 후 5일째부터 2-3일째부터 2-3일마다 결정해야 합니다. 감염 후부터.생쥐는 파라 수치가 5% 이상일 때 심각한 말라리아 징후가 있는지 매일 모니터링하고, 생쥐는 감염 후 약 6일째에 신경학적 증상을 보입니다. 감염된 마우스는 CO2 흡입으로 안락사시키고 첨부 문서에 설명된 대로 즉시 PBS를 관류합니다. 이 절차의 가장 어려운 점은 심장 내 관류입니다.일련의 문제 해결 팁이 여기에 설명되어 있습니다.스티로폼 해부 보드에 마우스를 고정한 경우. 해부 트레이 안에. 70% 에탄올로 복부 쪽을 닦은 다음 큰 가위와 집게를 사용하여 정중선을 따라 피부를 열어 흉강을 노출시키고 피부를 접어 옆으로 고정합니다.가는 집게로 흉골을 잡고 횡격막과 흉골 양쪽을 따라 절단하여 갈비뼈를 절단합니다. 큰 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 흉골 옆의 흉곽을 머리 옆에 느슨하게 고정합니다.가는 집게로 심실을 잡고 가는 가위로 우심방을 조심스럽게 절개합니다. 중력 관류 시스템에 부착된 23 게이지 바늘을 상행 대동맥을 향해 좌심실에 삽입합니다. PBS가 작동하는 동안 바늘 끝을 0.5cm 정도 삽입하고 5분 동안 또는 폐수가 제거될 때까지 마우스를 관류시킵니다.interal perfusion 후 뇌를 해부하여 RPMI가 들어 있는 10ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 보통. 갓 채취한 뇌를 3-5ml의 RPMI 조직 배양 배지가 들어 있는 페트리 접시에 40-60 메쉬 크기의 스테인리스 스틸 세포 여과기 위에 놓습니다. 뇌 조직을 작은 조각으로 자릅니다.그런 다음 크리스탈 플런저를 사용하여 세포 여과기를 통해 작은 뇌 조직 조각을 밀어 넣습니다. 뇌 균질액을 10밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 G로 원심분리합니다. 스핀 후 상층액을 버리고 펠릿을 RPMI 3ml에 용해시킵니다.콜라겐 분해 효소 D와 DNA 백조를 함유하는 배지. 혼합물을 실온에서 30분 동안 회전시킵니다. 70미크론 나일론 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 밀어 세포 파편을 제거합니다.그런 다음 10ml 튜브에서 배양 후 5분 동안 얼음 위에서 배양합니다. 7 밀리리터 30 % 당 호출 쿠션 원심 분리기에 400 회 G에서 20 분 동안 실온에서 20 분 동안 뇌 균질산염을 조심스럽게 오버레이합니다. 상층액을 버린 후 펠릿을 1ml의 적혈구 용해에 재현탁시키고 완충액을 공급한 후 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.구강 내 관류에 의해 뇌에서 제거되지 않는 부착 pbcs를 용해합니다. 9ml의 RPMI 배지 세척 셀을 넣고 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 G로 원심분리합니다. Resus는 50-100 마이크로리터의 RPMI 배지에 펠렛을 함유한 뇌 격리 백혈구 또는 BSL을 현탁시키고 세포를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고, 혈세포 분석기 및 trian blue exclusion을 사용하여 현미경으로 생존 가능한 세포를 계수합니다.감염 후 6일 후에 생존 가능한 세포 수를 얻으면 20, 000에서 100, 000 BSL을 회수할 수 있습니다. 세포는 유세포 분석에 의한 분석을 위해 준비됩니다. 이 절차의 세부 정보는 함께 제공되는 문서에 나와 있지만 여기에 먼저 요약되어 있습니다.각 뇌에서 분리된 모든 세포는 1.5ml 마이크로 fuge 튜브에서 원심분리되고 anti CD 16 및 CD 32 차단 항체와 함께 염색 완충액에 재현탁됩니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, 세포를 염색 완충액으로 세척하고 다시 원심분리하여 항 CD 4, 항 CD 8 항 TCR 및 항 NK 1.1 형광 항체를 함유한 염색 완충액에 재현탁합니다. 세포는 얼음 위에서 1시간 동안 배양하고 염색, 완충액 및 원심분리기로 세척합니다.스핀 후, 세포는 PBS에 재현탁되고 적어도 5, 000에서 10, 000 개의 이벤트가 유세포 분석기에서 획득됩니다. 결과 데이터는 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. BSL 집단은 관류 또는 UN 관류, 말라리아 감염 및 미숙한 대조군 마우스의 뇌에서 회수되고 pe, anti NK 1.1 및 PC anti TCR 베타 항체로 염색되었습니다.이 점도표는 NK 세포, T 림프구, NK 1.1 양성 TCR 양성 세포 및 이중 음성 세포의 백분율을 나타냅니다. NK 1.1 음성 TCR은 이전 연구 결과와 일치하는 관류 또는 융합되지 않은 마우스, 말라리아 감염 및 나이브 대조군 마우스에서 음성입니다. 알파 베타 TCR 양성 T 세포는 감염 후 6일째에 관류된 말라리아에 감염된 마우스의 뇌에서 BSL 풀의 높은 비율을 구성했습니다.이 집단은 관류되지 않은 동물의 뇌에서 현저히 과소 대표되는 것으로 나타났습니다. 비관류 뇌에서 T 세포 빈도의 명백한 감소는 이러한 동물에서 이중 음성 세포의 비율과 총 수가 상당히 높은 것과 관련이 있습니다. 관류되지 않은 뇌에서 이중 음성 세포의 높은 비율과 수는 말라리아에 감염된 마우스뿐만 아니라 순진한 대조군에서도 검출되었는데, 이는 이러한 세포가 심장 내 관류를 수행하지 않으면 염증 세포와 함께 회복되는 뇌 혈관에 존재하는 비염증성 백혈구임을 시사합니다.이 절차를 시도하는 동안, 격리된 백혈구가 비염증성 순환 세포로 오염되는 것을 방지하기 위해 장기 적출 전에 감염된 마우스에 대해 광범위한 심장 내 풍부하게 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유동 기하학에 의해 plasmodium virga에 감염된 마우스에서 뇌 격리된 백혈구를 분리하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 - 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

