Name: 두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 생체 내 이광자 현미경법을 이용하여 쥐 대뇌피질 뉴런에서 경험 의존적 ARC 유전자 발현 변화를 실시간 추적하는 방법입니다. 이 기술은 신경가소성 분자 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자 도움이 촬영을 위해 수술 촬영 장비, D. 권에 대한 L. Belluscio 감사드립니다, 비디오 K. 류는 모든 배경 음악에 대한 지원을, 편집 및 K. MacLeod. KW는 교내 연구 프로그램의 NIMH 부 및 유전자,인지와 정신증 프로그램의 관대 한 지원을 인정합니다. 이 작품은 NIMH 교내 연구 프로그램 (VC, YY, SMKW) 및 교내 임상 및 생물 연구 프로그램의 NIAAA 부 (VC, RMC, DML)에 의해 지원되었다.

아래에 설명 된 실험 절차는 정신 건강 동물 관리 및 사용위원회의 국립 연구소에 의해 승인 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 있었다. 1. 사전 수술 준비 <ol><li> 무균 수술 전에 뜨거운 구슬 살균기에있는 모든 도구를 청소, 70 %의 에탄올과 수술 사이트를 청소하고, 깨끗한 드롭 옷을 내려 놓았다. 멸균 장갑을 착용한다. ML / g, intraperitonially 0.02에서 주어진 신선하게 조리 된 1.2 % avertin 솔루션과 동물을 마취. 또한, 수동 청소 회로와 코 콘, 유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %를 통해 isoflurane 가스로 마취. 전체 진정 작용을 보장하기 위해 꼬리 나 발가락 pinches을 사용하여 마취 수준을 확인합니다. </li><li> 멸균 안과 연고과 동물의 눈을 감아, 그리고 신선한 dexamethasone를 삽입 (0.2 밀리그램 / kg)와 carprofen (5 밀리그램 / kg) subcutaneousl뇌 붓기와 염증 11 방지하기 위해 Y. 귀 사이의 머리 위에 머리를 면도하고, betadine 스크럽과 70 % 에탄올 세 번갈아 면봉으로 피부를 소독. </li><li> 37 동물 세트 아래의 물 순환 가열 패드와 함께 earbars와 stereotaxic 수술 단계에있는 동물을 마운트 ° C. 정기적으로 동물의 마취 수준을 확인하고 필요에 따라 원래 마취 복용을 보완. </li><li> 지역을 마비하기 위해 두피 피부에서 0.5 % Marcaine 200 μl를 삽입. 피부를 절개하고 두개골을 통해 피부 플랩을 제거합니다. 골막을 제거하고 깨끗한 면봉으로 지역을 건조. </li></ol> 2. 만성 두개골의 창 수술 <ol><li> 부드럽게 관심의 두뇌 영역을 통해 3~5밀리미터 직경의 원을 설명하기 위해 0.5 mm 버와 고속 치과 드릴을 사용합니다. 주기적으로 깨끗한 면봉과 멸균 0.9 % 생리와 치워 뼈 먼지와 시추 사이트를 젖었 어. 뼈가 흘러요 경우, g를 사용하여elfoam는 출혈을 가릴하고 중지 기다리 멸균 식염수에 presoaked. </li><li> 마지막 뼈 층에 도달하면 미세 스쳐 집게로 뼈 섬을 들고 제거합니다. 창 뼈 봉합을 교차하는 경우 뼈의 아래 칸에 경질 된 첨부 파일이 발생 될 수 있습니다. 뼈 플랩가 해제되기 때문에 이러한 부드럽게 제거해야합니다. </li><li> 롤은 표면을 청소하고 중지 할 경질 막 출혈을 기다리 노출 경질을 통해 부드럽게 젤 거품을 moistened 중요 단계를 :. 모든 경질 막 출혈이 멈췄을 때까지 진행하지 않습니다. 두개골 창 안에 갇혀된다 혈액은 일반적으로 불투명 한 창으로 연결됩니다. </li><li> 경질이 위의 경질을 제거, 특히 두꺼운 곳 관심 지역 위치에 따라 경우 필요할 수 있습니다. 이 경우 부드럽게 아주 좋아 포셉과 함께 아래의 피아에서 경질을 분리, 고급 집게 또 한 쌍의와 함께 해제 경질에 작은 절개를 한 후 절단 가장자리를 파악하고 부드럽게경질을 분할. 경질은 얇은하지만 강한이기 때문에, 경질의 손상 가장자리로 뇌를 갈라하지 마십시오. </li><li> 멸균 ACSF 또는 멸균 식염수 지역을 씻어. </li><li> . 경질 또는 PIA를 통해 멸균 유리 coverslip (3-5mm) 중요 단계를 놓는다 : 주변 두개골 곡선 크게하면, 경질 또는 PIA는 지역의 coverslip과 긴밀한 접촉을하지 않을 공간을 채워 Kwiksil 12 접착제를 사용하여 그는 이미징되지 않습니다. </li><li> 탄성 접착제와 유리 coverslip의 가장자리를 충당하기 위해 시아 노 아세틸렌 젤을 사용합니다. . 