Name: 병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 병아리 후뇌에서 특정 뉴런을 표지하고 축삭 궤적 및 시냅스 대상을 추적하는 전기천공법을 이용한 발달 신경생물학 연구 방법입니다. 이 기법은 유전자 도구와 면역형광 염색을 통해 뉴런 연결성을 분석합니다.

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<p class="jove_content"&gt; 우리는 일렉트로 일러스트 레이 션에 대 한 박사의 Yuval 고 트립 - 인 Dror 감사합니다. 이 작품은 이스라엘의 정신 생물학에 대한 국립 연구소와 니더 작센 - 이스라엘 연구 협력 프로그램의 DSD에 보조금 및 이스라엘 과학 재단, 보건 이스라​​엘 사역 및 우수성 유산 유산 센터에서 AK로 보조금에 의해 지원되었다 생명 과학 협력.</p&gt;

1. 후뇌의 Electroporation에 1.1 에그 처리 <ol><li> 가습 배양기 (37-38.5 ° C)에서 수평으로 계란을 넣습니다. 배아들은 16-17 (HH) 단계 (25-30 somites)에 도달했을 때, 배양 65 ~ 70 시간 후 electroporation하여 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 계란을 제거, 그들은 수평 위치에 남아 있습니다. </li></ol> 1.2 준비 <ol><li> 유리 모세관 (0.5 mm 직경)을 당깁니다. </li><li> 펄스 발생기에 어댑터 홀더 구부러진 L-모양의 금 Genetrodes 전극 (3 mm 직경)를 연결합니다. 일렉트로 매개 변수는 25 볼트 5 펄스 수, 45 밀리 초 펄스 길이 300 밀리 초 펄스 간격이 (가) 있습니다. </li><li> 입 피펫, 10 ML의 주사기 바늘, 파라 필름 (parafilm) 스트립, 부드러운 브러시, 날카로운 해부 가위, 25 ML 멸균 PBS 용액을 준비합니다. 이 금액은 일반적으로 계란 트레이 (18 알)을 처리하기에 충분합니다. </li><li> DNA 플라스미드의 적절한 혼합 (5 ㎍ / ㎕의 각을)를 준비하고DNA 주사를 시각화하는 0.025 % 빠른 그린 염료에 대해 추가합니다. 보통 4 μL의 볼륨 트레이의 주입을위한 충분합니다. </li></ol> 1.3 윈도우, 사출 및 Electroporation에 <ol><li> 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 청소합니다. </li><li> 공기에 배아 노출 시간을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 계란을 처리합니다. </li><li> 가위 끝 계란 극에 구멍을 뚫어 주사기와 알부민의 3-4 ML를 제거합니다. 그것은 생존을 감소로 알부민의 큰 금액을 제거하지 마십시오. </li><li> 해부 가위를 사용하여 달걀 껍질의 상단 중앙에 작은 타원형 창 (2.5 × 2 cm 크기)를 엽니 다. </li><li> 전체 과정 동안 건조를 방지하기 위해 태아의 상단에 PBS 몇 방울을 드립. </li><li> 유리에 DNA 혼합물의 작은 금액을로드하면 입 피펫을 사용하여 모세관. </li><li> 쪽으로의 후방 끝 배아를 놓습니다. 배아가 명확하게 볼 수로 잉크가 주입이 단계에서 필요하지 않습니다. 잉크 분사 증가 방지배아 생존. ~ 45 °에서 모세관을 잡고 꼬리 후뇌에 침투. 배 주위로부터 막을 제거하지 마십시오. 공기 방울을 형성하지 않고 후뇌 루멘 내쉬고 조심스럽게 DNA 용액을 주입. DNA 솔루션은 전방으로 펼쳐집니다. </li><li> 바로 DNA 주입 한 후, 정확한 AP 및 대상을 목표로 DV의 후뇌 위치에서 평행 전극을 배치합니다. 이 가능성을 줄일 수 있으므로, 마음을 건드리지 않고 약간 ventrally 전극을 밀어 넣습니다. electroporator를 펄스. 전극 (그림 1A) 전기 전도도를 나타내는 거품으로 덮여해야합니다. </li><li> 조심스럽게 전극을 제거하고 배아를 냉각하고 거품을 제거하기 위해 PBS 몇 방울을 똑. 배양 중에 건조를 방지하기 위해 파라 필름 (parafilm) 스트립이 제대로 개방 계란을 밀봉하십시오. 