Name: 메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 ( Schistocerca 아메리카나) 강한 회로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 배우세요 메뚜기(Schistocerca americana) 후각 경로에서 다중 단위 기록 방법을 사용하여 신경 활동을 특성화하는 기법입니다. 이 방법은 무척추동물 후각 처리 중심에서 앙상블 신경 활동을 연구하는 데 활용됩니다.

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관대 시작 - 자금 생명 공학과에서 워싱턴 대학, 시스템 신경 과학 교부금, 해군 연구 교부금 Office 용 맥도넬 센터 (권한 부여 # : N000141210089) BR에 저자는이 일을 자금에 대해 다음을 감사드립니다

1. 냄새 준비 및 배달 <ol><li> 원하는 농도 수준을 달성하기 위해 볼륨으로 미네랄 오일에서 냄새 솔루션을 희석. 60 ML 유리 병에 미네랄 오일과 odorant의 20 ML의 혼합물을 저장합니다. 입구와 출구 라인을 제공하기 위해, 고무 마개 (게이지 19), 상단에서 하단의 하나는 다른에이 주사기 바늘을 삽입합니다. 이 고무 마개로 유리 병을 봉쇄하고 유입 라인 (그림 1A)에 필터 활성탄을 설계 사용자 정의를 첨부합니다. </li><li> 탄소 필터는 두 6 ML의 주사기를 사용하여 이루어집니다. 반으로 주사기를 잘라 플런저 끝을 폐기합니다. 열 수축 튜브를 사용하여 같이 연결하기 전에 면화, 활성탄과 남은 조각을 각각 입력합니다. </li><li> 안테나를 통해 일정한 공기 흐름을 제공 플라스틱 튜브 (Nalgene FEP 관, ID 5.8 mm) (그림 1B에 냄새 병 (폴리에틸렌 관, ID 0.86 mm를 사용하여)의 출구 선을 연결 </st롱&gt;). </li><li> 메뚜기 안테나 몇 cm에 배치 플라스틱 튜브를 사용하여 메뚜기를 향해, ​​직접 탄소 필터링, dehumidified 항공 (흐름 속도, 0.75 L / 분 캐리어 가스). </li><li> 악취 자극은 병의 냄새 솔루션 위의 정적 헤드 스페이스의 일정한 볼륨을 (0.1 L / 분) 치환. 이것은 피코 - 펌프를 (WPI, PV-820)를 사용하여 병에 dehumidified 공기의 동일한 양을 주입에 의해 달성된다. 냄새 병에서 증기는 공기 튜브 (그림 1B)로 출구 라인을 통해 이동합니다. </li><li> ~ 10cm 메뚜기 안테나 뒤에 진공 유입 경로를 배치하여 제공 냄새 증기를 제거합니다. </li></ol> 2. 싱글 Sensillum 기록에 대한 메뚜기 안테나 준비 <ol><li> 완전 성숙한 날개와 섹스 중의 젊은 성인 메뚜기을 선택할 수 있지만 이전에 결합 단계에 붐비는 식민지에서. 메뚜기을 억제하려면 먼저 해당 다리를 절단. 조직 접착제 (Vetbond, 3M)로 절단 사이트를 밀봉합니다. 보안 t(그림 2A)는 가슴 주위를 장식 전기 테이프의 작은 조각을 사용하여 사용자 정의 설계 챔버에 그는 메뚜기. </li><li> 해부 현미경에서 안테나 게재 위치에 대한 왁스 플랫폼 (그림 2A)에 얕은 홈을합니다. 홈에 안테나를 배치하고 안테나의 두 끝 (그림 2B, electrowaxer이 왁스를 용해하는 데 사용됩니다)에서 바틱 왁스를 사용하여 안정. </li><li> 가슴 (~ 1cm 거리에 머리에서)에 접지 전극 (chlorided 실버 와이어를) 삽입합니다. 모두 인감 절개 사이트에 바틱 왁스를 사용하여 장소 (그림 2A)의 접지 와이어를 개최. </li></ol> 3. 싱글 Sensillum 기록은 강한 수용체 뉴런 (ORNs)에서 냄새 evoked 응답을 모니터링 할 <ol><li> 진동 절연 테이블 (TMC) (그림 3A)에 stereomicroscope (Leica M205C)에서 안정화 메뚜기 안테나를 배치합니다. 녹음 sensillum의 기본은 명확 있는지 확인통증이 표시 (그림 3B). </li><li> 붕규산 유리 모세관 튜브를 (OD 1.2 mm, ID 0.69 mm)를 사용하여 유리 전극을 (메뚜기와 생리 9, 팁 직경 1-3 μm을 가득 MΩ 임피던스 3-10) 조작하는 micropipette 풀러 (셔터 P-1000)를 사용합니다. </li><li> 동력 micromanipulator (셔터 MP-285)에 연결되어 micropipette 홀더에 유리 전극을 배치합니다. 부드럽게 sensillum (그림 3B)의베이스에 전극을 삽입합니다. 각 sensillum은 메뚜기 10 3-50 ORNs를 포함 할 수 있습니다. </li><li> AC 증폭기 (잔디 P-55)를 사용하여 신호를 (10,000 회) 확대. 0.3 사이의 신호 필터 - 10.0 kHz로하고 데이터 수집 시스템을 사용하여 15 kHz에서 샘플링 속도 (그림 3D) (LabView, PCI-미오-16E-4 DAQ 카드, 내쇼날 인스트루먼트)에 취득. </li></ol> 4. Antennal 엽과 버섯 바디 레코딩을위한 메뚜기 분해 절차 <ol><li> restraini에 따라NG 절차는 섹션 2.1에 설명되어 있습니다. 그림 4A 및 B에 도시 된 바와 같이 맞춤 디자인 실에있는 메뚜기를 배치합니다. </li><li> 동안 생리 perfuse 및 분해 절차 후 메뚜기의 머리 주위에 왁스 컵을 구축합니다. 왁스 컵은 입 부분 위에 시작하고 그림 4C 같이 두 안테나 사이의 지역을 포함한 화합물 눈을 넘어 확장해야합니다. </li><li> 안테나는 왁스 컵을 통과 할 수 있도록하려면, 플라스틱 (폴리에틸렌) 튜브를 (길이 5mm, ID 0.86 mm)을 사용하여 양쪽에 작은 터널을 만들 수 있습니다. 플라스틱 튜브는 왁스 컵을 통해 슬라이드 수 있는지 확인하십시오. 후자는 단단히 플라스틱 튜브 주위에 래핑 고무 가스켓을 사용하여 달성된다하지만 왁스 컵 (그림 4C)에 부착된다. </li><li> 에폭시 수지를 사용 플라스틱 튜브의 바닥 끝으로 안테나의 기반을 첨부합니다. 이 단계는 안테나가도 주변 이후에 개최되는 보장표피가 제거됩니다. </li><li> 이 시점부터 생리 식염수 9로 가득 왁스 컵세요. 두 안테나 (anteroposterior 축 정렬 직사각형의 긴 쪽) 사이에있는 중앙 직사각형 영역을 제거하여 시작합니다. 