모든 시아 노 아세틸렌 젤은 뇌 표면을 만지지을 허용하지 않음 : 시아 노 아세틸렌 젤, 또는 krazyglue 및 치과 시멘트 혼합물로 전체 노출 두개골 중요 단계를 다룹니다. </li><li> 두개골의 반대편에서 주문 제작 금속 헤드 고정 막대를 삽입 할 수 있습니다. </li><li> 케토 프로 펜의 intraperitonial 주입, 5 밀리그램 / kg, 강한 후, 따뜻한 복구 챔버에 동물을 반환R 통증 관리. 두 일 후 operatively에 대한 진통제를 계속합니다. </li><li> 수술 회복 2 주 후, (유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %) isoflurane과 동물을 마취, 머리 고정 프레임과 주문 제작 현미경 단계에 마운트, 광학 명확성을 위해 두개의 창을 확인 푸른 빛 조명 아래에서. 뇌 표면 혈관 투명도는 두개의 창 품질 높은 나타내는 것입니다. 혈관 가장자리가 급격하게 정의하는 경우, 창은 사용 가능한이 될 수 있습니다. 두 주 후 수술 회복 시간은 수술에서 회복 할 수있는 동물에 대한 충분한 시간을 허용하는 것이 좋습니다. 두개골의 창은 일반적으로 삭제하고 개선이 기간 동안, 그리고 경질의 두개골이나 증점 안정제의 regrowth는 윈도우의 품질을 떨어까지 개월 추가 주 동안 광학 투명 남아 있습니다. </li></ol> 3. 투 광자 현미경을 스캔 행동 프로토콜 및 레이저 <ol><li> 맑은 c와 동물ranial 창은 환경 자극에 노출 또는 행동 교육 세션을 받게 한 후 최대 아크 - GFP 표현시 이후 이미징 될 것입니다. 행동 프로토콜을 시작하기 전에 동물이 기준 아크 - GFP 표현 수준에 매일 변화를 최소화 할 수있는 일관성있는 가정 케이지 환경에서 보관해야합니다. </li><li> 관심 뇌 지역에 따라, 행동 훈련 또는 환경 적 자극의 패러다임을 시작합니다. 예를 들어, 동물 연속 일 동안 다른 시각적 환경에 노출 될 수 있으며, 시각 피질에 10 자극 - 특정 응답을 식별 할 시각적 인 자극 후 매일 이미징. </li><li> 뉴런의 아크 - GFP 형광은 일반적으로 이시간 자극 후 전성기 수준에 도달합니다. 실험 타임 라인은 자신의 최대 형광 수준에서 뉴런의 아크 - GFP 표현의 검출을 용이하도록 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 행동 교육 세션이나 environmenta 후난 자극이 완료 (유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %) isoflurane과 동물을 마취하고 두 광자 현미경으로 머리 고정 프레임으로 맞춤 제작 현미경 단계에있는 동물을 탑재합니다. </li><li> 동물의 머리 위치는 두개골에 이식 금속 막대를 사용하여 스테이지에 직접 연결 헤드 고정 프레임에 고정되어 있습니다. Isoflurane과 산소가 계속 코 콘을 통해 마우스에 공급하고 있습니다. 바디 온도는 가열 패드를 사용하여 유지됩니다. </li><li> 현미경 감지기는 어두운 방에있는 두 광자 레이저 스캔을 실시하여 주변 광으로부터 보호되어 있는지 확인합니다. 이미징을위한 20x 또는 25x (1.05 수치 조리개) 물 침지 렌즈를 사용합니다. 첫째, 에피 형광 조명 아래, 미래의 이미지 정렬을위한 CCD 카메라와 관심의 뇌 영역에 걸쳐 표면 혈관 패턴의 이미지를 획득. </li><li> 3-D 이미지 스택을 얻기 위해 스캔 두 광자 레이저를 시작합니다. 올림푸스 FV1000MPE 다중 광자 현미경은 우리의 설정에 사용됩니다. 두 광자 레이저의 여기 파장 길이는 920 nm의에서 설정하고, 목표에서 방출 레이저의 힘은 약 50 MW로 설정되어 있습니다. 방출 형광 동시에 표본에 가까운 위치 외부 2 채널 photomutiplier 탐지 시스템을 사용하여 녹색과 빨간색 채널 (570 nm의에서 이색 성 거울, 495-540 nm의 및 570-625 nm의에서 차단 필터)에서 검출된다. 조직 자동 형광이 채널 13, 14 모두에 나타납니다 반면, 아크 - GFP 형광 만 녹색 채널에 나타납니다. </li><li> 일반적인 이미지 스택은 약 320x320x100 μm의 크기 (너비 x 길이 X 깊이), 0.5 μm / 픽셀의 수평 해상도, 3 μm / 픽셀의 수직 해상도를 갖추고 있습니다. </li><li> 이미지 스택을 인수 후에는 홈 케이지에 동물을 반환합니다. 다음 행동 및 이미징 세션까지 동물을 방해하지 마십시오. desir으로 일에 걸쳐 행동 및 이미징 절차를 반복거구나. 다시 같은 이미징 위치에 방향에 이전에 취득한 뇌 표면 혈관 이미지를 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

