병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

이 절차의 전반적인 목표는 병아리 뒷뇌에 있는 뉴런의 특정 하위 집합에 레이블을 지정하고 축삭 궤적과 표적을 추적하는 것입니다. 이것은 먼저 배아의 하루 중앙에 있는 작은 타원형 창을 열어서 달성됩니다.2.75. 난자 다음 DNA 플라스미드를 뒷뇌 내강에 주입합니다.

그런 다음 뒷뇌를 일방적으로 전기천공하여 원하는 뉴런 그룹에서 구조체를 발현하고 난자를 배양할 수 있도록 합니다. 마지막으로, 뇌간은 편평한 산 준비 또는 조직 절단을 위해 전체 배아에서 절개됩니다. 궁극적으로 면역형광 염색 및 현미경 분석을 통해 다양한 발달 단계에서 뒷다리, 뇌 및 소뇌의 축삭 돌기와 시냅스 표적을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 배아 발달 중에 특정 신경 세포가 축삭을 투영하고 시냅스 연결을 형성하는 방법과 같은 발달 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전기천공을 준비하려면 섭씨 37도에서 38도 반에서 16-17단계에 도달할 때까지 65-70시간 동안 배양합니다. 알이 부화하는 동안 유리 모세관을 당겨 구부러진 L자형 금 전극을 어댑터 홀더와 펄스 내레이터에 연결합니다.

electroporation 매개변수를 25V, 5개의 펄스 수, 45밀리초 펄스 길이 및 300 펄스 간격으로 설정합니다. 구강 피펫, 10ml 주사기 바늘, 파라폼 스트립, 부드러운 브러시, 날카로운 해부 가위, 25ml의 멸균 PBS를 준비합니다. DNA 플라스미드의 적절한 혼합물을 준비하고 빠른 녹색 염료를 첨가하여 주입된 DNA를 시각화합니다.

알이 적절한 발달 단계에 도달하면 인큐베이터에서 난자를 꺼내 수평 위치에 두십시오. 70% 에탄올을 사용하여 달걀 껍질을 청소하십시오. 배아 노출을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 난자를 다루십시오.

가위 끝으로 바람을 쐬는 시간. 달걀 기둥에 구멍을 뚫고 주사기로 3-4ml의 알부민을 제거합니다. 해부 가위를 사용하여 달걀 껍질의 위쪽 수평 기둥에 있는 작은 타원형 창을 엽니다.

전체 과정 동안 건조를 방지하기 위해 배아 위에 PBS 몇 방울을 떨어뜨립니다. 구강 피펫을 사용하여 소량의 DNA 혼합물을 유리 모세관에 로드합니다. 다음으로, 배아의 뒤쪽 끝이 간접 보이도록 배아를 배치합니다.

그런 다음 모세 혈관을 약 45도로 유지하고 코들 뒷뇌를 관통합니다. 기포를 형성하지 않고 배아 주변의 막을 제거하지 마십시오. 조심스럽게 숨을 내쉬어 DNA 용액을 뒷뇌 내강에 주입합니다.

용액은 DNA 주입 직후 전방으로 퍼집니다. 평행 전극을 정확하게 표적화된 AP 및 DV 뒷 뇌 위치에 놓습니다. 심장에 닿지 않고 전극을 복부 쪽으로 약간 밀고 전기를 펄스합니다.

전극은 전기 전도도를 나타내기 위해 거품으로 덮여 있어야 하며, 전극을 조심스럽게 제거하고 PBS 몇 방울을 떨어뜨려 배아를 냉각시키고 거품을 제거해야 합니다. 퍼필 스트립을 사용하여 부화 중 건조를 방지하기 위해 부드러운 브러시와 PBS로 계란 입구를 적절하게 밀봉하고 전극을 세척하고 원하는 시간 동안 계란을 인큐베이터에 넣습니다. 배아의 생존율은 전기천공법 후 2-3일 후 약 90%이며 전기천공법 후 12일 후에는 최대 50%까지 감소합니다.

뒷뇌를 평평하게 준비하려면 배아를 조심스럽게 해부하여 주변의 막과 혈관에서 분리하십시오. PBS가 들어 있는 작은 실리콘 코팅된 페트리 접시에 배아가 배아가 배쪽을 향하도록 배아를 놓습니다. 텅스텐 핀을 사용하여 접시에 부착하십시오.

그런 다음 날카로운 유리 모세관을 사용합니다. 날카로운 핀셋과 마이크로 가위로 뒷다리 브레닌 지붕 플레이트에 등쪽 슬릿을 만듭니다. 머리의 윗부분을 잡고 뒷뇌 조직을 매우 조심스럽게 당겨 주부에서 유아용으로 당깁니다.

