두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

뉴런의 의존적 분자 변화를 경험하는 것은 뇌가 행동 문제에 반응하여 적응하는 능력에 필수적입니다. 유전적으로 암호화된 리포터를 통해 개별 피질 뉴런의 이러한 분자 변화를 추적할 수 있는 생체 내 2광자 이미징 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 잘 확립된 경험 많은 의존성 유전자 중 하나는 활성 조절 세포골격 관련 단백질 또는 ARC입니다.

ARC의 전사는 2개의 사진 현미경 검사법에 의해 살아있는 신경에 있는 아크 표정의 검사를 가능하게 하기 위하여 강화한 neuronal 활동에 의해 급속하게 그리고 높게 유도됩니다, 우리는 GFP 기자가 내인성 아크 발기인의 통제의 밑에 두는 knockin 마우스 선을 이용합니다. 이 프로토콜은 살아있는 동물의 신경 앙상블에서 경험이 풍부한 의존성 아크 GFP 발현 패턴을 추적하기 위한 수술 준비 및 이미징 절차를 설명합니다. 먼저 이 기술에 필요한 동물 준비에 대해 설명하겠습니다.

arc GFP 동물은 두개골 창 수술을 받고 약 2주 동안 수술 후 회복합니다. 그런 다음 두개골 창의 품질을 확인하고 이를 통해 뉴런을 이미지화할 수 있는 경우 동물을 행동 및 두 개의 광자 이미징 실험이 시작될 때까지 준(qua) 환경에 배치합니다. 그런 다음 두 개의 사진 현미경으로 이 동물들을 반복적으로 이미지화합니다.

며칠에 걸쳐 원하는 행동 패러다임을 완료한 후 뜨거운 구슬 살균기로 모든 도구를 세척합니다. 무균 수술 전에는 70% 에탄올로 수술 부위를 청소하고 깨끗한 천을 깔아주세요. 복강 내 그램 당 0.02 밀리리터로 주어진 1.2 % Everton 용액으로 동물을 마취하십시오.

완전한 진정을 보장하기 위해 꼬리 또는 발가락 꼬집음을 사용하여 마취 수준을 확인하십시오. 멸균 안과 연고로 동물의 눈을 가리고 덱사메타손을 킬로그램당 0.2mg, 카프로펜을 킬로그램당 5mg을 피하주사합니다. 귀 사이의 두개골 위의 털을 면도하고 베타딘 스크럽과 70% 에탄올이 함유된 3개의 교대 면봉으로 동물을 정위 수술 단계에 장착하고 이어바가 있는 귀바가 있는 동물 아래에 37도로 설정합니다.

정기적으로 동물의 마취 수준을 확인하고 필요에 따라 원래 마취 용량을 보충합니다. 두피 피부 아래에 0.5% 마르카인 200마이크로리터를 주입하여 해당 부위를 마비시키고 피부를 절개하며 두개골 위의 피부 덮개를 제거합니다. 골막을 제거하고 깨끗한 면봉으로 해당 부위를 말리십시오.

0.5mm 버가 있는 고속 치과 드릴을 사용하여 필요에 따라 뇌의 관심 영역 위에 직경 3-5mm의 원을 부드럽게 그립니다. 멸균 0.9% 식염수로 시추 부위를 주기적으로 적시고 깨끗한 면봉으로 뼈 먼지를 제거합니다. 뼈에서 피가 나면 멸균 식염수를 미리 적신 젤 폼을 사용하여 출혈을 닦아내고 출혈이 멈출 때까지 기다립니다.

마지막 뼈 층에 도달하면 끝이 가는 집게로 뼈 섬을 들어 올려 제거합니다. 뼈의 하단 선반에 경막 부착물을 만날 수 있습니다. 창문이 뼈 봉합사를 교차하는 경우 부드럽게 제거해야 합니다.

뼈 플랩을 들어 올리면 노출된 경막 위로 촉촉하고 젤 거품을 부드럽게 굴려 표면을 청소하고 경막 출혈이 멈출 때까지 기다립니다. 관심 영역이 경막이 특히 두꺼운 위치 아래에 있는 경우 위의 경막을 제거해야 할 수 있습니다. 이 경우 매우 미세한 집게로 경막과 경막을 아래 PIA에서 부드럽게 분리하십시오.

들어 올린 경막을 다른 가는 집게로 작게 절개합니다. 그런 다음 절단된 가장자리를 잡고 경막을 부드럽게 분할합니다. 경막은 가늘지만 강하기 때문에 경막의 가장자리가 손상되지 않은 상태에서 뇌를 절단하지 않도록 주의해야 합니다.

관심 지역에서 멀어지고 돌아올 때 멸균 A CSF 또는 멸균 식염수로 해당 부위를 넉넉히 헹굽니다. 주변 두개골이 노출된 경막 또는 피아 주위에서 크게 구부러지는 경우, 퀵 셀 접착제를 사용하여 창 덮개와 밀접하게 접촉하지 않는 공간을 채우고 이미징되지 않는 영역에서 미끄러집니다. 그런 다음 멸균 유리 덮개를 놓고 경막 또는 피아 위에 부드럽게 미끄러 뜨립니다.

Sano 아크릴 젤을 사용하여 엘라스토머 접착제와 유리 가장자리를 덮습니다. 커버 슬립. 노출된 두개골 전체를 Sano cyanoacrylate 젤 또는 미친 접착제와 치과용 시멘트 혼합물로 덮습니다.