생체 이미징 방법에 여기에 설명 된 라이브 동물의 여러 일 동안 뉴런의 같은 세트에서 아크 유전자 발현의 변화 반복 시험을 할 수 있습니다. 그것은 다양한 행동 경험에 대한 응답에서 개별 뉴런의 신경 소성 관련 분자 역학에 대한 정보를 얻을 수있는 효율적이고 다양한 방법입니다. 이러한 현장 하이브리드 화 및 immunostaining의 표준 histochemical 방법은 해상도 3 개의 싱글 셀 달성하지만, 여러 일 동안 동일한 뉴런의 유전자 발현 변화를 추적 할 수있는 능력이 부족 할 수 있습니다. Bioluminescence, 자기 공명, 또는 핵 이미징 방법은 해당 기자 15 일까지 같은 동물에 유전자 발현 변경 사항을 추적하지만, 개별 뉴런의 표현 수준을 구별 할 공간 해상도가 부족 할 수 있습니다. 따라서, 유전자 발현 변화를 측정하는 다른 기존의 방법은 공간 해상도와 시간적...

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> FV1000 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> FV1000MPE </td><td> 영상 </td></tr><tr><td> 해부 현미경 </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> 외과 </td></tr><tr><td> 마우스 Stereotaxis 수술 단계 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 726335 </td><td> 외과 </td></tr><tr><td> 20X 또는 25X 물 침지 목표 </td><td> 하늘 </td><td> XLPL25XWMP </td><td> 영상 </td></tr><tr><td> 머리 고정 프레임과 현미경 단계 </td><td> 사용자가 만든 </td><td> N / A </td><td> 영상 </td></tr><tr><td> 좋은 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11251-20 </td><td> 외과 </td></tr><tr><td> 치과 드릴 버 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 19007-05 </td><td> 외과 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12 비트 </td><td> 영상 </td></tr></tbody></table>