뒷뇌를 분리한 후 남아 있는 복부 조직을 제거합니다. 뒷뇌를 4% 파라폼 알데히드 또는 PFA 용액에 실온에서 1-2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBT로 세척하여 PFA를 제거합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 면역형광 제제를 따른 후, 뒷뇌를 등쪽을 향하도록 유리 슬라이드에 놓습니다. 뒷뇌에 형광 장착 매체를 추가하고 유리 모세관 또는 텅스텐 바늘을 사용하여 슬라이드의 뒷뇌를 평평하게 만듭니다. 커버 슬립으로 조직이 짜지는 것을 방지하기 위해 각 모서리에 소량의 그리스를 추가하십시오.

접착을 위해 기포가 생기지 않도록 뒷뇌 위에 커버 슬립을 조심스럽게 놓습니다. 커버 유리 가장자리에 매니큐어를 바릅니다. 뇌간의 냉동 절편은 E 6.5 이후의 모든 발달 단계에서 수행할 수 있습니다.

그들은 매우 두꺼워지는 편평하게 장착된 배아에서 축삭을 시각화하는 것이 어렵기 때문에 선호되는 방법이어야 합니다. 더욱이, 시냅스를 입증하기 위해서는 조직의 절편과 현미경으로 볼 수 있는 고배율 보기가 필요합니다. 냉동 절편을 위한 샘플을 준비하려면 배아를 해부하고 뇌를 둘러싼 모든 조직을 제거합니다.

PBS로 헹굽니다. 그런 다음 마이크로 가위와 날카로운 핀셋을 사용하여 수질의 새끼 영역에서 배아를 자릅니다. 소뇌와 중뇌 사이를 넓게 절개하고 뇌간 전체를 제거합니다.

조직에는 수질과 소뇌가 포함되어야 합니다. 다음 예에서, 검사 뒷뇌에서 inter neurons의 DA one subgroup에서 발현되는 enhancer element는 Cree recombinase의 상류에 복제되고 Cree 의존성 세포질 GFP 리포터 플라스미드로 coelectropoified되었습니다. E 4.5 단계의 플랫 마운트 준비는 두 개의 반대쪽 상승 축삭 투영 패턴을 나타내어 발달 후반 단계에서 DA 1 inter 뉴런의 축삭 투영을 매핑합니다.

pre-con 무조건적인 GFP 리포터 카세트는 A TOH 1 creen enhancer 및 transpose 벡터와 함께 두 개의 피기백 암 사이에 복제되었습니다. 이 전략을 사용하여 Electroporated C precon conditional MG FP가 병아리 염색체에 통합되고 결과적으로 정지 카세트가 D one 뉴런에서만 제거되어 GFP의 발현을 연장할 수 있습니다. DA에서는 하나의 세포가 있습니다.

GFP의 mesylated 모양은 세포질에서 묽게 되는 것이 아니라 축삭 막을 따라서 국소화되다 그래야 그것을 막에 밧줄로 묶습니다. E 13.5에서 수집되고 시상 단면에서 분석된 뇌 줄기에서. DA 1 축삭돌기는 소뇌에 축적되어 ZI 1 양성 세포로 표시되는 외부 과립층 또는 EGL로 확장되는 것으로 밝혀졌습니다.

소뇌에 있는 D one 축삭돌기의 시냅스 표적도 분석했습니다. E 2.75 배아를 시냅스 소포 단백질 2 리포터 플라스미드와 H 1 크리어 인핸서 및 피기백 전치와 함께 전기천공시켰다. 이 방법은 presynaptic DA one 축삭 말단에서 GFP 리포터의 발현을 가능하게 합니다.

소뇌는 E 13.5에서 절편화되었으며 일반 시냅스 전 마커 시냅스 타만(synaptic taman)과 비키니 층을 표시하는 칼빈딘(calbindin)으로 염색되었습니다. 이 단면의 고배율 보기는 비키니 층을 포함한 여러 소뇌 영역에서 SV 2개의 GFP 양성 시냅스 소포를 보여줍니다. 이 결과는 소뇌의 DA 1 뒷뇌 뇌 간 뉴런의 시냅스 연결을 보여줍니다.

이 비디오를 시청한 후, 신경 세포의 하위 집합을 구체적으로 라벨링하기 위해 배아 2일차 포인트 75에서 DNA를 조류 Hein으로 전기 조작하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 절차를 통해 여러 발달 단계에서 표지된 신경 세포의 축삭 돌기와 시냅스 연결을 추적할 수 있습니다.