두개골의 반대쪽 끝에 맞춤형 금속 헤드 고정 막대를 삽입하십시오. 통증 관리를 위해 킬로그램당 5mg의 케토프로펜을 복강내 주사한 후 동물을 따뜻한 회복실로 되돌립니다. 수술 후 이틀 동안 진통제를 계속 복용하십시오.

수술 후 2주간의 회복 후 ISO 불소로 동물을 마취합니다. 유도의 경우 5%, 유지 보수의 경우 1.5%. 헤드 고정 프레임이 있는 맞춤형 현미경 스테이지에 장착하고 두개골 창의 광학적 선명도를 확인합니다.

청색광이 있는 조명 아래에서 뇌 표면 혈관 투명도는 두개골 창의 품질을 크게 나타냅니다. 가장자리가 선명하게 정의되면 창을 사용할 수 있습니다. 행동 프로토콜을 시작하기 전에 동물은 일상적인 변화를 최소화하기 위해 일관된 가정 케이지 환경에 보관해야 합니다.

기준선 호에서 GFP 발현 수준은 관심 뇌 영역에 따라 행동 훈련 또는 환경 자극 패러다임을 시작합니다. 예를 들어, 동물은 시각 피질 호에서 뉴런의 독특한 집단을 이미지화하기 위해 연속적인 며칠 동안 다양한 시각 환경에 노출될 수 있으며, 뉴런의 GFP 형광은 일반적으로 자극 후 2시간 후에 최고 수준에 도달합니다. 실험 타임라인은 최대 형광 수준에서 뉴런에서 ARC GFP 발현을 쉽게 검출할 수 있도록 최적화될 수 있습니다.

행동 훈련 세션 또는 환경 자극이 완료된 후 유도를 위해 ISO 불소 5%, 유지 관리를 위해 1.5%로 동물을 마취합니다. 머리 고정 프레임이 있는 맞춤형 현미경 스테이지에 동물을 장착하십시오. 이광자 현미경 하에서 동물의 머리 위치는 두개골에 이식된 금속 막대를 사용하여 스테이지에 직접 연결되는 머리 고정 프레임에 고정됩니다.

ISO 불소와 산소는 노즈 콘을 통해 마우스에 지속적으로 공급됩니다. 발열 패드를 사용하여 체온을 유지합니다. 현미경 감지기가 주변광으로부터 보호되는지 확인하십시오.

어두운 방에서 두 개의 광자 레이저 스캔을 수행하여 이미징을 위해 20 x 또는 25 x 1.05 개구수 침수 렌즈를 사용합니다. 먼저, epi 형광 조명 아래에서 CCD 카메라로 관심 뇌 영역의 표면 혈관 패턴 이미지를 획득합니다. 향후 이미지 정렬을 위해 두 개의 광자 레이저 스캔을 시작하여 3D 이미지 스택을 획득합니다.

두 광자 레이저의 여기 파장은 920나노미터로 설정되고 출력은 약 50으로 설정됩니다. 밀리와트 방출 형광은 녹색 및 빨간색 채널 아크 모두에서 동시에 감지됩니다. GFP 형광은 녹색 채널에서만 나타나는 반면 조직 자가형광은 두 채널 모두에서 나타납니다.

일반적인 이미지 스택의 크기는 약 320 x 300, 20 x 100마이크로미터, 수평 해상도는 픽셀당 0.5마이크로미터, 수직 해상도는 픽셀당 3마이크로미터입니다. 이미지 스택을 가져온 후 동물을 집 우리로 되돌립니다. 다음 행동 및 영상 촬영 시간까지 동물을 방해하지 마십시오.

원하는 대로 며칠에 걸쳐 동작 및 이미징 절차를 반복합니다. 이전에 획득한 뇌 표면 혈관 이미지를 사용하여 동일한 이미징 위치로 다시 방향을 잡습니다. 이 기술의 강점은 여러 날에 걸쳐 동일한 뉴런 세트에서 아크 유전자 발현 변화를 검사할 수 있다는 것입니다.

살아있는 동물에서. 표준 조직화학적 방법은 단일 세포 분해능을 달성할 수 있지만 여러 날에 걸쳐 동일한 뉴런에서 유전자 발현 변화를 추적할 수는 없습니다. 자기 공명(magnetic resonance) 또는 핵 이미징 방법과 같은 다른 이미징 기술은 개별 뉴런을 이미지화할 수 있는 해상도가 부족합니다.

따라서 유전자 발현 변화를 측정하는 다른 기존 방법은 여기에 설명된 이미징 방법의 공간 해상도와 시간적 적용 범위와 모두 일치할 수 없습니다. 이 절차에서 중요한 단계는 두개골 창 수술입니다. 뇌에 외상을 입거나 유리 커버 슬립 아래에 혈액이 남지 않도록 각별한 주의를 기울여 수행해야 합니다.

필요한 경우 경막을 제거할 수 있습니다. 이 절차를 사용하는 뇌의 최대 이미징 깊이는 두개골 창의 선명도, 현미경 설정 및 형광 리포터의 밝기에 따라 달라진다는 점을 명심하십시오. 이 생체 내 이미징 프로토콜은 다양한 행동 경험에 대한 응답으로 개별 뉴런의 신경 가소성 관련 분자 역학에 대한 정보를 얻기 위한 효율적이고 다재다능한 방법이며, 다른 경험 많은 조절 유전자에 대한 형광 리포터를 운반하는 형질전환 마우스에 일반적으로 적용할 수 있을 것입니다.