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

경험에 대한 응답으로 변경하는 뇌의 능력은 건강한 뇌 기능을 위해 필수적이며,이 과정에서 이상이 뇌 장애의 1,2의 다양한에 기여합니다. 더 나은 뇌 회로가 동물의 경험에 반응하는하여 메커니즘을 이해하려면 라이브 동물에 시간의 연장 기간 동안, 뉴런의 주어진 집합의 경험에 의존하는 분자 변경 사항을 모니터링 할 수있는 능력이 필요합니다. 경험 및 관련 신경 활동이 뉴런 1,2에서 유전자 발현 변화를 실행하는 것으로 알려져 있습니다하지만, 방법의 대부분은 이러한 변화를 감지하는 것은 여러 일 동안 동일한 뉴런의 반복 관찰을 허용하지 않습니다 또는 개별 뉴런에게 3를 관찰하기에 충분한 해상도를 필요가 없습니다 4. 여기, 우리는 위에 각각의 대뇌 피질의 뉴런의 경험에 의존 유전자 발현 변경 사항을 추적하기 위해 유전자 코드 형광 기자와 두 광자 현미경 생체에 결합하는 방법을 설명<html> 일상의 경험 코스입니다. 잘 구축 된 경험에 의존 유전자 중 하나는 활동 - 규제 cytoskeletal 관련 단백질 (아크) 5,6입니다. 아크의 전사는 빠른 속도이며, 매우 심화 neuronal 활동에 3 유도, 그리고 단백질 제품은 glutamate 수용체 및 장기 시냅스 소성 7 endocytosis를 규정한다. 아크의 표현이 널리 3 특정 행동에 참여 neuronal 회로를지도에 분자 마커로 사용되었습니다. 이러한 연구의 대부분에서 아크 표현식은 고정 뇌 섹션에 원위치 하이브리드 또는 immunohistochemistry에 의해 발견되었다. 이러한 방법은 아크의 표현은 아크 식의 세포 패턴 일 동안 반복적으로 또는 독특한 경험을 여러 에피소드와 함께 변경 될 수는 조사되지 않은 방법을 행동 경험, 이후 흥분성의 뉴런의 일부에 번역 된 것으로 밝혀 있지만. ntent는 &quot;&gt; 생체에서 두 광자 현미경은 살아있는 뇌 8,9의 경험에 의존 세포 변경 사항을 검토 할 수있는 강력한 방법을 제공합니다. 두 광자 현미경에 의해 라이브 뉴런의 아크 식의 검사를 활성화하려면, 우리는 이전에 생성 한 가짜을 마우스 줄에 GFP 기자가 내생 아크 프로모터 (10)의 통제하에 배치됩니다.하는이 프로토콜은 수술 준비와 라이브 동물의 neuronal ensembles 경험에 의존 아크 - GFP 표현 패턴을 추적 이미징 절차를 설명합니다.이 방법에서는 , 만성 두개골 창가 먼저 관심 대뇌 피질의 지역으로 아크 - GFP 마우스에 이식되었다. 그 동물 한 후 반복적으로 며칠 동안의 원하는 행동 패러다임 후 두 광자 현미경에 의해 이미징했다.이 방법은 수행 동물 일반적으로 적용 할 수 있습니다 다른 형광 기자 경험에 의존 분자 변경 4.

<html> 이 프로토콜은 살아있는 동물에서 개별적으로 대뇌 피질의 뉴런의 경험에 의존하는 분자 변경 사항을 추적 할 수있는 방법을 설명합니다. 만성 두개골 창이 먼저 유전자 표현의 형광 기자를 들고 마우스에 관심이 대뇌 피질의 영역으로 생성됩니다. 두 광자 현미경 그런 다음 각각의 뉴런에 behaviorally 유도 분자 변화를 관찰하고 여러 일 동안 뉴런의 같은 세트에서의 변경 (그림 1)을 추적 할 다양한 행동 패러다임와 결합 할 수 있습니다. 아크 - GFP 마우스에서 아크 유전자 발현의 경험에 의존 변경 사항은 안정적이 프로토콜을 사용하여 여러 일에 대한 개별 대뇌 피질의 뉴런에 이미징 할 수 있습니다. 유전자 변형 아크-GFP 노크 인 마우스는 즉시 초기 유전자 아크의 내생 발기인 (그림 2)의 통제하에 (d2EGFP, 단백질 반감기 약 2 시간) 불안정 녹색 형광 단백질을 표현합니다. ontent ...

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.<em&gt; 생체 내</em&gt; 두 광자 이미징 방법은 유전자 인코딩 기자를 통해 개인의 대뇌 피질의 뉴런 이러한 분자 변화의 추적을 허용하는 여기에 설명되어 있습니다.