부드러운 브러시로 PBS에 전극을 세척 할 것. </li><li> 시간의 원하는 기간 동안 인큐베이터에 계란을 넣습니다. 배아의 생존을 2 ~ 3 일 후에 약 90 %로일렉트로, 그리고 50 %의 electroporation 후 최대 12 일이 줄어 듭니다. </li></ol> 2. 배아의 분석 2.1 평면 마운트 준비와 면역 <ol><li> 후뇌의 평면 마운트 준비는 쉽게 현미경 또는 입체 음향 현미경으로 축삭을 시각화하기 위해 E6.5까지 수행 할 수 있습니다. </li><li> 주변 점막과 혈관에서 분리하여 조심스럽게 배아를 해부. PBS를 포함하는 코팅 페트리 접시 - 작은 실리콘에 배아를 놓습니다. dorsally에 직면 텅스텐 핀으로 접시에 배아를 연결합니다. 후뇌 날카로운 유리 모세관을 사용하여 지붕 플레이트 등의 슬릿을 수행합니다. </li><li> 날카로운 핀셋 및 마이크로 가위를 사용하면 머리의 상단 부분을 잡고 주동이의 꼬리에 매우 신중 후뇌 조직을 당겨. 후뇌의 분리 후 깨끗한 준비 도달하기 위해 남아있는 복부 조직을 제거합니다. </li><li> 4와 후뇌을 품어상온에서 1 ~ 2 시간 동안 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (RT). PFA를 제거하는 PBT (PBS/0.1 % 트리톤 X-100)와 후뇌을 씻으십시오. </li><li> 평면 장착 hindbrains에서 면역 형광에 대한 차단 솔루션을 500 μL (4시 ON 1 차 항체 ° PBT와 C. 워시 (15 분 × 3)와 RT 품어에서 2 시간 동안 PBT와 부화에있는 염소 혈청의 5 %를 추가합니다. 품어은 RT에서 2 시간 동안 2 차 항체. PBT (15 분 × 3)로 씻으십시오. </li><li> 유리 슬라이드에 dorsally 직면 후뇌를 놓습니다. 후뇌에 형광등 설치 미디어를 추가 할 수 있습니다. 슬라이드 후뇌을 평평하게하는 유리 모세관 또는 텅스텐 바늘을 사용합니다. </li><li> 커버 슬립에 의해 조직의 압박을 방지하기 위해 각 모서리에 그리스의 작은 금액을 추가합니다. 후뇌의 상단에 커버 슬립을 조심스럽게 배치하고 공기 방울을 피하십시오. 준수를위한 유리제 가장자리를 커버하기 위해 매니큐어를 추가합니다. </li></ol> 2.2 극저온 섹션과 면역 형광 <ol><li> 뇌간 CA의 극저온 섹션N 축삭 궤적을 시각화하는 모든 단계에서 수행 할 수. 그러나, E6.5 후이 너무 두껍게되어 평면 장착 배아에서 축삭을 시각화하는 데 어려움으로 인해 선호하는 방법이어야한다. 또한, 시냅스의 데모 조직과 현미경 고배율보기의 단면이 필요합니다. </li><li> 배아를 해부하고 모든 주변 조직을 제거합니다. PBS로 씻어. 마이크로 가위와 날카로운 핀셋을 사용하여 수질의 꼬리 부분에서 배아를 잘라. 소뇌와 중뇌 사이의 넓은 절개를 확인하고 전체 뇌간를 제거합니다. 조직 수질, 뇌교와 소뇌를 포함해야합니다. </li><li> PBS (10 분 × 3)로 씻어 4에서 밤새 4 % PFA (ON) ° C에서 뇌간을 수정하고 ON 4 ° C에서 침몰까지 30 % 자당에 품어. </li><li> 10월 (최적 절삭 온도) 화합물 CRYO-금형 후뇌를 포함하고, 냉동, 다른 곳과 마찬가지로 11 설명까지 -20 ° C에 배치합니다. </li><li&gt; 원하는 단면 축에 그라 이오 스탯에 OCT의 블록을 놓습니다. 섹션 폭은 12 μm의 수 있습니다. </li><li> 슬라이드를 건조. RT에서 2 시간 동안 각 슬라이드에 100 μl를 차단 솔루션을 추가합니다. 항체 100 μl를 (원하는 농도 차단 용액에 희석)을 추가합니다. 1 차 및 2 차 항체 배양 기간은 4시에 ON으로 각각 RT에서 ° C 또는 2 시간. 각 배양 시간 동안 부드럽게 건조를 방지하기 위해 슬라이드의 상단에 파라 필름 (parafilm) 스트립을 추가합니다. 항체 사이의 PBS (10 분 × 3)로 씻으십시오. 필요한 경우, RT에서 20 분 동안 PBS에 희석 1:1,000 DAPI을 (4&#39;-6-Diamidino-2-페닐 인돌) 추가합니다. PBS로 씻어. </li><li> 형광등 설치 미디어 슬라이드를 장착합니다. 분석하기 전에 1 시간 동안 건조하자. </li></ol>