그 후, 안테나 (그림 4D)의 기지에있는 화합물 눈과 큐티클을 방해하지 않으면 서 주변 지역의 표피를 제거합니다. </li><li> 고급 집게를 사용 부드럽게 공기 주머니와 뇌를 둘러싼 지방의 시체를 제거합니다. 이 단계의 끝에서 메뚜기 뇌는 명확하게 (그림 4D) 볼 수 있어야합니다. 후각 정보 (빛 노란색 착색 포함) 처리하는 뇌 영역이 두 안테나 사이에 자리 잡고 있습니다되는지 확인합니다. </li><li> 메뚜기에 내장은 뇌 아래에서 몸의 길이를 따라 실행됩니다. 잠재적 준비를 불안정에서 창자의 움직임을 방지하기 위해 부드럽게 foregut을 뽑아 고급 가위를 사용하여 잘라. 복부에 작은 절개를합니다 단지항문 위 굵은 집게로 hindgut을 당겨 내장을 제거합니다. 생리 누출을 방지하기 위해, 봉합 스레드와 절개 사이트에 바로 앞쪽에 복부를 묶어. </li><li> 그림 4D와 같이 전기 생리학 동안 뇌를 제고 11을 안정화하는 왁스의 벌금 층으로 코팅 얇은 철사로 만든 작은 플랫폼을 사용합니다. </li><li> 곤충 뇌는 사전 실험 제거 할 필요가 얇은 절연 피복이 적용됩니다. desheath으로는 뇌가, 부드럽게 잘 포셉에게 9를 사용 뇌의 표면에 효소의 작은 금액 (0.3-0.4 MG 프로테아제, 시그마 알드리치) 확산. 효소 응용 프로그램의 ~ 5-10 초 후, 식염수에 철저하게 뇌를 씻어. 초 미세 집게를 사용하여 매우 부드럽게 찔러과 피복을 뽑아 이후가 기록 위치 (AL 및 메가바이트, 그림 4E, F 참조)를 통해 엽니 다 찢어. </li></ol> 5. 멀티 단위 Antennal 엽의 녹음과버섯 바디 <ol><li> 진동 절연 테이블에 배치 붐 스탠드에서 일시 중지 stereomicroscope에서 메뚜기 준비 (그림 5A)를 배치합니다. </li><li> 실험을하는 동안 일정한 생리 재관류 율을 (0.04 L / 시간에 대한) 유지합니다. 접지 전극으로 염분이 가득한 왁스 컵에 익숙해 chlorided은 와이어를 사용하십시오. </li><li> PN 녹음를 들어, 16 채널 실리콘 프로브를 (NeuroNexus 기술, 항목 # A2x2-tet-3mm-150-150-121 - A16, 그림 5B)을 사용합니다. 전에 각각의 실험에, 200-300 kΩ 범위에서 임피던스를 달성하기위한 금 전극을 전기 도금. 전기 도금을위한 그림 7에 표시된 회로를 사용합니다. </li><li> 가까운 antennal 엽의 표면에 전극을 배치하고 부드럽게 수동 micromanipulator (WPI, M3301R)을 (그림 5D)를 사용하여 조직에 삽입. </li><li> ~ 10 μm 단계에서 전극을 부활 시켰습니다. 각 단계 2-3 분을 기다려야하고 취득을 평가D 신호 품질. 이상적인 기록 사이트에서, 세포 신호는 여러 기록 채널에 의해 픽업되며, 높은 신호 대 잡음 비율 (SNR&gt; 3-5 번 잡음 SDS)를해야합니다. </li><li> KC 녹음를 들어, 주문 제작 트위스트 와이어 tetrode (; 제 6 항에 제시된 단계별 제작 과정 그림 5C)을 사용합니다. 단계 5.3에서 논의 이러한 전극을 전기 도금. KC somata이 메가바이트 8 얕은 층으로 제한되면서 MB (그림 5E 호야)의 표면에 tetrode를 놓습니다. </li><li> 간략하게 그림 5A와 같이 PN과 KC 녹음 모두 동일한 메뚜기 준비에서 동시에 만들 수 있습니다. </li><li> 전극의 안정화를 허용하도록 기록 위치를 찾는 후 최소 15 분 동안 기다리십시오. </li><li> 0.3-6 kHz에서 사이 필터를 15 kHz에서에서 모든 세포 신호를 취득하고, 16 채널 AC 증폭기 (생물 전자 숍, 칼 테크, 패서 디나, CA)를 사용하여 (10,000 회) 증폭 (그림 6A, B). </li></ol> 6. KC 레코딩에 대한 일그러진 와이어 전극을 만들려면 절차 <ol><li> KC 녹음을위한 다중 유닛 전극을 설계, 절연 니켈 크롬 와이어 (RO800, 0.0005 &quot;필라멘트) 8을 사용합니다. </li><li> 팔 전극이 원하는 경우 다음 골판지 4 회의 10-15센티미터 긴 부분 주위에 와이어를 감아. 판지의 끝은 전선을 절단에서 가장자리를 방지하기 위해 플라스틱 튜브으로 덮여 할 수 있습니다. 포장하는 동안, 작은 여유가 있는지 확인하지만, 와이어의 긴장 늦추지 있지 않도록하십시오. 쉽게 끊어으로주의 깊게 와이어를 처리합니다. </li><li> 판지의 상단에있는 전선 뭉치 함께하고 함께 개최 할 테이프의 조각 (시간 테이프, T-534-RP)을 사용합니다. 다른 쪽 끝에서 가닥을 자른다. 절단 끝뿐만 아니라 테이프의 다른 부분을 사용하여에서 와이어 가닥 및 그룹의 와이어를 제거합니다. </li><li> 털 (~ 72 레브 / 3 분 함께 titer 판 흔드는 (열 과학, 모델 4625Q)를 바람 사용한 트위스트 와이어를 형성하는 분). 테이프 가닥의 아래쪽은 titer 판 로터에 이어 할 수 있으며, 상단은 붐 스탠드로 클립 할 수 있습니다. 구불 구불 한 동안 와이어 아직 긴장하지, 작은 여유가 있어야합니다. </li><li> 함께 개별 가닥를 심어 하나의 와이어를 형성 할 수있는 열 총 (Weller 6966C)와 함께 절연 제를 용해. 와이어의 길이에 걸쳐 3-4 속도가 느린 패스 (3-4 초 각각) 가열 함께 가닥을 융합하기에 충분해야합니다. 그런 다음 하단에서 와이어를 공개하고 휴식 할 수 있습니다. 테이프를 제거 할 수있는 끝 근처의 전선을 잘라. </li><li> 5~6센티미터 긴 유리 모세관 튜브 (OD 1.0 mm, ID 0.58 mm)를 통해 와이어의 한쪽 끝을 삽입합니다. 고급 핀셋을 사용하여 한쪽 끝에서 트위스트 와이어를 분리 애무 해줘 매우 간단히 불을 사용하여 끝을 횃불로 코팅을 제거합니다. 이 단계를주의 깊게 수행해야하며 너무 오래 불에 와이어를 노출하면 가닥이 녹기와 얽힌하게됩니다. </li><li> 부드럽게 골조 끝에 8 가닥을 분리8 핀 IC 소켓에 별도로 차 솔더는 각 스트랜드. 코트 에폭시와 IC 소켓의 상단은 가닥과 장소에 모세관 유리를 개최합니다. 또한 장소 (그림 5C)에 와이어를 개최 할 모세관의 다른 쪽 끝에서 에폭시의 작은 방울을 배치합니다. </li><li> 마지막으로, 모세관 팁에서 0.5 cm에 대한 탄화 가위로 45도 각도로 와이어의 끝을 잘라. </li></ol>