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

뉴런의 의존적 분자 변화를 경험하는 것은 뇌가 행동 문제에 반응하여 적응하는 능력에 필수적입니다. 유전적으로 암호화된 리포터를 통해 개별 피질 뉴런의 이러한 분자 변화를 추적할 수 있는 생체 내 2광자 이미징 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 잘 확립된 경험 많은 의존성 유전자 중 하나는 활성 조절 세포골격 관련 단백질 또는 ARC입니다.ARC의 전사는 2개의 사진 현미경 검사법에 의해 살아있는 신경에 있는 아크 표정의 검사를 가능하게 하기 위하여 강화한 neuronal 활동에 의해 급속하게 그리고 높게 유도됩니다, 우리는 GFP 기자가 내인성 아크 발기인의 통제의 밑에 두는 knockin 마우스 선을 이용합니다. 이 프로토콜은 살아있는 동물의 신경 앙상블에서 경험이 풍부한 의존성 아크 GFP 발현 패턴을 추적하기 위한 수술 준비 및 이미징 절차를 설명합니다. 먼저 이 기술에 필요한 동물 준비에 대해 설명하겠습니다.arc GFP 동물은 두개골 창 수술을 받고 약 2주 동안 수술 후 회복합니다. 그런 다음 두개골 창의 품질을 확인하고 이를 통해 뉴런을 이미지화할 수 있는 경우 동물을 행동 및 두 개의 광자 이미징 실험이 시작될 때까지 준(qua) 환경에 배치합니다. 그런 다음 두 개의 사진 현미경으로 이 동물들을 반복적으로 이미지화합니다.며칠에 걸쳐 원하는 행동 패러다임을 완료한 후 뜨거운 구슬 살균기로 모든 도구를 세척합니다. 무균 수술 전에는 70% 에탄올로 수술 부위를 청소하고 깨끗한 천을 깔아주세요. 복강 내 그램 당 0.02 밀리리터로 주어진 1.2 % Everton 용액으로 동물을 마취하십시오.완전한 진정을 보장하기 위해 꼬리 또는 발가락 꼬집음을 사용하여 마취 수준을 확인하십시오. 멸균 안과 연고로 동물의 눈을 가리고 덱사메타손을 킬로그램당 0.2mg, 카프로펜을 킬로그램당 5mg을 피하주사합니다. 귀 사이의 두개골 위의 털을 면도하고 베타딘 스크럽과 70% 에탄올이 함유된 3개의 교대 면봉으로 동물을 정위 수술 단계에 장착하고 이어바가 있는 귀바가 있는 동물 아래에 37도로 설정합니다.정기적으로 동물의 마취 수준을 확인하고 필요에 따라 원래 마취 용량을 보충합니다. 두피 피부 아래에 0.5% 마르카인 200마이크로리터를 주입하여 해당 부위를 마비시키고 피부를 절개하며 두개골 위의 피부 덮개를 제거합니다. 골막을 제거하고 깨끗한 면봉으로 해당 부위를 말리십시오.0.5mm 버가 있는 고속 치과 드릴을 사용하여 필요에 따라 뇌의 관심 영역 위에 직경 3-5mm의 원을 부드럽게 그립니다. 멸균 0.9% 식염수로 시추 부위를 주기적으로 적시고 깨끗한 면봉으로 뼈 먼지를 제거합니다. 뼈에서 피가 나면 멸균 식염수를 미리 적신 젤 폼을 사용하여 출혈을 닦아내고 출혈이 멈출 때까지 기다립니다.마지막 뼈 층에 도달하면 끝이 가는 집게로 뼈 섬을 들어 올려 제거합니다. 뼈의 하단 선반에 경막 부착물을 만날 수 있습니다. 창문이 뼈 봉합사를 교차하는 경우 부드럽게 제거해야 합니다.뼈 플랩을 들어 올리면 노출된 경막 위로 촉촉하고 젤 거품을 부드럽게 굴려 표면을 청소하고 경막 출혈이 멈출 때까지 기다립니다. 관심 영역이 경막이 특히 두꺼운 위치 아래에 있는 경우 위의 경막을 제거해야 할 수 있습니다. 이 경우 매우 미세한 집게로 경막과 경막을 아래 PIA에서 부드럽게 분리하십시오.들어 올린 경막을 다른 가는 집게로 작게 절개합니다. 그런 다음 절단된 가장자리를 잡고 경막을 부드럽게 분할합니다. 경막은 가늘지만 강하기 때문에 경막의 가장자리가 손상되지 않은 상태에서 뇌를 절단하지 않도록 주의해야 합니다.관심 지역에서 멀어지고 돌아올 때 멸균 A CSF 또는 멸균 식염수로 해당 부위를 넉넉히 헹굽니다. 주변 두개골이 노출된 경막 또는 피아 주위에서 크게 구부러지는 경우, 퀵 셀 접착제를 사용하여 창 덮개와 밀접하게 접촉하지 않는 공간을 채우고 이미징되지 않는 영역에서 미끄러집니다. 그런 다음 멸균 유리 덮개를 놓고 경막 또는 피아 위에 부드럽게 미끄러 뜨립니다.Sano 아크릴 젤을 사용하여 엘라스토머 접착제와 유리 가장자리를 덮습니다. 커버 슬립. 노출된 두개골 전체를 Sano cyanoacrylate 젤 또는 미친 접착제와 치과용 시멘트 혼합물로 덮습니다.