Name: 액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 단일 세포에서 CCF4 FRET 프로브를 이용해 Shigella flexneri와 Mycobacterium tuberculosis에 의한 액포 파열을 실시간 추적하는 방법을. 이 기법은 항생제 선별과 병원체-숙주 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 회사 직원 국립 부어 라 공들인 의해 유럽 연구위원회에 의해 투자되었다.

분석은 다양한 형식으로 작동하지만 우리는 특히 시약, CCF4-AM을 저장하는 예제 볼륨을 확장 좋습니다. 따라서, 다음과 같은 프로토콜은 35mm 유리 바닥 요리에 살고있는 헬라 세포에 대한 다음, 96도 형식으로 고정 된 HeLa 세포 또는 THP-1 대식 세포와 같은 세포에 대해 설명합니다. 분석은 다른 병원체에 대해 적용 할 수 있습니다. 시겔 감염 외에, 우리는 THP-1 phagocytosing 다른 m Y cobacterial 균주에 대한 분석을 설명합니다. 중요한 CCF4-AM로드 한 후, 세척 버퍼를 포함한 모든 시약 및 버퍼는 1 ㎜에서 프로 벤 에시드의 존재를 필요로합니다. 프로 벤 에시드는 프로토콜의 모든 단계에 걸쳐 CCF4의 세포질 유지를 촉진 이온 채널 억제제이다. CCF4 신호가 오랜 시간 동안 안정하지 않기 때문에 고정 된 시료는 실험 후 몇 시간 이내에 취득해야합니다. 1. 시겔 F를 사용하여 고정 샘플에 CCF4 분석lexneri (96 웰 플레이트) <ol><li> 하룻밤 문화에 대한 박테리아를 준비합니다. 세균성 사전 배양 야생 유형 (M90T AfaI) 및 돌연변이 (BS176 AfaI) 균주 37 ° C 하룻밤에 뿌리에서 암피실린 (50 ㎍ / ㎖)로 보충 8 ML 트립신 카제인 간장 국물 (TCSB)의 감염 전 2 일 전에 접종 . </li><li> 감염 도금 세포. DMEM은 최종 볼륨에서 5 % CO 2 배양기에서 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 포함하는 잘 당 5 × 10 3 세포의 밀도에서 96 잘 접시 감염 1 일 전 씨앗 헬라 세포 100 μL의. THP-1 대식 세포와 같은 세포의 경우 세포 도금 5 × 10 4 세포 / 잘 밀도 2 일 감염되기 전에 수행됩니다, 그들은 10 %를 포함하는 RPMI에 30 nM의 Phorbol 미리 스틴 산 아세테이트 (PMA)를 배양하는 태아 송아지 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 streptomycine 0.05 MM 2 - 머 캅토 에탄올. </li><li> 하위 문화에 대한 박테리아를 준비합니다. 밤새 세균성 문화를 접종2.5 시간 (OD600 = 0.3-0.4)에 대해 37 ° C에서 50 ㎍ / 셰이커 ML 암피실린과 보충 TCSB의 1 / 100 희석. </li><li> CCF4-AM으로 세포를로드. 물론 1 ㎜ 프로 베네 시드 (시그마), 1.5 μM C​​CF4-AM (THP-1의 경우 6 μM) 및로드 솔루션 B의 1.25 μL (100 MG를 포함한 당 25 μL의 최종 볼륨 CCF4-AM로드 믹스를 준비합니다 EM에서 / ㎖ Invitrogen 사에 의해 CCF4-AM LiveBlazer로드 키트 함께 제공 DMSO/0.1 % 초산 플루로 닉-F127 계면 활성제) 버퍼 (120 mM의 NaCl을, 7 mM의 KCl을, 1.8 MM의 염화칼슘, 0.8 mM의 MgCl 2, 5 mM의 포도당, 산도 7.3) 25 MM의 HEPES. PBS로 두 번 세포를 씻으 2.5 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 잘 당 CCF4 암 로딩 믹스의 25 μl를 추가합니다. </li><li> 감염 박테리아를 준비합니다. 1 분 동안 9,000 rpm에서 세균 배양 1 ㎖를 회전. 10 ㎍ / ㎖ 폴리-L-라이신 (시그마), 40 ㎍ / ㎖ β-lacta과 보충 500 μl의 PBS에서 1 분간을 Resuspend 9,000 rpm에서 500 μL PBS, 스핀 한 번 씻어(시그마) 입든. 상온에서 회전하는 바퀴에 부화 10 분 후, 500 μL EM 버퍼 / 1 ㎜의 프로 베네 시드에 500 ㎕의 PBS와를 Resuspend 박테리아에 한 번 씻는다. </li><li> 세포 감염과 고정. 150 μL PBS / 1 ㎜의 프로 벤 에시드 한 번 세포를 씻으, EM 버퍼 100 μL / 1 ㎜의 프로 벤 에시드의 최종 볼륨 재 부유 세균의 10 μL의 혼합을 준비하고 각 웰에 배포 할 수 있습니다. 상온에서 어둠 속에서 15 분 부화 후, 1 시간 (THP-1의 경우 90 분)에 대해 37 ° C에 판을 전환, 150 μL PBS / 1 ㎜의 프로 벤 에시드로 세척하고 50 μl의 파라 포름 알데히드 4 %로 고정 / 1 MM은 어둠 속에서 10 분 동안 프로 베네 시드. 그런 다음, 10 μM 핵 염색 DRAQ5 (Biostatus) 30 μL와 30 분 동안 품어 150 μL PBS / 1 ㎜의 프로 벤 에시드, 씻어, 150 μL PBS / 1 ㎜의 프로 벤 에시드로 세척하고 100 μL PBS / 1 ㎜의 프로 베네 시드에 샘플을 둡니다. </li><li> 고정 된 시료의 획득 설정. 인수는 하나 (I) 역 epifluorescence에 마이크로를 사용하여 수행됩니다20X (0.5 가늠 구멍 (NA), 2.1 작동 거리 (WD)) 또는 40X (0.75 NA 0.72 WD) N-플랜 공기 목적 또는 (ⅱ) 10X 목적으로 공 촛점 현미경을 사용하여 대응하고 있습니다. 