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대부분의 감각 자극이 뉴런의 ensembles 분산 된 조합 반응을 그대로 보여주고 있습니다. 따라서, 다중 신경 활동의 동시 모니터링 정보가 뇌의 신경 회로에 의해 표현 및 처리 방법에 자극 - 특정 이해 할 필요가 있습니다. 여기, 우리는 곤충 후각 경로를 따라 처음 세 개의 처리 센터에서 냄새 evoked 응답을 특성화하기 위해 세포 다중 단위 기록 기술을 보여주고 있습니다. 우리는 여기서 제시 기법 후각 코딩에 대한 이전 연구의 숫자에 사용하고 있으며이 분야 3,6,13-17에서 표준 연습되고 있습니다 점에 유의하십시오. 기술을 결합하면 하나가 invertebrate 후각 시스템의 설계 및 컴퓨팅 원리를 조사에 시스템의 접근 방식을 개발할 수 있습니다 여기에 소개했다. 여기, 우리는 이러한 approa을 개척 질 로렌, 마크 Stopfer, 그들의 동료 2,3,8,9,13,16,18-21에 의해 만들어진 독창적 인 기여를 인식해야합니다ches는 후각 코드의 몇 가지 기본 원칙을 공...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 전기 생리학 장비 </td></tr><tr><td> AC 증폭기 </td><td> GRASS </td><td> 모델 P55 </td><td> 단일 sensillum 녹음을위한 </td></tr><tr><td> 오디오 모니터 (모델 3300) </td><td> AM 시스템 </td><td> 940000 </td><td></td></tr><tr><td> 16 채널 사전 증폭기 및 증폭기를 주문 제작 </td><td> 칼. 기술. 생물 전자 상점 </td><td></td><td> AL 및 메가바이트 레코딩을위한 </td></tr><tr><td> 데이터 수집 장치 </td><td> 내쇼날 인스트루먼트 </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 조명 </td><td> WPI </td><td> SI-72-8 </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 광원 115 V </td><td> WPI </td><td> 노바 </td><td></td></tr><tr><td> 수동 micromanipulator </td><td> WPI </td><td> M3301R </td><td> 메뚜기 뇌 레코딩을위한 </td></tr><tr><td> 붐 스탠드에 Stereomicroscope1 </td><td> Leica </td><td> M80 </td><td> 메뚜기 뇌 레코딩을위한 </td></tr><tr><td> Stereomicroscope2 </td><td> Leica </td><td> M205C </td><td> 단일 sensillum 녹음을위한 </td></tr><tr><td> 진동 절연 표 </td><td> TMC </td><td> 63-500 시리즈 </td><td></td></tr><tr><td> 동력 micromanipulator </td><td> 셔터 악기 </td><td> MP285 / T </td><td></td></tr><tr><td> 오실로스코프 </td><td> 텍트로닉스 </td><td> TD2014B </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 전극 / 건설 도구 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 16 채널 전극 </td><td> NeuroNexus </td><td> A2x2-tet-3mm - 150-121 </td><td> antennal 엽 녹음을위한 </td></tr><tr><td> 필라멘트, ID 0.69 mm로 붕규산 모세관 튜브 </td><td> 셔터 악기 </td><td> BF120-69-10 </td><td> 유리 전극을 만들기위한 </td></tr><tr><td> Micropipette 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 함수 발생기 </td><td> 멀티 미터 창고 </td><td> SG1639A </td><td> 금 도금 전극 </td></tr><tr><td> 골드 도금 용액 (시안화물이 비) </td><td> SIFCO 산업 </td><td> NC SPS 5355 </td><td></td></tr><tr><td> 임피던스 시험기 </td><td> BAK 전자 주식회사 </td><td> 노출-2 </td><td> 금 도금 전극 </td></tr><tr><td> 로터리 스위치 </td><td> Electroswitch </td><td> C7D0123N </td><td> 금 PL에 대한ating 전극 </td></tr><tr><td> 펄스 아이솔레이터 </td><td> WPI </td><td> A365 </td><td> 금 도금 전극 </td></tr><tr><td> Q 시리즈 전극 홀더 </td><td> 워너 악기 </td><td> 64-1091 </td><td></td></tr><tr><td> 실버 와이어 0.010 &quot;직경 </td><td> AM 시스템 </td><td> 782500 </td><td> 접지 전극 </td></tr><tr><td> 8 핀 DIP IC 소켓 </td><td> Digikey </td><td> ED90032-ND </td><td></td></tr><tr><td> 필라멘트, ID 0.58 mm로 붕규산 모세관 튜브 </td><td> 워너 악기 </td><td> 64-0787 </td><td> 트위스트 와이어 tetrode 건설 </td></tr><tr><td> 열 총 </td><td> Weller </td><td> 6966C </td><td></td></tr><tr><td> Rediohm-800 와이어 </td><td> Kanthal 정밀 기술 </td><td> PF002005 </td><td></td></tr><tr><td> Titer 판 흔드는 </td><td> 열과학적인 </td><td> 4625Q </td><td> 왜곡 와이어 </td></tr><tr><td> 카바이드 가위, 4.5 &quot; </td><td> 생명 연구 Instr </td><td> 25-1000 </td><td> 트위스트 tetrode의 전선을 절단에 대한 </td></tr><tr><td> 좋은 점 핀셋 </td><td> HECO </td><td> 91 EF5-SA </td><td> 분리 하는거 tetrode 와이어에 대한 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 