에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석 Plasmodium berghei ANKA에 감염된 마우스

이 절차의 전반적인 목표는 실험적 뇌성 말라리아를 유발하기 위해 plasmodium burge eye anca 감염 마우스의 뇌 혈관에서 부착 염증성 백혈구를 분리하는 것입니다. 생쥐는 주사에 의해 plasmodium berge eye anca 기생된 적혈구에 감염됩니다. 생쥐가 질병의 징후를 보이기 시작한 후, 말라리아에 감염된 쥐의 순환 세포는 구강 내 관류에 의해 제거됩니다.

그런 다음 뇌를 채취하고 조직을 효소로 소화하여 염증성 백혈구를 분리할 수 있습니다. 그런 다음 면역 표현형을 위해 Multicolor 유세포 분석을 수행합니다. 결과 데이터에 대한 뇌 격리 백혈구 분석은 말라리아에 감염된 쥐의 뇌로 이동하는 백혈구의 비율과 절대 수를 보여줍니다.

이 방법은 다양한 실험 조건에서 감염된 동물의 뇌에 있는 기생충 격리 부위로 어떤 유형의 염증 세포가 이동하는지와 같은 말라리아 발병 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 관류 단계는 중요한 혈관을 손상시키지 않기 위해 속도와 주의가 모두 필요하기 때문에 배우기가 어렵습니다.이 절차의 일부를 시연하는 사람은 동물 기술자인 Leanna Mcic, 박사 과정 학생인 Ms.Victoria, Rick, 그리고 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Lisa Aez입니다.

이 프로토콜을 시작하려면 P berge eye anca 기생 적혈구 또는 PBCS의 냉동 보존된 분취액인 P berge eye anca defrost를 실온에 두어 감염시킵니다. 8주에서 12주 된 기증자 마우스를 케이지에서 꺼내 워크스테이션에 놓습니다. 집게손가락과 엄지손가락 사이의 목덜미를 잡습니다.

마우스를 뒤집어 100-200마이크로리터의 plasmodium berge eye를 복막강에 주입합니다. 일상적으로 두 마리의 기증자 마우스에 pbcs를 주입합니다. 주사 후 감염 후 4-5일 후에 쥐를 케이지에 넣습니다.

케이지에서 기증자 마우스를 꺼내 워크스테이션에 놓습니다. 쥐의 꼬리 정맥에서 나온 혈액 한 방울을 젖빛 끝 현미경 슬라이드의 끝 부분에 놓습니다. 두 번째 슬라이드를 45도 각도로 놓고 핏방울 속으로 되돌립니다.

혈액이 가장자리를 따라 퍼지면 스프레더 슬라이드를 현미경 슬라이드를 가로질러 고르게 밀어 혈액을 번뜨립니다. 혈액 도말자를 고정하기 위해 도말이 자연 건조되도록 합니다. 슬라이드를 100% 메탄올에 30초 동안 담급니다.

그런 다음 GIM ZA로 염색한 후 갓 준비한 GIM ZA에 10분 동안 슬라이드를 염색하고 흐르는 물로 30초 동안 슬라이드를 헹굽니다. 슬라이드를 자연 건조시킨 다음 100 x 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 현미경으로 검사합니다. 1,000개의 적혈구 내에서 PRBC를 열거하고 기증자 마우스가 2.5 - 5%의 필요한 수준에 도달한 경우 백분율 파라를 계산합니다.Parsit 헤파린화된 마이크로 헤마토크릿 모세혈관을 사용하여 마취 또는 후안와 출혈 하에 심장 천자로 기증자 마우스로부터 혈액을 수집합니다.

혈액을 RPMI 배지에 1 곱하기 10의 최종 농도에서 마우스 당 0.2 밀리리터 당 6 PRBC로 용해시킵니다. 정상적인 쥐의 적혈구 용적혈구는 10의 약 6배에서 1밀리리터당 9번째 적혈구라고 생각해 보십시오. 실제로, 8-12 주 된 실험 C 57 블랙 6 마우스는 이전과 같이 0.2 밀리리터의 복강 내에서 6 번째 PRBC에 10 번 1을 주입했습니다.

감염된 마우스의 파라 수치를 모니터링하려면 이전과 같이 혈액 도말 검사를 준비합니다. 파라는 감염 후 5일째부터 2-3일째부터 2-3일마다 결정해야 합니다. 감염 후부터.

생쥐는 파라 수치가 5% 이상일 때 심각한 말라리아 징후가 있는지 매일 모니터링하고, 생쥐는 감염 후 약 6일째에 신경학적 증상을 보입니다. 감염된 마우스는 CO2 흡입으로 안락사시키고 첨부 문서에 설명된 대로 즉시 PBS를 관류합니다. 이 절차의 가장 어려운 점은 심장 내 관류입니다.

일련의 문제 해결 팁이 여기에 설명되어 있습니다.스티로폼 해부 보드에 마우스를 고정한 경우. 해부 트레이 안에. 70% 에탄올로 복부 쪽을 닦은 다음 큰 가위와 집게를 사용하여 정중선을 따라 피부를 열어 흉강을 노출시키고 피부를 접어 옆으로 고정합니다.

가는 집게로 흉골을 잡고 횡격막과 흉골 양쪽을 따라 절단하여 갈비뼈를 절단합니다. 큰 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오. 흉골 옆의 흉곽을 머리 옆에 느슨하게 고정합니다.