형광 이미징은 405 nm에서 여기로 수행 (Semrock, FF01-387/11-25) 및 배출은 450 nm의 (Semrock, FF02-447/60-25)와 535 nm의 필터 (Semrock를 통해 감지 FF01-520/35- 5 밀리 초 (투과광), 1,000 밀리 초 (535 NM)와 500 밀리 초 (450 NM)의 노출 시간을 사용하여 25). 240 밀리 초 (450 NM)와 640 nm의 레이저 405 nm의 레이저 (870 μW), 640 밀리 초 (DRAQ5) (2,560 μW)를위한 360 밀리 초 (535 nm의) : 공 촛점 이미징은 다음의 노출 시간을 사용하여 수행됩니다. </li><li> 취득 후 분석. 그 후, 이미지는 각각의 세포에 대한 형광 신호를 자동으로 채점을 할 수있는 컴퓨터 알고리즘에 의해 분석됩니다. 같은 Metamorph 7.1 아카펠라 등의 소프트웨어 (요청시 제공) 450nm의와 535nm 방출 신호 사이의 비율을 측정하기위한 스크립트를 작성하는 데 사용할 수 있습니다. 참고로, 인수시 자동 현미경에 결합 초점 교정 장치의 사용은 동시에 여러 우물에서 다른 위치 수십을 획득 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 시겔 flexneri을 (35mm 유리 바닥 형식, MatTek)를 사용하여 라이브 샘플에 CCF4 분석 <ol><li> 하룻밤 문화에 대한 박테리아를 준비합니다. 앞에서 설명한대로 진행합니다. </li><li> 감염 도금 세포. 2 × 10 5 세포 / 2 ML의 최종 볼륨 요리의 밀도에서 35mm 유리 바닥 문화 요리 (MatTek 10mm 마이크로 웰, MatTek 공사) 감염 1 일 전 씨앗 헬라 세포. </li><li> 하위 문화에 대한 박테리아를 준비합니다. 앞에서 설명한대로 진행합니다. </li><li> CCF4-AM으로 세포를로드. 이전에 접시 당 2 ML의 최종 볼륨에 설명 된대로 CCF-AM로드 믹스를 준비합니다. 로드하기 전에 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 감염 박테리아를 준비합니다. 앞에서 설명한대로 진행합니다. </li><li> Acquisit라이브 시료의 이온 설정. 인수는 37 ° C 가열 챔버 내부에 20 배 (0.5 NA 2.1 WD) 또는 40X (0.75 NA 0.72 WD) N-플랜 공기 목표를 사용하여 거꾸로 epifluorescence에 현미경으로 60 분마다 90 초 동안 수행됩니다. 형광 이미징은 405 nm에서 여기로 수행 (Semrock, FF01-387/11-25) 및 배출은 450 nm의 (Semrock, FF02-447/60-25)와 535 nm의 필터 (Semrock를 통해 감지 FF01-520/35- 5 밀리 초 (투과광), 200 밀리 초 (535 NM)와 100 밀리 초 (450 NM)의 노출 시간을 사용하여 25). </li><li> 세포 감염과 라이브 획득. 2 ML PBS / 1 ㎜의 프로 벤 에시드 한 번 세포를 씻으, EM 2 ㎖ / 1 ㎜의 프로 베네 시드를 추가 현미경의 무대에서 접시를 탑재하고 수집을 시작합니다. 6 분은 (시점 4), 대기 인수를 넣어 한 후, 세포의 상단에 박테리아 부유의 250 μl를 추가하고 인수를 다시 시작합니다. </li><li> 취득 후 분석. 영화 Metamorph 또는 ImageJ에를 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 각 indivi에 대한 535분의 450 nm의 강도 비율듀얼 셀은 ImageJ에를 사용하여 얻을 수 있습니다. 앞서 언급했듯이, 인수시 자동 현미경에 결합 초점 교정 장치의 사용은 시간 경과에 따라 여러 다른 위치를 확보 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 사용하여 고정 샘플에 CCF4 분석 결핵균 (96 음 형식) <ol><li> 박테리아를 준비합니다. 성장 30 ° C (은 Mycobacterium marinum의 경우) 또는 37 ° C (은 Mycobacterium의 bovis BCG와 Mycobacterium의 결핵)에서 카탈 알부민 포도당 (ADC)를 포함 7H9 중반 로그 단계로 마이코 박테리아 균주. </li><li> 감염 도금 세포. 이일 감염 전에 플레이트 THP-1 대식 세포는 RPMI에 30 nM의 PMA 10 % 함유를 배양 소 태아 혈청 (FCS)의 최종 볼륨 5 % CO 2 배양기에서 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 0.05 MM 2 - 머 캅토 에탄올 5 × 10 4 세포 / 잘 밀도 100 μL. </li><li> 감염 박테리아를 준비합니다. 하브에스트 문화, 세척 응집 방지하기 위해 주사기를 통해 초음파 여과하기 전에 PBS와 resuspend을. OD600 측정하여 각 균주의 농도를 결정하고 5 %와 30 ° C (은 Mycobacterium marinum의 경우) 또는 RPMI 배지에서 37 ° C (은 Mycobacterium의 bovis BCG와 Mycobacterium의 결핵)에서 MOI 1:1에서 THP-1 세포를 감염 CO 2. 2 시간 후, 매체를 제거 PBS로 3 회 세척하고 1~2일 (은 Mycobacterium marinum의 경우) 또는 3~7일 (결핵균의 bovis BCG와 결핵균의 경우)에 대한 전체 신선한 매체를 추가합니다. </li><li> CCF4-AM과 고정을 가진 세포를로드. PBS로 두 번 세포를 씻으 이전에 6 μM의 CCF4-AM 최종 농도를 사용하여 잘 당 25 μL의 최종 볼륨에 설명 된대로 CCF4 - AM 로딩 믹스를 준비합니다. 