두개골의 반대쪽 끝에 맞춤형 금속 헤드 고정 막대를 삽입하십시오. 통증 관리를 위해 킬로그램당 5mg의 케토프로펜을 복강내 주사한 후 동물을 따뜻한 회복실로 되돌립니다. 수술 후 이틀 동안 진통제를 계속 복용하십시오.수술 후 2주간의 회복 후 ISO 불소로 동물을 마취합니다. 유도의 경우 5%, 유지 보수의 경우 1.5%. 헤드 고정 프레임이 있는 맞춤형 현미경 스테이지에 장착하고 두개골 창의 광학적 선명도를 확인합니다.청색광이 있는 조명 아래에서 뇌 표면 혈관 투명도는 두개골 창의 품질을 크게 나타냅니다. 가장자리가 선명하게 정의되면 창을 사용할 수 있습니다. 행동 프로토콜을 시작하기 전에 동물은 일상적인 변화를 최소화하기 위해 일관된 가정 케이지 환경에 보관해야 합니다.기준선 호에서 GFP 발현 수준은 관심 뇌 영역에 따라 행동 훈련 또는 환경 자극 패러다임을 시작합니다. 예를 들어, 동물은 시각 피질 호에서 뉴런의 독특한 집단을 이미지화하기 위해 연속적인 며칠 동안 다양한 시각 환경에 노출될 수 있으며, 뉴런의 GFP 형광은 일반적으로 자극 후 2시간 후에 최고 수준에 도달합니다. 실험 타임라인은 최대 형광 수준에서 뉴런에서 ARC GFP 발현을 쉽게 검출할 수 있도록 최적화될 수 있습니다.행동 훈련 세션 또는 환경 자극이 완료된 후 유도를 위해 ISO 불소 5%, 유지 관리를 위해 1.5%로 동물을 마취합니다. 머리 고정 프레임이 있는 맞춤형 현미경 스테이지에 동물을 장착하십시오. 이광자 현미경 하에서 동물의 머리 위치는 두개골에 이식된 금속 막대를 사용하여 스테이지에 직접 연결되는 머리 고정 프레임에 고정됩니다.ISO 불소와 산소는 노즈 콘을 통해 마우스에 지속적으로 공급됩니다. 발열 패드를 사용하여 체온을 유지합니다. 현미경 감지기가 주변광으로부터 보호되는지 확인하십시오.어두운 방에서 두 개의 광자 레이저 스캔을 수행하여 이미징을 위해 20 x 또는 25 x 1.05 개구수 침수 렌즈를 사용합니다. 먼저, epi 형광 조명 아래에서 CCD 카메라로 관심 뇌 영역의 표면 혈관 패턴 이미지를 획득합니다. 향후 이미지 정렬을 위해 두 개의 광자 레이저 스캔을 시작하여 3D 이미지 스택을 획득합니다.두 광자 레이저의 여기 파장은 920나노미터로 설정되고 출력은 약 50으로 설정됩니다. 밀리와트 방출 형광은 녹색 및 빨간색 채널 아크 모두에서 동시에 감지됩니다. GFP 형광은 녹색 채널에서만 나타나는 반면 조직 자가형광은 두 채널 모두에서 나타납니다.일반적인 이미지 스택의 크기는 약 320 x 300, 20 x 100마이크로미터, 수평 해상도는 픽셀당 0.5마이크로미터, 수직 해상도는 픽셀당 3마이크로미터입니다. 이미지 스택을 가져온 후 동물을 집 우리로 되돌립니다. 다음 행동 및 영상 촬영 시간까지 동물을 방해하지 마십시오.원하는 대로 며칠에 걸쳐 동작 및 이미징 절차를 반복합니다. 이전에 획득한 뇌 표면 혈관 이미지를 사용하여 동일한 이미징 위치로 다시 방향을 잡습니다. 이 기술의 강점은 여러 날에 걸쳐 동일한 뉴런 세트에서 아크 유전자 발현 변화를 검사할 수 있다는 것입니다.살아있는 동물에서. 표준 조직화학적 방법은 단일 세포 분해능을 달성할 수 있지만 여러 날에 걸쳐 동일한 뉴런에서 유전자 발현 변화를 추적할 수는 없습니다. 자기 공명(magnetic resonance) 또는 핵 이미징 방법과 같은 다른 이미징 기술은 개별 뉴런을 이미지화할 수 있는 해상도가 부족합니다.따라서 유전자 발현 변화를 측정하는 다른 기존 방법은 여기에 설명된 이미징 방법의 공간 해상도와 시간적 적용 범위와 모두 일치할 수 없습니다. 이 절차에서 중요한 단계는 두개골 창 수술입니다. 뇌에 외상을 입거나 유리 커버 슬립 아래에 혈액이 남지 않도록 각별한 주의를 기울여 수행해야 합니다.필요한 경우 경막을 제거할 수 있습니다. 이 절차를 사용하는 뇌의 최대 이미징 깊이는 두개골 창의 선명도, 현미경 설정 및 형광 리포터의 밝기에 따라 달라진다는 점을 명심하십시오. 이 생체 내 이미징 프로토콜은 다양한 행동 경험에 대한 응답으로 개별 뉴런의 신경 가소성 관련 분자 역학에 대한 정보를 얻기 위한 효율적이고 다재다능한 방법이며, 다른 경험 많은 조절 유전자에 대한 형광 리포터를 운반하는 형질전환 마우스에 일반적으로 적용할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서...