가는 집게로 심실을 잡고 가는 가위로 우심방을 조심스럽게 절개합니다. 중력 관류 시스템에 부착된 23 게이지 바늘을 상행 대동맥을 향해 좌심실에 삽입합니다. PBS가 작동하는 동안 바늘 끝을 0.5cm 정도 삽입하고 5분 동안 또는 폐수가 제거될 때까지 마우스를 관류시킵니다.

interal perfusion 후 뇌를 해부하여 RPMI가 들어 있는 10ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 보통. 갓 채취한 뇌를 3-5ml의 RPMI 조직 배양 배지가 들어 있는 페트리 접시에 40-60 메쉬 크기의 스테인리스 스틸 세포 여과기 위에 놓습니다. 뇌 조직을 작은 조각으로 자릅니다.

그런 다음 크리스탈 플런저를 사용하여 세포 여과기를 통해 작은 뇌 조직 조각을 밀어 넣습니다. 뇌 균질액을 10밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 G로 원심분리합니다. 스핀 후 상층액을 버리고 펠릿을 RPMI 3ml에 용해시킵니다.

콜라겐 분해 효소 D와 DNA 백조를 함유하는 배지. 혼합물을 실온에서 30분 동안 회전시킵니다. 70미크론 나일론 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 밀어 세포 파편을 제거합니다.

그런 다음 10ml 튜브에서 배양 후 5분 동안 얼음 위에서 배양합니다. 7 밀리리터 30 % 당 호출 쿠션 원심 분리기에 400 회 G에서 20 분 동안 실온에서 20 분 동안 뇌 균질산염을 조심스럽게 오버레이합니다. 상층액을 버린 후 펠릿을 1ml의 적혈구 용해에 재현탁시키고 완충액을 공급한 후 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.

구강 내 관류에 의해 뇌에서 제거되지 않는 부착 pbcs를 용해합니다. 9ml의 RPMI 배지 세척 셀을 넣고 섭씨 4도에서 10분 동안 250배 G로 원심분리합니다. Resus는 50-100 마이크로리터의 RPMI 배지에 펠렛을 함유한 뇌 격리 백혈구 또는 BSL을 현탁시키고 세포를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고, 혈세포 분석기 및 trian blue exclusion을 사용하여 현미경으로 생존 가능한 세포를 계수합니다.

감염 후 6일 후에 생존 가능한 세포 수를 얻으면 20, 000에서 100, 000 BSL을 회수할 수 있습니다. 세포는 유세포 분석에 의한 분석을 위해 준비됩니다. 이 절차의 세부 정보는 함께 제공되는 문서에 나와 있지만 여기에 먼저 요약되어 있습니다.

각 뇌에서 분리된 모든 세포는 1.5ml 마이크로 fuge 튜브에서 원심분리되고 anti CD 16 및 CD 32 차단 항체와 함께 염색 완충액에 재현탁됩니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, 세포를 염색 완충액으로 세척하고 다시 원심분리하여 항 CD 4, 항 CD 8 항 TCR 및 항 NK 1.1 형광 항체를 함유한 염색 완충액에 재현탁합니다. 세포는 얼음 위에서 1시간 동안 배양하고 염색, 완충액 및 원심분리기로 세척합니다.

스핀 후, 세포는 PBS에 재현탁되고 적어도 5, 000에서 10, 000 개의 이벤트가 유세포 분석기에서 획득됩니다. 결과 데이터는 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. BSL 집단은 관류 또는 UN 관류, 말라리아 감염 및 미숙한 대조군 마우스의 뇌에서 회수되고 pe, anti NK 1.1 및 PC anti TCR 베타 항체로 염색되었습니다.

이 점도표는 NK 세포, T 림프구, NK 1.1 양성 TCR 양성 세포 및 이중 음성 세포의 백분율을 나타냅니다. NK 1.1 음성 TCR은 이전 연구 결과와 일치하는 관류 또는 융합되지 않은 마우스, 말라리아 감염 및 나이브 대조군 마우스에서 음성입니다. 알파 베타 TCR 양성 T 세포는 감염 후 6일째에 관류된 말라리아에 감염된 마우스의 뇌에서 BSL 풀의 높은 비율을 구성했습니다.

이 집단은 관류되지 않은 동물의 뇌에서 현저히 과소 대표되는 것으로 나타났습니다. 비관류 뇌에서 T 세포 빈도의 명백한 감소는 이러한 동물에서 이중 음성 세포의 비율과 총 수가 상당히 높은 것과 관련이 있습니다. 관류되지 않은 뇌에서 이중 음성 세포의 높은 비율과 수는 말라리아에 감염된 마우스뿐만 아니라 순진한 대조군에서도 검출되었는데, 이는 이러한 세포가 심장 내 관류를 수행하지 않으면 염증 세포와 함께 회복되는 뇌 혈관에 존재하는 비염증성 백혈구임을 시사합니다.

이 절차를 시도하는 동안, 격리된 백혈구가 비염증성 순환 세포로 오염되는 것을 방지하기 위해 장기 적출 전에 감염된 마우스에 대해 광범위한 심장 내 풍부하게 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유동 기하학에 의해 plasmodium virga에 감염된 마우스에서 뇌 격리된 백혈구를 분리하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.