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</ol>

<p class="jove_content"관심&gt; 없음 충돌 선언하지 않습니다.</p

비켜 electroporation에있는 병아리 신경 시스템 개발 20시 세포의 사양과 축삭 지침을 검토하는 가능한, 신뢰할 수있는 효과적인 도구입니다. 이 프로토콜에서는 특정의 interneurons의 조건 라벨을 사용 증강 요소를 사용하여 E2.75에 병아리 후뇌에있는 일렉트로의 모드를 설명합니다. 이 전략은 배아의 고급 단계에서 축삭 노선 계획과 시냅스 사이트의 추적을 가능하게 병아리 게놈에 외부 유전자를 삽입하는 PiggyBac 매개 전위 시스템과 결합됩니다. 병아리 후뇌의 레이블 축삭 / 시냅스 이전에 방법은 라벨 또는 실험에게 21-23를 접목 고전 역행 또는 선행 성 염료를 포함되어 있습니다. 이러한 연구는 후뇌 오름차순와 축삭 책자를 내림차순에 중요한 결과를 기여했다. 그러나 일부 궤적과 예측은 이러한 세포의 방법에 의해 간과되었다. 식용 보의<html> 이온,보고 funiculi에 투사 뉴런의 하위 그룹의 ...

후뇌 오름차순와 신경 네트워크를 내림차순를 통해 중앙과 주변 신경 시스템 간의 통신에 의한 신경계의 중요한 중계 허브를 나타냅니다. 그것은 호흡, 의식, 청각,와 모터 조정 1-3 등의 기본적인 기능을 조절한다. 초기 배아 발달 동안 척추 후뇌는 일시적으로 서로 다른 신경 세포 유형을 형성하고 여러 뇌간 핵 센터 4 생성되는 반복 rhombomeres로의 전후방 (AP) 축을 따라 세분화된다. 후뇌는 개별 신경 세포의 전구 세포가 지정되고 별개의 DV 위치에 3,5,6을 차별화하는 기초와 날개의 접시에 자사의 지느러미 - 복부 (DV) 축을 따라 구분됩니다. 초기 AP와 DV 특정 신경 세포의 패턴 기능 뇌간 회로에의 설립을 관리하는 방법은 크게 알려지지 않은 것입니다. 이 기본에 대한 지식을 얻기 위해질문 도구는 초기 후뇌에있는 뉴런의 특정 하위 집합에 레이블을 지정하려면보다 고급 단계에서 자신의 축삭 탄도와 연결을 추적하기 위해 필요합니다. 우리는 이전에 특정 증강 요소를 활용하고, 초기 병아리 배아 7-9 지느러미 척추의 interneurons의 축삭 궤적을 추적 크레 / LoxP 기반 조건식 시스템에있다. 현재 원고에서 우리는 후뇌를 대상으로하고 수정 일렉트로 전략과 PiggyBac 사용 후기 배아 후뇌의의 interneurons, 축삭과 시냅스 목표를 라벨에 대한 실험 패러다임 업그레이드 - 중재 DNA 전위합니다. 우리의 새로운 전략은 2 최대 12 일 ~ 후뇌과 축삭 돌기 다양한 배아 단계에서 시냅스 사이트의 추적의 한면에 서로 다른 신경 세포 아형의 태그가 일렉트로 다음 수 있습니다. 이 방법에 따라, 우리는 후뇌의의 interneurons의 지느러미 - 대부분의 서브 그룹 (dA1/Atoh1을 + 표시 </s위로&gt; 세포)와 두 개의 반대측 오름차순 축삭 돌기 패턴을 밝혀, 각각은 별개의 삭조에서 다른 AP의 위치와이 신장에서 파생됩니다. DA1 축삭은 프로젝트와 청각 핵, 중뇌 및 소뇌 (10)의 여러 계층에서 폼 시냅스에 발견되었다. 병아리의 electroporation의 조합은 유전자가 신경 세포와 개발의 많은 고급 단계에서 투영 사이트 분석 추적 뇌의 신경 네트워크의 형성을 연구 및 회로 형성을 제어하는​​ 분자 메커니즘을 해명하는 독특한 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>L자형 금 Genetrodes 3mm 전극</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0162</td><td></td></tr><tr><td>펄스 발생기, ECM 830</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>OCT(최적 절단 온도) 컴파운드</td><td>티슈-텍 Sakura</td><td>4583 O.C.T. 컴파운드</td><td></td></tr><tr><td>매니큐어</td> 모든 <td>상업 공급업체</td><td></td><td></td>의</tr></tbody></table>

