2013년 1월 25일
우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 곤충 후각 경로의 처음 세 신호 처리 센터에서 냄새 제거 다중 단위 신경 활동을 기록하는 것입니다. 이것은 먼저 맞춤형으로 설계된 챔버에 메뚜기를 구속하고 전기 생리학적 기록을 위해 더듬이 중 하나를 안정화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 유리 마이크로 전극을 제작하고 태양 바닥에 삽입하여 냄새가 유발하는 반응을 모니터링하는 것입니다.
다음으로 메뚜기 뇌의 신경 활동을 기록합니다. 후각 감각 뉴런의 입력을 처리하는 신경 조직을 노출시키기 위해 다단계 해부 절차가 이어집니다. 마지막 단계는 메뚜기와 안테나 엽 및 버섯 몸체의 앙상블 신경 활동을 기록하기 위해 다중 전극 어레이를 적절하게 배치하는 것입니다.
궁극적으로, 여기에서 입증된 세포 외 기록 방법은 곤충 후각 경로를 따라 처음 세 개의 처리 센터에서 냄새 유발 반응을 특성화하는 데 사용됩니다. 이 방법은 비교적 단순한 무척추 동물의 후각 시스템에서 냄새가 유발하는 신경 반응을 특성화하는 데 사용되었지만, 다른 신경 시스템의 앙상블 활동을 조사하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 전극 배치 및 일부 해부 단계와 같은 이 절차의 일부 주요 측면을 배우기가 매우 어렵기 때문에 매우 중요합니다.
또한 방법은 대부분 정성적 이며 시간이 지남에 따라 다른 실험실에서 다르게 완벽하게 만들었습니다. 이 절차를 시작하려면 날개가 완전히 자란 암수의 어린 성인 메뚜기를 선택하되 밀집된 군체에서 짝짓기 단계 이전에 선택하십시오. 다음으로, 메뚜기의 다리를 절단하여 메뚜기를 제지합니다.
절단 부위를 조직 접착제로 밀봉합니다. 그런 다음 메뚜기를 흉부 주위에 드리워진 작은 전기 테이프 조각으로 맞춤 설계된 챔버에 고정합니다. 해부 현미경 아래에서 안테나 배치를 위해 왁스 플랫폼에 얕은 홈을 만듭니다.
안테나를 홈에 놓고 안테나의 양쪽 끝에 있는 바티 왁스를 사용하여 고정합니다. 그런 다음 흉부에 접지 전극을 삽입하십시오. 바틱 왁스를 사용하여 절개 부위를 밀봉하고 접지선을 제자리에 고정합니다.
다음으로, 안정화된 메뚜기 안테나를 진동 차단 테이블의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 냄새 병의 출구 라인을 냄새 전달 튜브에 연결합니다. 안테나에서 몇 센티미터 이내에 냄새 전달 튜브를 배치하십시오.전달된 냄새 증기는 메뚜기 안테나 뒤에 약 10cm 떨어진 진공 깔때기에 의해 제거됩니다.
그런 다음 마이크로 피펫 극성이 있는 burs 규산 유리 모세관을 사용하여 유리 전극을 제작하고 유리 전극에 메뚜기 식염수를 채웁니다. 다음으로, 유리 전극을 전동 마이크로 매니퓰레이터에 부착된 마이크로 피펫 홀더에 넣습니다. 녹음 syn의 바닥이 현미경으로 명확하게 보이는지 확인하십시오.
전극을 syn의 바닥에 부드럽게 삽입합니다. 그 후 신호를 10, 000회 증폭합니다. AC 사용 amp리퍼.
0.3Hz에서 10.0kHz 사이의 신호를 필터링하고 15kHz 샘플링 레이트로 수집합니다. 데이터 수집 시스템을 사용하여 전극이 적절하게 배치되면 자발적인 신경 활동을 감지할 수 있습니다. 자극 유발 반응은 냄새 전달 튜브를 통해 냄새 펄스를 전달하여 모니터링할 수 있습니다.
안테나 가까이에 배치하고 세포 외 활동의 변화를 추적하고, 앞서 설명한 바와 같이 억제 절차를 따랐습니다. 맞춤형으로 설계된 챔버에 메뚜기를 배치합니다. 메뚜기 머리 주위에 왁스 컵을 만들어 해부 과정을 시작합니다.
메뚜기 머리의 양쪽에 더듬이 높이까지 도달하는 두 개의 밀랍 탑을 건설하십시오. 그런 다음 고무 개스킷에 단단히 끼워진 작은 폴리에틸렌 튜브 조각을 통해 각 안테나를 삽입합니다. 그런 다음 개스킷을 왁스 타워에 부착하여 플라스틱 튜브가 안테나 바닥을 향하거나 안테나에서 자유롭게 미끄러질 수 있도록 하면서 안테나가 움직이는 것을 방지합니다.
그런 다음 현미경으로 메뚜기 머리 주위에 왁스 컵을 만들어 해부 절차 중과 후에 식염수 관류를 허용합니다. 왁스 컵은 입 부분 바로 위에서 시작하여 왁스 타워를 둘러싸고 겹눈 너머로 확장되어야 합니다. 왁스 컵이 완전히 구성되면 에폭시 수지를 사용하여 안테나의 바닥을 플라스틱 튜브의 하단에 부착합니다.
이렇게 하면 주변 큐티클이 제거된 후에도 안테나가 제자리에 고정됩니다. 이 시점부터 왁스 컵에 식염수를 채우십시오. 이제 둘 사이의 중앙 사각형 영역을 제거합니다.
안테나. 그 후, 더듬이 기저부의 겹눈이나 큐티클을 방해하지 않고 주변 부위의 큐티클을 제거합니다. 가는 집게를 사용하여 뇌를 둘러싸고 있는 공기 주머니와 지방체를 부드럽게 제거합니다.