냄새 배송 </td></tr><tr><td> 6 ML의 주사기 </td><td> 켄달 </td><td> 1180600777 </td><td> 사용자 정의 설계 활성탄 필터에 대한 </td></tr><tr><td> 브라운 냄새 병 </td><td> 어부 </td><td> 08-912-165 </td><td></td></tr><tr><td> 숯 </td><td> <a href="http://BuyActivatedCharcoal.com" target="_blank">BuyActivatedCharcoal.com</a> </td><td> GAC-48C </td><td></td></tr><tr><td> 건조제 </td><td> Drierite </td><td> 23,005 </td><td></td></tr><tr><td> Drierite 가스 병을 건조 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 09-204 </td><td></td></tr><tr><td> 튜브를 수축 가열 </td><td> 3M </td><td> EPS-200 </td><td> 냄새 필터 준비 </td></tr><tr><td> 피하 주사기 바늘 알루미늄 허브, 게이지 19 </td><td> 켄달 </td><td> 8881-200136 </td><td> 냄새 병 입구와 출구 라인을 제공 </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> Mallinckrodt 화학 물질 </td><td> 6357-04 </td><td> 악취 희석 용 </td></tr><tr><td> Nalgene 플라스틱 튜브, 890 FEP </td><td> 열 과학 </td><td> 8050-0310 </td><td> 캐리어 가스 배달 </td></tr><tr><td> 공압 picopump </td><td> WPI </td><td> 시스 - pv820 </td><td> 악취 전송 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 튜브 ID 0.86 mm </td><td> Intramedic </td><td> 427421 </td><td> 냄새 병 콘센트 connecti에 대한기능 및 생리 풍부 관 </td></tr><tr><td> 스토퍼 </td><td> 랩 순수 </td><td> 97,041 </td><td> 냄새 병을 씰링을위한 </td></tr><tr><td> 시간 테이프 </td><td> PDC </td><td> T-534-RP </td><td></td></tr><tr><td> 배관 luer </td><td> 콜 - Parmer </td><td> 30600-66 </td><td></td></tr><tr><td> 진공관 </td><td> McMaster - 카 </td><td> 5488K66 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 준비 / 해부 </td></tr><tr><td> 100 X 15mm 페트리 접시 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 89000-304 </td><td></td></tr><tr><td> 18 AWG 구리 좌초 와이어 </td><td> 라플란드 Kabel </td><td> 4510013 </td><td> 와이어 절연은 고무 가스켓으로 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 22 AWG 좌초 된 후크 와이어 </td><td> AlphaWire </td><td> 1551 </td><td> 뇌플랫폼 </td></tr><tr><td> 바틱과 왁스 </td><td> 자카드 </td><td> 7946000 </td><td></td></tr><tr><td> 치과 주변 왁스 </td><td> 헨리 - Schein 치과 </td><td> 6652151 </td><td></td></tr><tr><td> Electrowaxer </td><td> Almore 국제 </td><td> 66,000 </td><td></td></tr><tr><td> 에폭시, 5 분 </td><td> Permatex </td><td> 84,101 </td><td></td></tr><tr><td> 피하 주사기 바늘 알루미늄 허브 </td><td> 켄달 </td><td> 8881-200136 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomyces griseus의 프로테아제 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P5147 </td><td> 메뚜기 뇌를 desheathing에 대한 </td></tr><tr><td> 봉합 나사 비 무균 </td><td> 어부 </td><td> NC9087024 </td><td> 내장 제거 후 복부를 매는위한 </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td> 오전 실링에 대한putation 사이트 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 1 포셉 (거친) </td><td> WPI </td><td> 500335 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 티타늄 포셉 (고급) </td><td> WPI </td><td> 14,096 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5SF 포셉 (수퍼 벌금) </td><td> WPI </td><td> 500085 </td><td> 메뚜기 뇌를 desheathing </td></tr><tr><td> 10cm는 가위를 해부 </td><td> WPI </td><td> 14,393 </td><td> 다리와 날개를 제거 </td></tr><tr><td> Vannas 가위 (고급) </td><td> WPI </td><td> 500086 </td><td> foregut 절단, 큐티클을 제거하기위한 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 염분 풍부 </td></tr><tr><td> 확장 속도 흐름 조절기로 설정 </td><td> 무어 의료 </td><td> 69,136 </td><td> 생리 흐름을 조절하기위한 </td></tr><tr><td> IV 관리는로 설​​정Y 분사 사이트 </td><td> 무어 의료 </td><td> 73,190 </td><td> 생리 흐름을 조절하기위한 </td></tr></tbody></table>