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

병아리 배아 신경 튜브의 일렉트로는 신경 세포에 외래 유전자의 발현에 대한 신속하고 효율적인되는 등 많은 장점이 있습니다. 이 논문에서 우리는, 특별히 신경 전구 세포의 하위 집합에 레이블을 지정하기 위해 E2.75에 새 후뇌로 DNA를 electroporate하는 방법을 독특하게 보여줍니다 방법, 방법 개발의 많은 고급 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 수행하는 방법 제공 최대 E14.5합니다. 기반의 플라스미드와 후뇌 세포 (의 interneurons, DA1의 지느러미 가장 하위 그룹)의 하위에 GFP 발현을 유도하는 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템 - 우리는 특정 증강 요소, 크레 / 훈제 연어 등의 소설 유전 도구를 활용했다. 축삭의 탄도와 DA1 축삭의 목표는 다양한 뇌간 지역에서 초기 및 후기 배아 단계에서 다음입니다. 이 전략은 배아 후뇌에 대한 관심의 세포를 타겟팅하고 tra에 대한 고급 기술에 기여개발의 여러 단계에서 회로 형성의 cing.

이 프로토콜은 최근 병아리 후뇌 10의 interneurons의 DA1 하위 그룹의 축삭 패턴 및 프로젝션 사이트를 발견하는 데 사용되었다. 특히 이러한 축삭에 레이블을 지정하려면, 이전에 척추 DI1 신경 8,12,13 특정으로 특징 된 증강 요소 (Atoh1은), 후뇌 DA1 세포를 10으로 표현할 수 있도록이 확인했습니다. 요소는 크레 재조합 플라스미드 크레 따라 세포질 GFP 기자 (; 그림 1BI pCAGG-LoxP 스톱 LoxP-cGFP)와 함께 E2.75에 공동이 - electroporation하여 상류로 복제되었다. Hindbrains은 평면 마운트 준비로 48 시간 다음의 electroporation을 분석하고 두 콘트라 측면 오름차순 축삭 돌기 패턴 (그림 2A)를 공개했다; 하나의 기관이 독점적 등의 삭조에 길쭉한 것이 6-7 rhombomeres에 위치한 DA1 신경 세포에서 파생 된 반...