로딩 중 150 μL PBS / 1 ㎜의 프로 벤 에시드와 세척하기 전에 2 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 이루어지는 수정4 %에서 50 μL 파라 포름 알데히드를 사용 ATION는 어둠 속에서 30 분 동안 프로 베네 시드 with1 밀리미터를 보완. 그런 다음 150 μL PBS / 1 ㎜의 프로 벤 에시드로 세척하고 100 μL PBS / 1 ㎜의 프로 베네 시드에 샘플을 둡니다. </li><li> 수집 설정 및 취득 후 분석. 이전 시겔 flexneri을 사용하여 첫 번째 단락에 설명 된대로 진행합니다. </li></ol> 보조 프로토콜 Fluorimetric 분석은 박테리아의 표면에 β-lactamase의 활성을 확인하기 위해 수행됩니다. 이 기술 분석에 사용하기위한 각각의 균주에 대해 수행해야합니다. 이 목적을 위해, 세척 박테리아는 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간 동안 PBS 1 ㎖에 100 nm의 CCF4-AM (Invitrogen 사), 50 ㎍ / ㎖ 돼지 에스테르 가수 분해 효소 간 추출물 (시그마)과 접촉에 배치됩니다. 수용성 lactamase의 1 ㎎ / ㎖의 (Invitrogen 사) 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 그런 다음, 배출 검사가 PTI Quantamaster의 fluorimeter와 1 ML 쿼트를 사용하여 405nm는 여기에서 수행됩니다Z 큐벳. 의 손실은 535 nm에서 FRET과 높은 450 nm의 피크의 모양은 CCF4 프로브 박테리아를 첨가시 시각입니다.

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우리는 공개 아무것도 없어.

CCF4-AM/β-lactamase 분석은 세포 내 시겔 flexneri 다른 세포 유형에서 결핵균에 의해 유도 된 액포 중단을 추적하는 간단한 방법입니다. 그것은 박테리아의 표면에 활성 효소에 의해 쪼개 lactamase의 민감한 세포질 무서워 기자를 사용합니다. CCF4-AM 기판의 손실은 쉽게 기판로드 한 후 모든 솔루션 프로 베네 시드를 추가하여 피할 수 있습니다. 알 수 있듯이, 분석은 여러 종류의 세포 (상피 세포, 탐식 세포)과 형식 (96도, 35mm 유리 바닥 요리 6/12/24 잘 접시)에 적용 할 수 있습니다. 6/12/24 잘 플레이트의 사용, 멸균의 coverslips는 세포를 파종하기 전에 각 우물의 바닥에 배포됩니다. 실험의 끝에, 커버 슬립은 골드 Antifade 시약 (Invitrogen 사)를 연장과 같은 설치 매체에 슬라이드에 전송됩니다. 이 방법은 신호를 분석 후 긴 시간 동안 안정샘플은 고정 후 PBS에 보존 된 96 웰 형식으로 비교했다. CCF4-AM 기판의 높은 비용은 샘플 볼륨을 결정하기 전에 고려되어야한다. 우리가 그들을 확장 좋습니다 이유입니다. 실험 6/12/24 잘 형식으로 더 비싸지 만 신호가 일간 안정합니다. 반대로, 실험은 96도 형식으로 저렴하지만 샘플은 실험의 날에 분석해야합니다. 그것은 실제 실험도 96도 또는 384도 형식에서 수행 할 수있는 주목할 만하다. 이 아니라 당 위치의 숫자를 동시에 (돌연변이 박테리아, MOI, 플라스미드 또는 siRNA를 transfection을, 화학 등)에서 조건 수십을 사용하여 실시간 실험을 수행 할 수 있습니다. 시겔 flexneri에 적합하지만, 우리는 감염주기가 세포질에서 유지 될 수 CCF4의 측정 농도를 초과하여 &quot;true&quot;로 실시간 또는 시간 경과 실험 결핵균 연구에 적합하지 것을 강조 표시합니다. 용이러한 이유는 CCF4-AM 기판은 침략이 달성 된 후에 만​​ 셀에 적용됩니다. MetaMorph 소프트웨어가 수집 및 분석에 사용되는 경우에, 우리는 잘 당 사진의 지정된 번호와 전체 384분의 96 잘 플레이트를 획득 할 수 있습니다 모듈 &quot;화면 취득&quot;을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 모듈 &quot;리뷰 스크린 데이터는&quot;수 (나는) 큰 &quot;포스터&quot;에 동시에 모든 채널에 대해 잘 각각의 바느질 그림 모자이크를 시각화하고 (II) 535 농도를 측정하기위한 특수 알고리즘을 반복하고 450 nm의 채널. 비록 우리가 시간 경과 현미경을 사용하여 하나의 박테리아에 의해 액포 파열을 측정 할 수 있었다, 우리는 렌더링 개별 박테리아의 표면에 효소 활동이 어려운 정확하게 세포 내 박테리아와 액포의 효과의 수의 상관 관계를 변화하는주의하고 싶습니다 파열. 분석의 견고성을 감안할 때, 그것은 시간에 적합합니다고등학교의 처리량은 96 또는 384도 형식으로 접근한다. 우리는 또한 성공적으로 정지 16 세포의 감염을 연구하는 FACS 분석을 위해이 프로토콜을 적용했다. 분석은 광범위한 애플리케이션에 이르는 자신의 표면에 lactamase를 제시 다른 세균이나 사업자의 조사에 사용할 수 있습니다. 예를 들어,이 방식은 같은 β-lactamase를 표현하는 레지오넬라 pneumophila를, 리스테리아 또는 살모넬라 티피 뮤 리움 12 같은 다른 병원체에 의해 유도 된 액포 파열을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 리스테리아는 시겔 flexneri에 비해 짧은 감염주기를 가지고 있기 때문에, 시간 경과 실험이 가능합니다. 반면에, 때문에 레지오넬라 pneumophila를하고 살모넬라 티피 뮤 리움 디스플레이 긴 감염주기, 우리는 종점 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 가능한 응용 프로그램의 다양한 CCF4-AM/β-lactamase 분석한다고정 샘플 실시간으로 세포 내 병원균에 의해 유도 된 액포 파열을 추적 흥미 형광 방법.