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

후각 신호의 감지 및 해석은 많은 생물의 생존을위한 중요합니다. 놀라운 phyla에 걸쳐 종 화학 물질 감지에 대한 생물학적 접근 방식은 진화의 시간 1 위에 최적화 된 것을 놀랍도록 닮아 후각 시스템을 제안하고 있습니다. 곤충 후각 시스템에서 odorants는 액션 전위의 기차에 화학 자극을 변환 안테나에 후각 수용체 뉴런 (ORN)에 의해 transduced 있습니다. ORNs에서 감각 입력은 다음 antennal 엽 (; 척추 후각 망울에 유사한 구조 AL)에 전달됩니다. 2,3, AL에서 악취에 대한 신경 표현은 주요 뉴런 (또한 프로젝션 뉴런라고 PNs)의 ensembles에 걸쳐 분산 spatiotemporal 사격 패턴의 형태를 취할. AL 출력은 이후 하류 버섯 몸 (MB), 후각 메모리와 4,5 학습과 관련된 구조 캐년 전지 (관세청)에 의해 처리됩니다. 그녀의전자, 우리는 이러한 후각 회로에 냄새 evoked 신경 반응을 모니터링 할 수 electrophysiological 레코딩 기술을 제시한다. 첫째, 우리는 ORNs 6,7의 인구 수준에서 냄새 evoked 응답을 공부 한 sensillum 기록 방법을 제시한다. 우리는 extracellularly ORN 응답을 모니터링하는 전극 등의 생리 가득 날카롭게 유리 피펫의 사용에 대해 설명합니다. 다음, 우리는 extracellularly 상업 16 채널 전극 3을 사용 PN 응답을 모니터링하는 방법을 제시한다. 주문 제작 8 채널 트위스트 와이어 tetrode를 사용하여 유사한 접근 방식은 케니 언 셀 녹음 8 증명하고 있습니다. 우리는 우리의 실험 설정 및 이러한 기술의 각 현재 대표적인 기록 추적에 대한 자세한 내용을 제공합니다.

