액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

이 실험은 단일 세포에서 세포 내 병원체에 의해 유발된 VA 파열을 모니터링합니다. 먼저 세포 에스테라아제에 의해 절단된 CCF 4:00 AM 염료를 세포에 로드합니다. 그런 다음 FL 신경 박테리아를 준비하여 CCF에 적용하고, 4개의 로드된 세포가 숙주 세포의 박테리아 침입을 위해 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

그런 다음 450나노미터 및 535나노미터 채널에서 방출되는 강도의 비율을 결정합니다. 결과는 세포질에 병원체가 존재한다는 것을 보여주는데, 이는 고처리량 lys에 대한 적응성 때문입니다. 이 기술은 숙주 병원체 상호 작용 중 박테리아 세포 내 국소화의 주요 문제를 해결하여 새로운 항생제의 식별을 용이하게 합니다.

동료인 Tran Vanu와 함께 우리는 높은 시간 해상도로 세포 내 병원체를 관찰하는 접근 방식을 개발하는 데 관심이 있었습니다. 이로 인해 CCF 4 betalactamase regular ular rupture assay가 확립되었습니다. 오늘, 이 접근법은 실험실의 두 대학원생인 Nora MellU와 Charlotte Keller에 의해 실험적으로 발표될 것입니다: 암피실린 1밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 8밀리리터의 TCSB에 야생형 및 돌연변이 박테리아 균주를 접종합니다.

10% 태아 혈청 1%페니실린 스트렙토마이신 배양액을 포함하는 100마이크로리터의 DMEM에서 다음날 5% 이산화탄소 인큐베이터의 세포를 TCSB에서 100번째 희석으로 하위배양하고 암피실린 1밀리리터당 50마이크로그램이 보충된 셰이커에서 2시간 30분 동안 성장합니다. 이제 hela cells를 로드하기 위해 em buffer에 CCF 4:00 AM dye를 준비하고 PBS로 셀을 한 번 세척합니다. 그런 다음 2 시간 및 30 분 동안 어둠 속에서 실온에서 우물 당 25 마이크로 리터의 CCF 4:00 AM 로딩 믹스를 추가하여 500 마이크로 리터의 PBS Resus로 한 번 세척 한 후 원심 분리에 의한 배양 1 밀리리터의 박테리아를 준비하고, 폴리올 라이신의 밀리리터 당 10 마이크로 그램과 베타 락타마제 밀리리터 당 40 마이크로 그램을 보충 한 PBS의 500 마이크로 리터에 박테리아를 현탁시킵니다.

실온에서 회전하는 휠에서 10 회 배양 한 다음 500 마이크로 리터의 PBS로 한 번 세척하고 각 박테리아 펠릿을 EM 완충액에서 1 밀리 몰 프로베네시드의 500 마이크로 리터에 재현탁 한 다음 EM 완충액에서 1 밀리 몰 프로프로 150 마이크로 리터로 세포를 한 번 세척합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 100마이크로리터의 1밀리몰 프로브 용액에 10마이크로리터의 박테리아를 희석하여 헬라 세포의 각 웰에 분배합니다. 실온의 어두운 곳에서 15분 동안 배양한 후 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 옮깁니다.

150마이크로리터의 1밀리몰 프로빗 용액으로 한 번 세척합니다. 그런 다음 어둠 속에서 10분 동안 1개의 밀리몰 Pro 용액에 50마이크로리터의 4%파라폼 알데히드로 샘플을 고정합니다.프로베네시드 용액으로 한 번 세척한 후 최적의 세포 분할을 위해 30마이크로리터의 10마이크로몰 핵 염료 드랙 5를 추가합니다. 세포를 30분 동안 배양하고 한 번 세척한 다음 100마이크로리터의 1밀리몰 용액을 첨가하여 도립 에피 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.

405나노미터의 여기 파장을 사용합니다. 투과광에 대해 5밀리초의 노출 시간을 사용하여 450나노미터 및 535나노미터 필터를 통해 방출을 감지합니다. 535나노미터의 경우 1000밀리초, 450나노미터의 경우 500밀리초

자동 현미경 검사와 결합된 초점 보정 장치를 사용하면 여러 웰에서 수십 개의 서로 다른 위치를 동시에 획득할 수 있습니다. 컨포칼 현미경을 사용하는 경우 450나노미터에서 240밀리초, 405나노미터 레이저의 경우 535나노미터에서 360밀리초, 640나노미터 레이저의 경우 640밀리초의 노출 시간을 사용합니다. 각 개별 세포에 대한 형광 신호의 자동 점수를 매길 수 있는 컴퓨터 알고리즘으로 데이터를 분석합니다.