발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

이 절차의 전반적인 목표는 병아리 뒷뇌에 있는 뉴런의 특정 하위 집합에 레이블을 지정하고 축삭 궤적과 표적을 추적하는 것입니다. 이것은 먼저 배아의 하루 중앙에 있는 작은 타원형 창을 열어서 달성됩니다.2.75. 난자 다음 DNA 플라스미드를 뒷뇌 내강에 주입합니다.그런 다음 뒷뇌를 일방적으로 전기천공하여 원하는 뉴런 그룹에서 구조체를 발현하고 난자를 배양할 수 있도록 합니다. 마지막으로, 뇌간은 편평한 산 준비 또는 조직 절단을 위해 전체 배아에서 절개됩니다. 궁극적으로 면역형광 염색 및 현미경 분석을 통해 다양한 발달 단계에서 뒷다리, 뇌 및 소뇌의 축삭 돌기와 시냅스 표적을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 배아 발달 중에 특정 신경 세포가 축삭을 투영하고 시냅스 연결을 형성하는 방법과 같은 발달 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전기천공을 준비하려면 섭씨 37도에서 38도 반에서 16-17단계에 도달할 때까지 65-70시간 동안 배양합니다. 알이 부화하는 동안 유리 모세관을 당겨 구부러진 L자형 금 전극을 어댑터 홀더와 펄스 내레이터에 연결합니다.electroporation 매개변수를 25V, 5개의 펄스 수, 45밀리초 펄스 길이 및 300 펄스 간격으로 설정합니다. 구강 피펫, 10ml 주사기 바늘, 파라폼 스트립, 부드러운 브러시, 날카로운 해부 가위, 25ml의 멸균 PBS를 준비합니다. DNA 플라스미드의 적절한 혼합물을 준비하고 빠른 녹색 염료를 첨가하여 주입된 DNA를 시각화합니다.알이 적절한 발달 단계에 도달하면 인큐베이터에서 난자를 꺼내 수평 위치에 두십시오. 70% 에탄올을 사용하여 달걀 껍질을 청소하십시오. 배아 노출을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 난자를 다루십시오.가위 끝으로 바람을 쐬는 시간. 달걀 기둥에 구멍을 뚫고 주사기로 3-4ml의 알부민을 제거합니다. 해부 가위를 사용하여 달걀 껍질의 위쪽 수평 기둥에 있는 작은 타원형 창을 엽니다.전체 과정 동안 건조를 방지하기 위해 배아 위에 PBS 몇 방울을 떨어뜨립니다. 구강 피펫을 사용하여 소량의 DNA 혼합물을 유리 모세관에 로드합니다. 다음으로, 배아의 뒤쪽 끝이 간접 보이도록 배아를 배치합니다.그런 다음 모세 혈관을 약 45도로 유지하고 코들 뒷뇌를 관통합니다. 기포를 형성하지 않고 배아 주변의 막을 제거하지 마십시오. 조심스럽게 숨을 내쉬어 DNA 용액을 뒷뇌 내강에 주입합니다.용액은 DNA 주입 직후 전방으로 퍼집니다. 평행 전극을 정확하게 표적화된 AP 및 DV 뒷 뇌 위치에 놓습니다. 심장에 닿지 않고 전극을 복부 쪽으로 약간 밀고 전기를 펄스합니다.전극은 전기 전도도를 나타내기 위해 거품으로 덮여 있어야 하며, 전극을 조심스럽게 제거하고 PBS 몇 방울을 떨어뜨려 배아를 냉각시키고 거품을 제거해야 합니다. 퍼필 스트립을 사용하여 부화 중 건조를 방지하기 위해 부드러운 브러시와 PBS로 계란 입구를 적절하게 밀봉하고 전극을 세척하고 원하는 시간 동안 계란을 인큐베이터에 넣습니다. 배아의 생존율은 전기천공법 후 2-3일 후 약 90%이며 전기천공법 후 12일 후에는 최대 50%까지 감소합니다.뒷뇌를 평평하게 준비하려면 배아를 조심스럽게 해부하여 주변의 막과 혈관에서 분리하십시오. PBS가 들어 있는 작은 실리콘 코팅된 페트리 접시에 배아가 배아가 배쪽을 향하도록 배아를 놓습니다. 텅스텐 핀을 사용하여 접시에 부착하십시오.그런 다음 날카로운 유리 모세관을 사용합니다. 날카로운 핀셋과 마이크로 가위로 뒷다리 브레닌 지붕 플레이트에 등쪽 슬릿을 만듭니다. 머리의 윗부분을 잡고 뒷뇌 조직을 매우 조심스럽게 당겨 주부에서 유아용으로 당깁니다.뒷뇌를 분리한 후 남아 있는 복부 조직을 제거합니다. 