두 개의 서로 다른 알코올에 하나의 ORN의 냄새 evoked 응답은 그림 3D에 표시됩니다. 녹음 위치에 따라 (sensilla 종류, 전극의 배치) 멀티 유닛 녹음 달성 할 수 있습니다. AL 녹화에서 원시 세포 파형은 그림 6A에 표시됩니다. 액션 잠재력 또는 다른 PNs에서 발생하는 다양한 진폭의 스파이크이 전압 추적에서 관찰 할 수 있습니다. 메뚜기 antennal 엽은 흥분성의 프로젝션 뉴런과 억제 뉴런 지역이 있지만, 오직 PNs는 extracellularly 세 감지 할 수 나트륨 스파이크를 생성합니다. 이 관찰은 여기에서 제시 한 여러 단위 기록 방법을 선택적으로이를 메뚜기에게 후각 코딩을 공부하기위한 매력적인 invertebrate 모델을 만드는 antennal 엽 회로의 출력을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. <p class="jove_conten...

우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

이 절차의 전반적인 목표는 곤충 후각 경로의 처음 세 신호 처리 센터에서 냄새 제거 다중 단위 신경 활동을 기록하는 것입니다. 이것은 먼저 맞춤형으로 설계된 챔버에 메뚜기를 구속하고 전기 생리학적 기록을 위해 더듬이 중 하나를 안정화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 유리 마이크로 전극을 제작하고 태양 바닥에 삽입하여 냄새가 유발하는 반응을 모니터링하는 것입니다.다음으로 메뚜기 뇌의 신경 활동을 기록합니다. 후각 감각 뉴런의 입력을 처리하는 신경 조직을 노출시키기 위해 다단계 해부 절차가 이어집니다. 마지막 단계는 메뚜기와 안테나 엽 및 버섯 몸체의 앙상블 신경 활동을 기록하기 위해 다중 전극 어레이를 적절하게 배치하는 것입니다.궁극적으로, 여기에서 입증된 세포 외 기록 방법은 곤충 후각 경로를 따라 처음 세 개의 처리 센터에서 냄새 유발 반응을 특성화하는 데 사용됩니다. 이 방법은 비교적 단순한 무척추 동물의 후각 시스템에서 냄새가 유발하는 신경 반응을 특성화하는 데 사용되었지만, 다른 신경 시스템의 앙상블 활동을 조사하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 전극 배치 및 일부 해부 단계와 같은 이 절차의 일부 주요 측면을 배우기가 매우 어렵기 때문에 매우 중요합니다.또한 방법은 대부분 정성적 이며 시간이 지남에 따라 다른 실험실에서 다르게 완벽하게 만들었습니다. 이 절차를 시작하려면 날개가 완전히 자란 암수의 어린 성인 메뚜기를 선택하되 밀집된 군체에서 짝짓기 단계 이전에 선택하십시오. 다음으로, 메뚜기의 다리를 절단하여 메뚜기를 제지합니다.절단 부위를 조직 접착제로 밀봉합니다. 그런 다음 메뚜기를 흉부 주위에 드리워진 작은 전기 테이프 조각으로 맞춤 설계된 챔버에 고정합니다. 해부 현미경 아래에서 안테나 배치를 위해 왁스 플랫폼에 얕은 홈을 만듭니다.안테나를 홈에 놓고 안테나의 양쪽 끝에 있는 바티 왁스를 사용하여 고정합니다. 그런 다음 흉부에 접지 전극을 삽입하십시오. 바틱 왁스를 사용하여 절개 부위를 밀봉하고 접지선을 제자리에 고정합니다.다음으로, 안정화된 메뚜기 안테나를 진동 차단 테이블의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 냄새 병의 출구 라인을 냄새 전달 튜브에 연결합니다. 안테나에서 몇 센티미터 이내에 냄새 전달 튜브를 배치하십시오.전달된 냄새 증기는 메뚜기 안테나 뒤에 약 10cm 떨어진 진공 깔때기에 의해 제거됩니다.그런 다음 마이크로 피펫 극성이 있는 burs 규산 유리 모세관을 사용하여 유리 전극을 제작하고 유리 전극에 메뚜기 식염수를 채웁니다. 다음으로, 유리 전극을 전동 마이크로 매니퓰레이터에 부착된 마이크로 피펫 홀더에 넣습니다. 녹음 syn의 바닥이 현미경으로 명확하게 보이는지 확인하십시오.전극을 syn의 바닥에 부드럽게 삽입합니다. 그 후 신호를 10, 000회 증폭합니다. AC 사용 amp리퍼.0.3Hz에서 10.0kHz 사이의 신호를 필터링하고 15kHz 샘플링 레이트로 수집합니다. 데이터 수집 시스템을 사용하여 전극이 적절하게 배치되면 자발적인 신경 활동을 감지할 수 있습니다. 자극 유발 반응은 냄새 전달 튜브를 통해 냄새 펄스를 전달하여 모니터링할 수 있습니다.안테나 가까이에 배치하고 세포 외 활동의 변화를 추적하고, 앞서 설명한 바와 같이 억제 절차를 따랐습니다. 맞춤형으로 설계된 챔버에 메뚜기를 배치합니다. 메뚜기 머리 주위에 왁스 컵을 만들어 해부 과정을 시작합니다.메뚜기 머리의 양쪽에 더듬이 높이까지 도달하는 두 개의 밀랍 탑을 건설하십시오. 