예를 들어, metamorph 및 acapella와 같은 소프트웨어를 사용하여 450나노미터와 535나노미터 방출 신호 간의 비율을 측정하기 위한 스크립트를 만들 수 있습니다. 이 분석을 위해 2 밀리리터의 최종 부피에서 5번째 세포까지 10의 2배로 HELOC 배양을 시작합니다. 박테리아의 감염을 준비하고, 헬라 셀에 CCF 4:00 AM을 로드하고, 섭씨 37도의 가열 챔버 내부에 N plan 공기 대물렌즈가 있는 컨보 현미경을 배치합니다.

450 나노미터 및 535 나노미터 필터를 통해 405 나노미터 레이저와 방출을 설정합니다. 또한 투과광에 대한 노출 시간을 5밀리초로 입력합니다. 535나노미터의 경우 200밀리초, 450나노미터의 경우 100밀리초입니다.

60분 동안 90초마다 데이터 수집을 설정합니다. 이제 2 밀리리터의 1 밀리 몰 프로베네시드 용액으로 세포를 한 번 씻으십시오. em buffer에 2ml의 1millimolar prob를 추가합니다.

그런 다음 현미경 스테이지에 접시를 장착하고 6분 후에 획득을 시작합니다. 인수를 보류합니다. 세포 위에 250마이크로리터의 박테리아 재현탁액을 추가하고 획득 후 분석을 위해 획득을 다시 시작합니다.

Velocity metamorph 또는 image J.를 사용하여 동영상을 시각화합니다.각 개별 셀에 대해 450-535 나노미터 강도 비율을 얻습니다. CCF 4:00 AM 베타-락타마제 접근법은 HELOC 세포 감염 시 겔 플렉스네리(gel flexneri)와 같은 세포 내 병원체의 구내파열을 추적하기 위한 강력하고 민감한 방법입니다. 비침습적 BS 176 AFA 1 균주를 1시간 동안 사용하면 CCF 4프렛 프로브가 손상되지 않고 녹색 신호를 방출합니다.

대조적으로, 악성 M 90 TFA I 균주는 비율 메트릭 신호의 측정을 위해 세포질의 프로브 절단과 일치하는 파란색으로 신호를 전환합니다. 우리는 535 및 450 나노미터 채널에서 세포 감지와 측정을 자동화하기 위해 metamorph 및 acapella 소프트웨어용 스크립트를 개발했습니다. 세포의 핵과 세포질은 DR 5 채널을 사용하여 분할됩니다.

그런 다음 알고리즘은 450나노미터와 535나노미터 양성 세포 집단을 검출하고 정량화할 수 있습니다. 계산된 평균 비율은 돌연변이 균주에 대해 낮고 악성 균주에 대해 높습니다. 실험은 Gila 상피 세포 및 THP와 같은 다양한 인간 세포 유형에서 수행 할 수 있습니다.

두 세포 유형 모두 감염 상태에서 방출된 신호를 녹색에서 파란색으로 전환하여 악성 M 90 T AFA 원 차 균주에 반응합니다. 비침습적 균주를 사용하면 녹색 신호가 변형 소프트웨어에서 개발된 스크립트를 사용하여 정량화를 지속하고 Excel에서 개발된 매크로는 세포 분포의 함수로 ular rupture의 히스토그램을 표시합니다. 이 방법은 다양한 박테리아의 감염성을 이해하는 데 성공적으로 적용될 수 있습니다.

예를 들어, 이 데이터 세트는 mycobacterium Bovis를 보여줍니다. BCG는 지속적인 녹색 신호에서 볼 수 있듯이 실험의 전체 과정 동안 phagosome에 상주합니다. 대조적으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)은 동일한 알고리즘을 사용하여 감염 7일 후 450나노미터 신호의 유령으로 강조된 바와 같이 감염 7일 후 THP 1 대식세포에서 질막 파열을 유도합니다.

엘라(Ella)에 의한 발라르 파열(valar rupture)에 대한 연구와 관련하여, 우리는 마이코박테리움 투베르쿨라시스(Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 세포가 감염 7일 후 마이코박테리움 보비스 BCG보다 450-535나노미터 비율로 더 높다는 것을 발견했다. 이 비디오를 시청한 후에는 CCL 4가지 베타락타마제 분석을 사용하여 병원체에 의한 구강 파열을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 프로토콜은 마스터하면 4시간 내에 수행할 수 있지만 프로토콜 동안 각 버퍼에 proce를 추가해야 한다는 점을 기억하십시오. 전자 현미경 또는 멤브레인 분획과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 생화학적 처리 없이 실시간으로 수행할 수 있다는 것입니다.

숙주 세포에서 박테리아의 흡수 및 증식을 평가하기 위해 액틴 라벨링 또는 겐타마이신 보호 분석과 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다.