이 비디오는 뇌성 말라리아의 실험용 마우스 모델의 생성을 보여줍니다. Plasmodium berghei에 감염된 암컷 모기에서 분리된 포자암을 구속된 쥐의 꼬리 정맥에 주입하여 혈액-뇌 장벽 파괴 및 뇌 염증을 유발하여 뇌성 말라리아를 유발합니다. 이 감염된 마우스 모델은 뇌성 말라리아와 관련된 생체 내 미세혈관 병리학을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

숙주 모기 유래 포자동물을 이용한 실험적 뇌성 말라리아의 마우스 모델 생성

이 비디오는 생쥐 모델에 살아있는 약독화 포자형성물을 면역시키기 위한 분석을 보여줍니다. 방사선 감쇠된 Plasmodium sporozoites는 쥐 귀의 등쪽에 주입됩니다. 양쪽 귀의 여러 위치에 주사를 맞은 후 마우스가 회복할 수 있습니다.

마우스 모델에서 약독화 포자조산을 이용한 피내 면역

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

우리는 실험용 뇌 말라리아의 마우스 모델을 설명하고 자기 공명 영상을 사용하여 생체 내에서 염증 및 미세 혈관 병리학을 추적할 수 있는 방법을 보여줍니다.

자기 공명 영상을 이용한 실험용 뇌 말라리아 모델에서의 부종 발달 및 미세 혈관 병리학 적 추적

인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

이 프로토콜의 전반적인 목표는 중추 신경계에서 뮤린 성상 세포와 미세 글리아 세포를 추출, 유지 및 해리하는 방법을 지시하고 원생 동물 기생충에 감염하는 것입니다.

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리

말라리아는 감염된 모기에 의한 Plasmodium의 sporozoite 단계 접종을 통해 전염됩니다. 형질전환 플라스모디움 은 말라리아의 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 해주었고 말라리아 백신 개발 노력에 직접적으로 기여했습니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites를 생성하는 간소화된 방법론을 설명합니다.

유전자 변형 Plasmodium berghei Sporozoites 생성

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

Plasmodium 성적 발달은 모기의 중장에서 발생합니다. 기생충의 성기를 표적으로 삼는 것은 전염을 차단하는 유망한 전략입니다. 당사는 접합자 형성 후 나노루시페라아제를 발현하는 형질전환 P. berghei인 Ookluc을 개발하여 투과 차단 화합물의 고처리량 스크리닝을 가능하게 했습니다. 이 기사에서는 Ookluc을 사용한 스크리닝 방법에 대해 자세히 설명합니다.

Ookluc: 투과 차단 화합물 식별을 위한 Plasmodium berghei 라인

배우세요 뇌혈관에서 염증성 백혈구를 분리하고 유동세포측정법으로 면역표현형을 분석하는 방법을 Plasmodium berghei ANKA 감염 마우스 모델에서. 이 기술은 뇌말라리아 병리 메커니즘 연구에 활용됩니다.

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석

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