그런 다음 고무 개스킷에 단단히 끼워진 작은 폴리에틸렌 튜브 조각을 통해 각 안테나를 삽입합니다. 그런 다음 개스킷을 왁스 타워에 부착하여 플라스틱 튜브가 안테나 바닥을 향하거나 안테나에서 자유롭게 미끄러질 수 있도록 하면서 안테나가 움직이는 것을 방지합니다.그런 다음 현미경으로 메뚜기 머리 주위에 왁스 컵을 만들어 해부 절차 중과 후에 식염수 관류를 허용합니다. 왁스 컵은 입 부분 바로 위에서 시작하여 왁스 타워를 둘러싸고 겹눈 너머로 확장되어야 합니다. 왁스 컵이 완전히 구성되면 에폭시 수지를 사용하여 안테나의 바닥을 플라스틱 튜브의 하단에 부착합니다.이렇게 하면 주변 큐티클이 제거된 후에도 안테나가 제자리에 고정됩니다. 이 시점부터 왁스 컵에 식염수를 채우십시오. 이제 둘 사이의 중앙 사각형 영역을 제거합니다.안테나. 그 후, 더듬이 기저부의 겹눈이나 큐티클을 방해하지 않고 주변 부위의 큐티클을 제거합니다. 가는 집게를 사용하여 뇌를 둘러싸고 있는 공기 주머니와 지방체를 부드럽게 제거합니다.이제 메뚜기 뇌를 명확하게 볼 수 있습니다. 후각 정보를 처리하는 뇌 영역은 둘 사이에 있습니다. 더듬이가 내장을 부드럽게 잡아당겨 가는 가위로 자릅니다.그런 다음 날개를 제거하고 직장 바로 위의 복부를 작게 절개합니다. 뒷다리 내장을 굵은 집게로 당겨 내장을 제거합니다. 이 단계는 장의 움직임이 제제를 불안정하게 만들지 않도록 합니다.식염수 누출을 방지합니다. 절개 부위 바로 앞쪽의 복부를 봉합사로 묶습니다. 다음으로, 미세한 왁스 층으로 코팅된 얇은 철사 고리로 만든 작은 플랫폼을 사용하여 뇌를 들어 올리고 전기 생리학을 위해 안정화합니다.뇌를 기록하는 것은 반투명 덮개로 보호되며, 이는 기록하기 전에 제거해야 합니다. 칼집을 약화시키려면 왁스 컵을 부분적으로 배수하고 소량의 프로테아제를 뇌 표면에 조심스럽게 펴 바릅니다. 약 5-10초 동안 효소를 바른 후 식염수로 뇌를 철저히 헹굽니다.그런 다음 매우 미세한 집게로 덮개를 아주 부드럽게 꼬집고 당겨 찢어 열고 녹음 부위를 노출시킵니다. 이 절차에서는 메뚜기 제제를 진동 차단 테이블의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 시간당 약 40ml의 일정한 식염수 관류 속도를 유지하십시오.실험 전반에 걸쳐 식염수로 채워진 왁스 컵에 담근 염화은 와이어를 접지 전극으로 사용합니다. 단일 센서 기록 실험과 유사한 냄새 전달 설정을 준비합니다. 실험에 앞서, 200 - 300 킬로 범위의 임피던스를 달성하기 위해 전극을 금으로 전기도금합니다.주요 뉴런 기록을 위해 16채널 실리콘 프로브를 사용합니다. 현미경 아래로. 전극을 안테나 로브의 표면 가까이에 놓고 이상적인 기록 위치에서 수동 마이크로미터 매니퓰레이터를 사용하여 조직에 부드럽게 삽입하면 세포 외 신호가 여러 기록 채널에 의해 포착되고 높은 신호 대 잡음비를 갖게 됩니다.Kenyon 세포 기록의 경우, 전기 도금 절차에 따라 tero를 전기 도금하는 맞춤형 트위스트 와이어 tero가 사용됩니다. 그런 다음 실리콘 프로브는 버섯 몸체의 표면에 tero를 놓습니다. 케냐 세포의 사마라(Samara)는 이 영역의 표층(superficial layer)에 국한되어 있기 때문에, 동일한 메뚜기 제제로부터 주요 뉴런(neuron)과 케냐 세포(Kenyan cell)의 기록을 동시에 할 수 있다.녹음 위치를 확인한 후 전극이 안정화될 때까지 최소 15분 동안 기다립니다. 그런 다음 15킬로헤르츠에서 세포 외 신호를 수집합니다. 0.3에서 6 킬로헤르츠 사이로 필터링하고 16채널 AC 증폭기를 사용하여 증폭합니다.안테나 엽에 있는 투영 뉴런의 다중 단위 신경 활동을 관찰할 수 있습니다. 두 가지 다른 냄새에 대한 후각 수용체 뉴런의 반응을 보여주는 원시 세포 외 전압 추적. 2 개의 옥탈 에탄올과 1 개의 H 에탄올이 여기에 나와 있습니다.다중 장치 안테나 로브 기록의 대표적인 세포 외 추적이 여기에 표시됩니다. 서로 다른 원리 뉴런에서 발생하는 다양한 진폭의 활동 전위 또는 스파이크가 이 전압 트레이스에서 관찰될 수 있습니다. 4초의 냄새 펄스가 회색 상자로 표시된 기간 동안 적용되었습니다.버섯체 세포외 기록의 예가 여기에 나와 있습니다. 후각 수용체 뉴런 및 원리 뉴런과 달리 곤충 버섯 몸체의 케년 세포는 기준선 활성이 낮고 드물고 선택적인 방식으로 냄새에 반응합니다. 이러한 다중 단위 기록에서 단일 단위 응답을 분리하기 위해 게시된 소프트웨어를 오프라인 방식으로 사용하여 스파이크 정렬 절차를 수행합니다.원리 뉴런 및 케냐 세포 스파이크 분류의 예가 여기에 나와 있습니다.이 비디오를 시청한 후. 삽입 후각 경로를 따라 처음 세 개의 후각 중심에서 앙상블 신경 활동을 특성화하기 위해 세포 외 다단위 기록을 수행하는 방법을 잘 이해하고 있어야 합니다.