뒷뇌를 4% 파라폼 알데히드 또는 PFA 용액에 실온에서 1-2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBT로 세척하여 PFA를 제거합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 면역형광 제제를 따른 후, 뒷뇌를 등쪽을 향하도록 유리 슬라이드에 놓습니다. 뒷뇌에 형광 장착 매체를 추가하고 유리 모세관 또는 텅스텐 바늘을 사용하여 슬라이드의 뒷뇌를 평평하게 만듭니다. 커버 슬립으로 조직이 짜지는 것을 방지하기 위해 각 모서리에 소량의 그리스를 추가하십시오.접착을 위해 기포가 생기지 않도록 뒷뇌 위에 커버 슬립을 조심스럽게 놓습니다. 커버 유리 가장자리에 매니큐어를 바릅니다. 뇌간의 냉동 절편은 E 6.5 이후의 모든 발달 단계에서 수행할 수 있습니다.그들은 매우 두꺼워지는 편평하게 장착된 배아에서 축삭을 시각화하는 것이 어렵기 때문에 선호되는 방법이어야 합니다. 더욱이, 시냅스를 입증하기 위해서는 조직의 절편과 현미경으로 볼 수 있는 고배율 보기가 필요합니다. 냉동 절편을 위한 샘플을 준비하려면 배아를 해부하고 뇌를 둘러싼 모든 조직을 제거합니다.PBS로 헹굽니다. 그런 다음 마이크로 가위와 날카로운 핀셋을 사용하여 수질의 새끼 영역에서 배아를 자릅니다. 소뇌와 중뇌 사이를 넓게 절개하고 뇌간 전체를 제거합니다.조직에는 수질과 소뇌가 포함되어야 합니다. 다음 예에서, 검사 뒷뇌에서 inter neurons의 DA one subgroup에서 발현되는 enhancer element는 Cree recombinase의 상류에 복제되고 Cree 의존성 세포질 GFP 리포터 플라스미드로 coelectropoified되었습니다. E 4.5 단계의 플랫 마운트 준비는 두 개의 반대쪽 상승 축삭 투영 패턴을 나타내어 발달 후반 단계에서 DA 1 inter 뉴런의 축삭 투영을 매핑합니다.pre-con 무조건적인 GFP 리포터 카세트는 A TOH 1 creen enhancer 및 transpose 벡터와 함께 두 개의 피기백 암 사이에 복제되었습니다. 이 전략을 사용하여 Electroporated C precon conditional MG FP가 병아리 염색체에 통합되고 결과적으로 정지 카세트가 D one 뉴런에서만 제거되어 GFP의 발현을 연장할 수 있습니다. DA에서는 하나의 세포가 있습니다.GFP의 mesylated 모양은 세포질에서 묽게 되는 것이 아니라 축삭 막을 따라서 국소화되다 그래야 그것을 막에 밧줄로 묶습니다. E 13.5에서 수집되고 시상 단면에서 분석된 뇌 줄기에서. DA 1 축삭돌기는 소뇌에 축적되어 ZI 1 양성 세포로 표시되는 외부 과립층 또는 EGL로 확장되는 것으로 밝혀졌습니다.소뇌에 있는 D one 축삭돌기의 시냅스 표적도 분석했습니다. E 2.75 배아를 시냅스 소포 단백질 2 리포터 플라스미드와 H 1 크리어 인핸서 및 피기백 전치와 함께 전기천공시켰다. 이 방법은 presynaptic DA one 축삭 말단에서 GFP 리포터의 발현을 가능하게 합니다.소뇌는 E 13.5에서 절편화되었으며 일반 시냅스 전 마커 시냅스 타만(synaptic taman)과 비키니 층을 표시하는 칼빈딘(calbindin)으로 염색되었습니다. 이 단면의 고배율 보기는 비키니 층을 포함한 여러 소뇌 영역에서 SV 2개의 GFP 양성 시냅스 소포를 보여줍니다. 이 결과는 소뇌의 DA 1 뒷뇌 뇌 간 뉴런의 시냅스 연결을 보여줍니다.이 비디오를 시청한 후, 신경 세포의 하위 집합을 구체적으로 라벨링하기 위해 배아 2일차 포인트 75에서 DNA를 조류 Hein으로 전기 조작하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 절차를 통해 여러 발달 단계에서 표지된 신경 세포의 축삭 돌기와 시냅스 연결을 추적할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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