수많은 세균 병원균 감염의 그들의 과정 진핵 세포의 막 동봉 된 구획에 내장되어 있습니다. 대 식세포에 의해 섭취, 또는 병원균에 적극적으로 일반적으로 비 식세포 세포로 자신의 이해를 유도하는 결핵균의 경우는 같은 셀 항목은 전문 숙주 세포에 의한 식균 작용을 통해 하나 발생합니다. 유도 흡수의 경우, 시겔 flexneri 예를 들어, 병원체는 다른 세포의 기능 endosomal 구획 1,2에서 세균 현지화의 결과로 단단히 규제 endomembrane 정렬 기계 사이에 납치 호스트 세포질에 효과기 단백질을 삽입합니다. 그 후, 시겔은 액포 파열 및 호스트 멤브레인 인신 매매와 리소좀을 피하는 배달을 방해하는 병원체의 세포질 액세스로 이어지는 바깥 막 방해. 더 최근에, phagolysosomal 파열은 감염 STR로 발견되었습니다ategy 결핵균, 독점적으로 막 바인딩 된 구획 3,17에서 지역화 할 수있는 오랜 시간 동안 생각했다 병원균에 의해 사용됩니다. 침입 병원균의 세포 내 막 밀매의 역학을 조사하기 위해, 큰 개선은 4,5 1980 년대 후반의 연구를 기반으로 투과 전자 현미경 (TEM) 이후에 달성되었다. 예를 들어, 염료를 사용하여 형광 현미경 기반의 방법은 세균 표면의 구성 요소 또는 세포 내 구획과 공동 현지화 마커에 대한 항체는 6.7 이상했다. 그러나, 그들은 여전히​​ 정확한 시공간적 해상도와 양적 세균성 병원체에 의해 액포 파열을 측정하는 견고성을 양보하지 않습니다. 이 장애물은 먼저 유전자 발현 8을 연구하는 데 사용 된 세 팔로 스포린 무서워 CCF4-AM 파생 기자에 따라 분석과 해결되었습니다. 그런 다음이 INF의 맥락에서 사용 된ection 생물학 이펙터 분비를 조사하고 숙주 세포 9,10,11로 네이 세리아의 이해를 따르십시오. 우리는 시겔 flexneri 12 결핵균 (17)에 의해 유도 된 액포 파열을 공부이 기자의 활용 분석을 개발했다. 우리의 방법의 원리는 시겔 flexneri를 사용하여 그림 1에 설명되어 있습니다. 첫째, 숙주 세포는 오전 에스테르 잔기를 쪼개는 후 세포질 안에 갇혀 무서워 CCF4-AM 기판과로드됩니다. 그런 다음, 세포 시겔 flexneri에 감염됩니다. 박테리아의 표면에 β-lactamase의 존재는 곧 액포 파열로 발생 다니엘 CCF4 기판 수 있습니다. 이 405 nm에서 프로브 여기에 450 nm의 535 nm의에서 방출 피크를 전환 FRET 신호의 손실로 연결됩니다. 535분의 450 nm의 강도의 비례 측정 액포 무결성을 강조 : 낮은 비율은 막 ko를 반영높은 비율 반면, 폐쇄 또는 세포 외 박테리아 박테리아와 호스트 세포질 사이의 접촉을 반영합니다. 우리는 또한 THP-1 대식 세포에서 결핵균에 의한 phagosomal 파열을 공부하고이 방법의 적응을보고합니다. 순서가 CCF4-AM로드 만 세균 감염 후 적용 반전되어 있지만 실험 원리는 동일하게 유지됩니다. 따라서, 단일 세포 수준에서 양적 비례 형광 측정을 통해, 시겔 flexneri의 액포 파열 실시간으로 다른 세포 유형 12,13,14에서 고정 된 샘플에서 추적 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 Mycobacterium의 bovis와 결핵을 사용하여이 연구에서와 같이 다른 침입 병원균의 숫자에 적용 할 수 있습니다. 마지막으로, 잘 96 (또는 잘 384) 우리의 프로토콜 형식의 소형화는 높은 처리량에 여러 조건을 검사 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>LiveBlazer FRET-B/G 로딩 키트 (CCF4-AM) </td><td>Invitrogen</td><td>K1089</td><td>빛으로부터 보호, 재고 있음 - 80 &deg; 분취</td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>&mu; CLEAR-PLATE, BLACK, 96 well </td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>프로베네시드</td><td>시그마</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-락타마제</td><td>시그마</td><td>P0389</td><td></td></tr></tbody></table>

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

시겔 flexneri는 endocytic 공포에 입력 숙주 세포에 침입 병원성 세균이다. 그 후,이 막 동봉 된 구획의 파열, 박테리아 세포질 내에서 이동할 수 있습니다 급증하고 추가 주변 세포를 침공. 결핵균이 면역 세포에 의해 phagocytosed 세포이며, 최근 대식 세포의 파열 막의 phagosomal로 표시되었습니다. 우리는 시겔 flexneri 또는 결핵균의 숙주 세포 기입 한 후, 막의 phagosomal 중단을 추적하기위한 강력한 분석을 개발했다. 방법은 CCF4를 사용합니다,이 숙주 세포의 세포질에서 평형을 β-lactamase의에 민감한 기자 무서워. 박테리아가 막 동봉 된 구획에 상주으로 세균성 병원체에 의한 숙주 세포의 침공에, 프로브만큼 그대로 유지됩니다. 즉시 세포 내 병원균의 클리브 CCF4의 표면에 공포, β-lactamase의 활동 중단 후 리드신호를 FRET의 손실 ING 및 발광 스펙트럼을 전환. 