multi-unit-recording-methods-to-characterize-neural-activity-locust

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Multielectrode 어레이 (MEA) 녹음 뉴런의 대규모 인구의 전기적 활동을 연구하는 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 동시에 조직을 자극하는 동안 마우스 vomeronasal 상피에서 기록 MEA 준비의 세부 사항을 제시한다.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

곤충 후각 시스템은 electroantennograms (EAG)와 안테나에 위치한 모든 odorant 수용체 뉴런 (ORNs)에서 개별 안에 보관되어과는 반응을 표현하는 아르 단일 sensillum 레코딩 (SSR)의 형태로 기록 odorant 유발 반응에 대한 독특한 기회를 제공 각각 sensilla.

모쓰 강한 시스템에서 Electrophysiological 측정

후각 신호는 곤충의 여러 가지 행동을 중재하고, 휘발성 화합물의 수백 수십 구성 종종 복합 혼합물이다. 곤충 antennal 엽의 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 bioactive 화합물의 식별하는 방법을 설명합니다.

곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

이 문서에서는 바퀴벌레 복부 신경 코드 해부 cercal 신경과 connectives에서 세포 녹음을 설명합니다. 유발 반응은 cercal 신경 또는 cerci 직접 기계적 자극의 전기 자극에 의​​해 생성됩니다.

신경 회로 녹화 본래대로 바퀴벌레 신경계에서

하나의 단위 전기 생리학 녹음에 사용하기 위해 microwires의 조직 배열을 주입하는 기술 문제를 안겨준다. 이 기술과 필요한 장비를 수행하는 방법이 설명되어 있습니다. 또한, 높은 공간 선택과 별개의 신경 하위 영역에서 기록하는 조직 마이크로 와이어 어레이의 유익한 사용을 설명합니다.

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

두 개의 서로 다른 뇌 neuropiles 또는 두 개의 서로 다른 해부학 책자에서 동시 세포 장기 기록은 꿀벌에 설립되었다. 이 기록은 다른 뇌 영역 하나의 신경 세포에서뿐만 아니라 행동 동물의 앙상블 수준에서 신경 세포의 처리 시간 측면의 조사를 할 수 있습니다.

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

미식가 코딩을 연구하기위한 세 가지 새로운 방법을 제시 합니다. 나방의 Manduca sexta ( Manduca ) 라는 간단한 동물을 사용하여 우리는 해부 프로토콜, 다중 미각 수용체 뉴런의 활동을 기록하기위한 세포 외 tetrodes의 사용법, 정확한 타이밍 버섯의 전달 및 모니터링 시스템을 설명합니다.

새로운 방식으로 맛보기 코딩 공부하기

이 종이에 곤충 mouthparts의 palps sensilla basiconica에서 단일 sensillum 기록에 대 한 상세 하 고 매우 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

메뚜기 벨 Sensilla Basiconica에 대 한 단일 Sensillum 녹음

후각 신경에서 세포 외 다단위 기록은 해양 물고기의 후각 감도를 평가하기위한 민감하고 견고하며 재현 가능한 방법입니다. 그것은 기본 감각 입력을 기록하고 외부 염도의 독립적이다.

텔레오스트의 후각 신경에서 세포 외 다중 단위 기록

우리는 많은 Caenorhabditis elegans 벌레의 유연한 화학적 및 다중 모드 자극과 동시 신경 활동의 기록 방법을 제시합니다. 이 방법은 미세 유체 공학, 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어, 감독 자동화 데이터 분석을 사용하여 적응, 시간적 억제 및 자극 누화와 같은 신경 현상을 측정할 수 있습니다.

여러 개의 작은 유기체에서 자동화된 다중 모드 자극 및 동시 신경 기록

배우세요 메뚜기(Schistocerca americana) 후각 경로에서 다중 단위 기록 방법을 사용하여 신경 활동을 특성화하는 기법입니다. 이 방법은 무척추동물 후각 처리 중심에서 앙상블 신경 활동을 연구하는 데 활용됩니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (

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