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

출처: Mizuno, H., et al. In Vivo 신생아 마우스의 피질 뉴런의 이광자 이미징. J. Vis. 특급. (2018)이 비디오는 마취된 형질전환 생쥐 새끼의 뇌에 있는 뉴런을 이미지화하는 데 사용되는 이광자 현미경을 보여줍니다. 이광자 레이저는 높은 공간 해상도와 최소한의 광 산란으로 더 깊은 이미징을 가능하게 하여 수지상 투영을 포함한 신경 형태를 자세히 캡처할 수 있습니다.

생쥐 강아지의 신경 형태학 이미징을 위한 이광자 현미경

출처: Kamei, R., et. al., 마우스 해마에서 미세아교세포의 생체 내 만성 이광자 이미징. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 해마 CA1(Cornu ammonis 1) 및 치상회에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 현미경을 위한 설정 및 이미징 프로세스를 보여 최적의 광학 정렬 및 구조적 무결성 평가를 보장합니다.

마우스 해마에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 이미징

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

우리는 현재 vivo에서 2 광자 영상 이미징 신생아 쥐의 대뇌 피 질에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 대뇌 피 질의 뉴런, 신경 역학 및 질병 모델에서 신경 역학에 변화를 제어 하는 분자 메커니즘의 발달 역학 분석에 적합 합니다.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

학습하세요 생체 내 이광자 현미경법을 이용하여 쥐 대뇌피질 뉴런에서 경험 의존적 ARC 유전자 발현 변화를 실시간 추적하는 방법입니다. 이 기술은 신경가소성 분자 메커니즘 연구에 활용됩니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

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