이 강력한 비례 분석이 침입 박테리아에 의해 유도 된 액포 파열의 타이밍에 대한 정확한 정보를 얻을 수, 그리고 그것은의 방출 신호의 검출을위한 전문적인 알고리즘에 의해 자동으로 현미경 및 이미지 프로세싱에 결합 할 수있는 것은 기증자와 수용체를 무서워. 또한, 단일 세포에서 실시간으로 세포 내 세균에 의해 이끌어 액포 장애의 역학을 조사 할 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 완벽하게 이전의 방법을 초과하는 시공간적 해상도 높은 처리량 분석에 적합합니다. 여기, 우리는 시겔 flexneri뿐만 아니라 결핵균 marinum, 진균의 bovis 등 여러 마이코 박테리아 균주를 사용하여 시간 경과 실험 또는 최종 점 실험 헬라 세포와 THP-1 대식 세포에 CCF4 액포 파열 분석을위한 모범적 인 프로토콜의 실험 세부 사항을 제공 그리고 결핵.

CCF4-AM/β-lactamase 방식은 시겔 flexneri (그림 1)과 같은 세포 내 병원균의 액포 파열을 추적하기위한 강력하고 중요한 방법입니다. 본 연구에 사용 된 시겔 균주 M90T AfaI와 BS176 AfaI를라고합니다. M90T AfaI 효율적으로 상피 세포의 표면에 15에서 CD55에 바인딩 할 수 있습니다 adhesin AfaE을 표현 시겔 flexneri 변형입니다. 따라서 AfaE 표현 변종 상피 세포에서 야생 형 M90T 균주에 비해 훨씬 높은 내습 능력을 표시합니다. BS176 AfaI 플라스미드 시겔 독성은없는 돌연변이 시겔 flexneri 변형을 표현 AfaE입니다. 이 변형은 헬라 세포를 침입 할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고이 변형이 세포 라인의 이해 고전 식균 작용에만 의존하는 기능 유형 3 분비 시스템을 필요로하지 않기 때문에 THP-1 세포를 입력 할 수 있습니다. 두 균주는 β-lactamase의 표현, 플라스미드 AfaE 인코딩의 존재로 인해 화면에 표시 β-lactamase의 활동. 1 시간 동안 비 침습 BS176 AfaI 변형과 헬라 세포에 감염되면, CCF4는 녹색 신호 (535 nm의)에 의해 그림 2a에서와 같이 프로브는 그대로 남아 무서워. 반대로, 1 시간 동안 악성 M90T AfaI 변형과 감염은 세포질에서 프로브의 분열을 강조 파랑 (450 nm의) 방향으로 신호의 스위치에 연결됩니다. 이 정량화하기 위해, 우리는 자동화 된 세포의 검출 및 비례 신호의 측정을위한 535 450 nm의 채널 강도를 측정 할 수 Metamorph와 아카펠라 소프트웨어에 대한 스크립트를 개발했다. 같은 그림 2B와 같이 핵 세포의 세포질은 DRAQ5 채널을 사용하여 분할 수 있습니다. 그런 다음 알고리즘은 각 셀에 대해 두 강도 사이의 비율을 계산하기 위해 450 nm의 535 nm의 긍정적 인 세포 인구를 감지 할 수있다그림 2C에서 막대 그래프로 표현. 낮은 비율은 악성 변형에 대한 높은 비율 대 돌연변이 균주 얻을 수 있습니다. 이 대표 감염 실험 공 촛점 현미경을 사용하여 획득 한 동안 epifluorescence에 현미경은이 작업에 적합 2 개의 다른 인간의 세포 유형을 사용하여 그림 3과 4는 예 :. 헬라 상피 세포와 THP-1 대식 세포와 같은 세포. 악성 M90T AfaI 시겔 1 시간 동안 긴장과 헬라와 THP-1 세포, 파랑, 녹색 (535 nm의)에서 신호 스위치 90 분 감염시 (450 NM) BS176 AfaI 감염된 세포 (그림 3A의 비교 관찰 및 4A). 우리는 MetaMorph 소프트웨어 개발 스크립트는 세포의 직접 CCF4 긍정적 인 인구를 감지하고 450 강도 및 각 개별 셀 535 nm의 채널 사이의 비율을 계산합니다. 그런 다음 셀은 매크로 develo을 사용하여 자신의 비율의 함수로 분류됩니다Excel에서 PED, 따라서 세포의 분포를 보여주는 히스토그램을 항복. 이 아카펠라를 위해 개발 된 다른 스크립트의 경우 이래로 M90T AfaI 감염된 세포는 헬라 세포와 THP-1 대식 세포 (그림 3B 및 4B)에 MetaMorph 알고리즘을 사용하여 높은 비율을 표시하는 반면, BS176 AfaI 감염된 세포는 낮은 비율을 특징으로 . 마지막으로, 결핵균의 연구에이 방법의 적응은 그림 5에 나와 있습니다. 결핵균의 bovis BCG는 같은 실험의 시간 과정을 통해 감지 된 강력한 535 nm의 신호에 의해 반사 실험의 전체 과정에 대한 phagosome에에 있습니다. 반면, 결핵균 감염 7 일 (그림 5A와 5B)에서 450 nm의 신호에 의해 강조로 감염 3 일 이상 후 THP-1 대식 세포에서 막의 phagosomal 파열을 이끌어. 시겔에 의해 액포 파열 연구와 동일한 알고리즘을 사용하여 </EM&gt;, 우리는 결핵균에 감염된 세포가 감염 7 일 (그림 5C 및 5D) 후 결핵균의 bovis BCG 이상 535분의 450 nm의 비율을 표시하는 것으로 나타났습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1.jpg" /> 그림 1. 추적 시겔 flexneri 액포 파열에 대한 CCF4-AM/β-lactamase 분석의 원리를. 표현 방식은 CCF4-AM 자유롭게 에스테르 잔기가 CCF4 음이온을 생산 세포질 에스 테라 제에 의해 전원을 가리킨다 세포질에 세포막을 통해 확산. 이 반응은 막 내장 구획에 들어가는 CCF4을 방지합니다. 이 단계에서, CCF4 405 nm에서 여기에 535 nm에서 무서워 이끌어 낸다. 