이제 메뚜기 뇌를 명확하게 볼 수 있습니다. 후각 정보를 처리하는 뇌 영역은 둘 사이에 있습니다. 더듬이가 내장을 부드럽게 잡아당겨 가는 가위로 자릅니다.
그런 다음 날개를 제거하고 직장 바로 위의 복부를 작게 절개합니다. 뒷다리 내장을 굵은 집게로 당겨 내장을 제거합니다. 이 단계는 장의 움직임이 제제를 불안정하게 만들지 않도록 합니다.
식염수 누출을 방지합니다. 절개 부위 바로 앞쪽의 복부를 봉합사로 묶습니다. 다음으로, 미세한 왁스 층으로 코팅된 얇은 철사 고리로 만든 작은 플랫폼을 사용하여 뇌를 들어 올리고 전기 생리학을 위해 안정화합니다.
뇌를 기록하는 것은 반투명 덮개로 보호되며, 이는 기록하기 전에 제거해야 합니다. 칼집을 약화시키려면 왁스 컵을 부분적으로 배수하고 소량의 프로테아제를 뇌 표면에 조심스럽게 펴 바릅니다. 약 5-10초 동안 효소를 바른 후 식염수로 뇌를 철저히 헹굽니다.
그런 다음 매우 미세한 집게로 덮개를 아주 부드럽게 꼬집고 당겨 찢어 열고 녹음 부위를 노출시킵니다. 이 절차에서는 메뚜기 제제를 진동 차단 테이블의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 시간당 약 40ml의 일정한 식염수 관류 속도를 유지하십시오.
실험 전반에 걸쳐 식염수로 채워진 왁스 컵에 담근 염화은 와이어를 접지 전극으로 사용합니다. 단일 센서 기록 실험과 유사한 냄새 전달 설정을 준비합니다. 실험에 앞서, 200 - 300 킬로 범위의 임피던스를 달성하기 위해 전극을 금으로 전기도금합니다.
주요 뉴런 기록을 위해 16채널 실리콘 프로브를 사용합니다. 현미경 아래로. 전극을 안테나 로브의 표면 가까이에 놓고 이상적인 기록 위치에서 수동 마이크로미터 매니퓰레이터를 사용하여 조직에 부드럽게 삽입하면 세포 외 신호가 여러 기록 채널에 의해 포착되고 높은 신호 대 잡음비를 갖게 됩니다.
Kenyon 세포 기록의 경우, 전기 도금 절차에 따라 tero를 전기 도금하는 맞춤형 트위스트 와이어 tero가 사용됩니다. 그런 다음 실리콘 프로브는 버섯 몸체의 표면에 tero를 놓습니다. 케냐 세포의 사마라(Samara)는 이 영역의 표층(superficial layer)에 국한되어 있기 때문에, 동일한 메뚜기 제제로부터 주요 뉴런(neuron)과 케냐 세포(Kenyan cell)의 기록을 동시에 할 수 있다.
녹음 위치를 확인한 후 전극이 안정화될 때까지 최소 15분 동안 기다립니다. 그런 다음 15킬로헤르츠에서 세포 외 신호를 수집합니다. 0.3에서 6 킬로헤르츠 사이로 필터링하고 16채널 AC 증폭기를 사용하여 증폭합니다.
안테나 엽에 있는 투영 뉴런의 다중 단위 신경 활동을 관찰할 수 있습니다. 두 가지 다른 냄새에 대한 후각 수용체 뉴런의 반응을 보여주는 원시 세포 외 전압 추적. 2 개의 옥탈 에탄올과 1 개의 H 에탄올이 여기에 나와 있습니다.
다중 장치 안테나 로브 기록의 대표적인 세포 외 추적이 여기에 표시됩니다. 서로 다른 원리 뉴런에서 발생하는 다양한 진폭의 활동 전위 또는 스파이크가 이 전압 트레이스에서 관찰될 수 있습니다. 4초의 냄새 펄스가 회색 상자로 표시된 기간 동안 적용되었습니다.
버섯체 세포외 기록의 예가 여기에 나와 있습니다. 후각 수용체 뉴런 및 원리 뉴런과 달리 곤충 버섯 몸체의 케년 세포는 기준선 활성이 낮고 드물고 선택적인 방식으로 냄새에 반응합니다. 이러한 다중 단위 기록에서 단일 단위 응답을 분리하기 위해 게시된 소프트웨어를 오프라인 방식으로 사용하여 스파이크 정렬 절차를 수행합니다.
원리 뉴런 및 케냐 세포 스파이크 분류의 예가 여기에 나와 있습니다.이 비디오를 시청한 후. 삽입 후각 경로를 따라 처음 세 개의 후각 중심에서 앙상블 신경 활동을 특성화하기 위해 세포 외 다단위 기록을 수행하는 방법을 잘 이해하고 있어야 합니다.
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이 연구는 무척추동물 후각 경로의 냄새 유발 반응을 특성화하기 위한 세포 외 다중 단위 기록 기술의 변형을 시연합니다. 이 방법은 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 조사하기 위해 적용될 수 있습니다.
Understanding neural ensemble dynamics in model systems provides foundational insights for target validation in neuroscience drug discovery. Multi-unit recording techniques enable mechanistic de-risking by characterizing circuit-level responses to sensory stimuli, supporting predictive confidence in early-stage target engagement studies. This approach aids in triaging therapeutic hypotheses by linking neural activity patterns to behavioral outputs in disease-relevant systems.
This method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing in sensory processing circuits, supporting lead identification through quantifiable neural readouts, and informing preclinical advancement decisions via ensemble activity profiling.