프로브는 β-lactamase의 발현 박테리아 ruptur 때까지 그대로 유지됩니다endocytic 공포를 마. 이 단계에서,이 CCF4가 β-lactamase의 405 nm에서 여기에 450 nm의 535 nm의에서 방출 스위치를 트리거하여 쪼개 때문에 신호가 끊어 무서워. <img alt="그림 2" fo:content-width="2.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2.jpg" /> 그림 2. 공 촛점 현미경을 사용하여 시겔 flexneri 액포 파열 추적. (A) CCF4-AM 로딩 중 2 시간 30 분 후, 헬라 세포는 1 시간 고정 용 β-lactamase의 표현 시겔 flexneri BS176 AfaI 돌연변이 균주 또는 M90T AfaI 악성 변형에 감염 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여. 그런 핵은 DRAQ5 물들​​ 세포는 배 목적으로 공 촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 대표 사진은 다음 병합 된 채널을 선택했다 : the 그대로 CCF4 프로브는 535 nm의 (초에 나타납니다N), 쪼개진 CCF4 프로브는 450 nm의 (파란색)에 나타납니다. 아카펠라 소프트웨어에 대한 우리의 자동화 된 알고리즘의 검출 시스템을 강조 사진 (B) 예. 세포 (핵 + 세포질)의 조각은 D​​RAQ5 채널을 사용하여 얻을 수 있습니다. CCF4 양성 세포를 함께 풀링 450 535 nm의 채널을 사용하여 얻을 수 있습니다. (C) 히스토그램은 시겔 flexneri BS176 AfaI 균주 또는 M90T AfaI 악성 변형을 사용 아카펠라에 대한 우리의 자동화 된 분석의 결과를 표시합니다. 평균 비율은 450 535 nm의 채널 강도의 비율을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50116/50116fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3.jpg" /> 그림 3. 시겔 FLE 추적epifluorescence에 현미경을 사용하여 헬라 세포 xneri 액포 파열. (A) CCF4-AM 로딩 중 2 시간 30 분 후, 헬라 세포는 1 시간과의 β-lactamase의 표현 시겔 flexneri BS176 AfaI 돌연변이 균주 또는 M90T AfaI 악성 변형에 감염 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 고정. 그런 다음, 세포 20X 목적으로 epifluorescence에 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 대표 사진은 다음 채널을 선택했다 :. CCF4 그대로 프로브 535 nm의 (녹색) 및 CCF4 쪼개진 프로브 450 nm의 (블루) (B) MetaMorph 소프트웨어에 대한 우리의 자동화 된 분석의 결과를 나타내는 히스토그램. 각각의 셀은 450 535 nm의 채널 강도의 그들의 비율의 기능으로 배포됩니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4.jpg" /> &gt; 그림 4. epifluorescence에 현미경을 사용하여 THP-1 세포에서 시겔 flexneri 액포 파열 추적. (A) CCF4-AM 로딩, 2 시간 30 분 후 THP-1 세포는 β-lactamase의 표현 시겔 flexneri BS176 AfaI 돌연변이 균주 또는 M90T AfaI에 감염 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 1 시간 30 분 고정 용 악성 변형. 그런 다음, 세포 20X 목적으로 epifluorescence에 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 대표 사진은 다음 채널을 선택했다 :. CCF4 그대로 프로브 535 nm의 (녹색) 및 CCF4 쪼개진 프로브 450 nm의 (블루) (B) MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 우리의 자동화 된 분석의 결과를 나타내는 히스토그램. 각각의 셀은 450 535 nm의 채널 강도의 그들의 비율의 기능으로 배포됩니다. ghres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 추적은 Mycobacterium의 bovis BCG와 epifluorescence에 현미경. (A, B)를 사용하여 THP-1 식세포에서 결핵균 phagosomal 파열 THP-1 세포는 2 시간 동안 β-lactamase의 표현은 Mycobacterium의 bovis BCG 나 결핵균에 감염하여 3되는 7 일 동안 배양 . 세탁 후, 세포와 함께로드됩니다 CCF-4-AM 2 시간 고정은 40X 목적으로 epifluorescence에 현미경을 사용하여 이미징 전에 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용합니다. . 쪼개진 CCF4, 프로브 450 nm의 (블루) (C, D) MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 우리의 자동화 된 분석의 결과를 제시 히스토그램 그대로 CCF4 프로브, 535 nm의 (녹색) : 대표 사진은 다음 채널을 선택했다. 개별 셀은 450 535 nm의 채널 강도 사이의 비율의 함수로 배포됩니다.

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해 이끌어<em&gt; 시겔 flexneri<em&gt;</em</em&gt;와<em<em&gt;<em&gt; 결핵균</em&gt;</em</em&gt; 숙주 세포 침입시. 우리의 분석은 CCF4를 사용한다, 세포질 호스트는 라이브 또는 고정 된 세포에서 프로브를 무서워. 이 기자는 세균의 표면에 효소 활성의 존재에 의해 저하됩니다.

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

본 실험은 단일 세포 내에서 세포내 병원체에 의해 유도되는 VA 파열을 관찰합니다. 먼저 세포 내 에스테라제에 의해 분해되는 CCF 4:00 AM 염료를 세포에 로딩합니다. 그 다음 FL neuro bacteria를 준비하여 CCF 4가 로딩된 세포에 처리하고, 박테리아가 숙주 세포로 침입할 수 있도록 37 °C에서 세포를 배양합니다.그런 다음 450 nanometer 및 535 nanometer 채널에서 방출된 강도의 비율을 결정합니다. 결과는 고처리량 용해에 대한 적응성 덕분에 세포질 내 병원체의 존재를 보여줍니다. 이 기술은 숙주-병원체 상호작용 중 박테리아의 세포 내 국소화라는 핵심 문제를 해결함으로써 새로운 항생제의 식별을 용이하게 합니다.동료인 Tran Vanu와 함께, 저희는 높은 시간 분해능으로 세포 내 병원균을 관찰하는 방법론을 개발하는 데 관심을 가졌습니다. 이는 CCF4 베타-락타마제 규칙적 파열 분석법(regular rupture assay)의 확립으로 이어졌습니다. 오늘 이 방법은 연구실의 두 대학원생인 Nora MellU와 Charlotte Keller가 실험적으로 시연할 예정입니다. 야생형 및 변이 박테리아 균주를 50 µg/mL의 ampicillin이 포함된 8 mL의 TCSB에 접종하십시오. 배양액을 37 °C 진탕 배양기에 넣으십시오. 이제 웰당 5 × 10³개의 HeLa 세포를 분주하십시오.10% fetal calf serum과 1% penicillin streptomycin이 포함된 100 µL의 DMEM 배지에서 5% carbon dioxide 인큐베이터 내의 세포를 배양한 다음 날, 50 µg/mL의 ampicillin이 첨가된 TCSB에서 박테리아를 1/100 희석하여 분주하고 37 °C 쉐이커에서 2시간 30분 동안 배양합니다. HeLa 세포 로딩을 위해 EM 버퍼로 CCF4-AM 염료를 준비하고 PBS로 세포를 1회 세척합니다. 그 후, 웰당 25 µL의 CCF4-AM 로딩 믹스를 첨가하고 실온의 암소에서 2시간 30분 동안 반응시킵니다. 감염을 위한 박테리아 준비를 위해 1 mL의 배양액을 원심분리하여 펠렛화하고, 500 µL의 PBS로 1회 세척합니다. 이후 10 µg/mL의 polyol lysine과 40 µg/mL의 beta-lactamase가 첨가된 500 µL의 PBS에 박테리아를 재현탁합니다.실온의 회전 휠에서 10분간 배양한 후, 500 µL의 PBS로 한 번 세척하고, 각 박테리아 펠릿을 EM 버퍼 내 1 mM Probenecid 500 µL에 다시 현탁합니다. 그런 다음 EM 버퍼 내 1 mM prob 150 µL로 세포를 한 번 세척합니다. 이어서 박테리아 10 µL를 1 mM probed 용액 100 µL에 희석하여 HeLa 세포가 있는 각 웰에 분주합니다. 실온의 암소에서 15분간 배양한 후, 플레이트를 37 °C로 옮겨 1시간 동안 배양합니다.1 mM probenecid 용액 150 µL로 한 번 세척합니다. 그다음 1 mM Pro 용액에 포함된 4% paraform aldehyde 50 µL를 사용하여 암실에서 10분 동안 시료를 고정합니다. Probenecid 용액으로 한 번 세척한 후, 최적의 세포 분할을 위해 10 µM의 핵 염색약 Draq5 30 µL를 첨가합니다. 세포를 30분 동안 배양하고, 한 번 세척한 뒤 1 mM 용액 100 µL를 첨가하여 도립 에피 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.405 nm의 들뜸 파장을 사용하십시오. 투과광의 경우 5 ms의 노출 시간을 사용하여 450 nm 및 535 nm 필터를 통해 방출을 검출하십시오. 535 nm의 경우 1000 ms, 450 nm의 경우 500 ms의 노출 시간을 설정하십시오.자동 현미경에 결합된 초점 교정 장치를 사용하면 여러 웰의 수십 가지 서로 다른 위치를 동시에 획득할 수 있습니다. 공초점 현미경을 사용하는 경우, 405 nm 레이저에 대해 450 nm에서 240 milliseconds, 535 nm에서 360 milliseconds의 노출 시간을 사용하고, 640 nm 레이저에 대해 640 milliseconds의 노출 시간을 사용하십시오. 각 개별 세포의 형광 신호를 자동 점수화할 수 있는 컴퓨터 알고리즘을 통해 데이터를 분석하십시오.예를 들어, metamorph 및 acapella와 같은 소프트웨어를 사용하여 450 nanometer와 535 nanometer 방출 신호 사이의 비율을 측정하는 스크립트를 생성하십시오. 이 분석을 위해, 최종 부피 2 milliliters에 2 × 10⁵개의 세포를 사용하여 HeLa 배양을 시작하십시오. 감염을 위해 박테리아를 준비하고 HeLa 세포에 CCF 4:00 AM을 로딩한 후, 37 °C 가열 챔버 내에 N plan air 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 배치하십시오.405 nanometer 레이저를 설정하고, 450 nanometer 및 535 nanometer 필터를 통해 방출 광학계를 설정하십시오. 또한, 투과광의 노출 시간은 5 milliseconds로, 535 nanometer는 200 milliseconds로, 450 nanometer는 100 milliseconds로 입력하십시오.60분 동안 90초마다 데이터 획득이 이루어지도록 설정합니다. 이제 1 mM Probenecid 용액 2 mL로 세포를 한 번 세척합니다. 1 mM prob가 포함된 em 버퍼 2 mL를 첨가합니다.그런 다음 디쉬를 현미경 스테이지 위에 올리고 6분 후에 획득을 시작합니다. 획득을 일시 중지하십시오. 세포 위에 박테리아 재현탁액 250 µL를 첨가하고 획득 후 분석을 위해 획득을 다시 시작합니다.Velocity metamorph 또는 image J를 사용하여 동영상을 시각화하십시오. 각 개별 세포에 대한 450에서 535 nanometer 강도 비율을 구하십시오. CCF 4:00 AM beta-lactamase 방식은 HELOC 세포 감염 시 gel flexneri와 같은 세포 내 병원균의 울라 파열을 추적하는 강력하고 민감한 방법입니다. 비침습적인 BS 176 AFA one strain으로 1시간 동안 처리하면, CCF four fret 프로브가 온전하게 유지되어 녹색 신호를 방출합니다.이와 대조적으로, 독성이 강한 M 90 TFA I 균주는 비율 측정 신호 결정을 위해 세포질 내 프로브 절단과 일치하게 신호를 청색으로 전환합니다. 당사는 세포 검출 및 535 및 450 nanometer 채널의 측정을 자동화하기 위해 metamorph 및 acapella 소프트웨어용 스크립트를 개발했습니다. 세포의 핵과 세포질은 DR five 채널을 사용하여 분할됩니다.그 다음, 알고리즘을 통해 450 nanometer 및 535 nanometer 양성 세포 집단을 검출하고 정량화할 수 있습니다. 계산된 평균 비율은 돌연변이 균주에서는 낮게, 병원성 균주에서는 높게 나타납니다. 실험은 Gila 상피 세포 및 THP one 대식세포 유사 세포와 같은 다양한 인간 세포 유형을 대상으로 수행할 수 있습니다.두 세포 유형 모두 병원성 M 90 T AFA one cha 균주에 반응하여 감염 시 방출되는 신호를 녹색에서 청색으로 전환합니다. 비침습적 균주의 경우 녹색 신호가 유지됩니다. metamorph 소프트웨어에서 개발한 스크립트와 Excel에서 개발한 매크로를 이용한 정량 분석 결과, 세포 분포에 따른 구멍 파열(ular rupture)의 히스토그램이 나타납니다. 이 방법은 서로 다른 박테리아의 감염력을 이해하는 데 성공적으로 적용될 수 있습니다.예를 들어, 이 데이터 세트는 mycobacterium Bovis. BCG가 지속적인 녹색 신호에서 나타나듯 실험 과정 전체 동안 파고좀 내에 머무름을 보여줍니다. 이와 대조적으로, mycobacterium tuberculosis는 동일한 알고리즘을 사용했을 때 감염 7일 후 450 nanometer 신호가 나타나는 것으로 강조되듯이, THP one 대식세포에서 7일의 감염 후 vaga omal 막 파열을 유발합니다.Ella의-valar rupture 연구와 관련하여, mycobacterium tuberculosis 감염 세포는 감염 7일 후 mycobacterium bovis BCG보다 450 nm 대 535 nm 비율이 더 높게 나타나는 것을 확인했습니다. 이 영상을 시청하고 나면 CCL four betalactamase assay를 이용해 병원균에 의한 ular rupture를 연구하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙달되면 이 프로토콜은 4시간 이내에 수행할 수 있지만, 프로토콜 전 과정 동안 각 버퍼에 proce를 추가해야 한다는 점을 기억하십시오. 전자 현미경이나 막 분획법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 생화학적 처리 없이 실시간으로 수행할 수 있다는 것입니다.숙주 세포 내 세균의 섭취 및 증식을 평가하기 위해 액틴 표지 또는 젠타마이신 보호 분석과 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다.

single-cell-measurements-vacuolar-rupture-caused-intracellular

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연구

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Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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