림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

이 절차의 전반적인 목적은 두 가지 병렬 실험 접근 방식을 사용하여 뉴런 지불자 패치에서 림프구와 수지상 세포를 분리하고 면역 염색하는 것입니다. 첫째, 쥐, 소장에서 신선한 지불자 패치를 절제합니다. 그런 다음 지불자의 패치를 물리적으로 분리하고 조직을 채취하여 메쉬 필터를 통과시켜 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

원심분리를 통해 세포를 채취하고 96웰 원형 바닥 플레이트에 부분 표본을 분배합니다. 다음으로, 세포 유형별 표면 마커에 대한 항체로 세포를 라벨링합니다. 즉시 유세포 분석을 진행하여 특정 세포 유형을 열거하고, 동시에 payer's patches를 분리하고 조직 샘플을 스냅 동결합니다.

OCT 블록, 극저온 절편에서 샘플은 세포 유형별 표면 마커에 대한 항체로 라벨링한 다음 함께 취한 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경으로 시각화합니다. 이러한 방법은 B 세포, T 세포 및 지불자의 패치 조직 내의 특정 구획에 있는 수지상 세포를 정량화합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 PI의 패치 조직이 매우 약하고 쉽게 손상될 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

취급 중에. 갓 분리한 소장을 축축한 종이 타월이나 김 물티슈 침대 위에 눕힙니다. 그런 다음 조직 탈수를 방지하기 위해 소장을 식염수로 부드럽게 적십니다.

이제 장의 장간막 반대쪽에 위치한 개별 지불자 패치를 육안으로 식별합니다. 일반적으로 단일 마우스에는 십이지장에서 회장까지 고르게 분포된 5-10개의 눈에 보이는 지불자 패치가 있습니다. 구부러진 수술용 가위를 사용하면 일반적으로 개별 지불인의 패치를 절제합니다.

콜드 행크의 균형 분류 용액에 넣고 조직을 섭씨 4도로 유지하여 세포 생존력을 보존합니다. 다음으로, 지불자의 패치를 5ml의 비장 해리 매체에 옮기고 섭씨 37도에서 15-20분 동안 250RPM으로 흔듭니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 생성하려면 샘플을 멸균 70미크론 나일론 메쉬 셀 스트레이너에 놓고 1cc 주사기의 플런저 베이스를 사용하여 조직을 메쉬에 강제로 분쇄하여 남아 있는 세포 응집체를 제거합니다.

두 번째 70 미크론 세포를 통해 세포 현탁액을 디캔팅하고 여과기하여 15 또는 50 밀리리터 원추형 튜브에 세포를 수집합니다. 1000회에서 5분 동안 원심분리하여 96웰 원형 바닥 플레이트 펠릿 셀에 웰당 10개에서 5개의 셀을 분배합니다. G. 그런 다음 플레이트를 부드럽게 뒤집어 상등액을 기울입니다.

이제 FC 블록 버퍼에 세포를 다시 현탁시키고 15분 동안 얼음 위에서 배양합니다. 다음으로, 원하는 희석으로 Fluor 접합 항체를 세포 현탁액에 직접 추가하고 100마이크로리터의 흐름 완충액으로 얼음 세척 세포에서 배양합니다. 그런 다음 400마이크로리터의 고정 완충액에 세포를 재현탁시켜 유세포 분석으로 세포를 분석하고 동결 절편을 위해 지불자 패치를 분리합니다.

단일 지불자 패치를 포함하는 소장의 0.5cm 가로 부분을 자릅니다. 조직을 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 장 조직 분절을 OCT가 들어 있는 기본 주형 내부에 수직으로 놓습니다.

곰팡이를 액체 질소에 담그고 조직이 완전히 얼도록 합니다. 집게를 사용하여 액체 질소에서 얼어붙은 기본 곰팡이를 제거합니다. OCT 블록의 가장자리가 부드러워질 만큼만 금형이 실내 온도를 예열하도록 합니다.

그런 다음 금형에서 OCT의 냉동 블록을 제거합니다. 금형을 뒤집고 뒷면을 부드럽게 눌러 깨끗한 4 x 4cm 알루미늄 호일 조각에 블록을 배출합니다. 즉시 조직을 호일로 감싸고 액체 질소 또는 드라이 아이스 냉동 절편에 보관된 라벨이 부착된 표본 백에 넣고 LI a CM 3 0 5 0 s 극저온 마이크로톰 또는 이와 동등한 것을 사용하여 조직을 만듭니다.

저온 유지 장치의 챔버 온도를 섭씨 영하 21도로 설정합니다. 두께가 12-14미크론인 단면을 절단하는 것이 이상적입니다. Supercross plus 유리 현미경 슬라이드에 절편을 수집합니다.

표준 저전력 광학 현미경을 사용하여 샘플을 육안으로 검사합니다. 슬라이드를 아세톤에 2분 동안 담그십시오. 장기간 배양하면 슬라이드에서 조직이 분리될 수 있습니다.

PBST로 샘플을 세 번 세척합니다. 그런 다음 이미지 소수성 펜으로 섹션을 둘러쌉니다. 이제 블록 버퍼에서 샘플을 배양하고 조직 절편을 1차 항체 용액으로 오버레이합니다.

실제 조직 부분을 건드리지 않고 Kim 물티슈 또는 기타 흡수성 티슈를 사용하여 섹션 주변을 건조시킵니다. 피펫 또는 스포이드를 사용하여 연장된 금 장착 매체 한 방울을 섹션에 직접 부드럽게 떨어뜨립니다. 유리 커버 슬립을 적용하여 기포를 피하고 과도한 장착을 닦아냅니다.

Total Payers Patch Cells의 mono dispersed suspension에 대한 매체 팩스 분석은 양호한 세포 제제에서 양호한 세포 제제와 불량한 세포 제제를 명확하게 구분하는 것을 보여줍니다. 80% 이상의 생존율로 대다수의 세포는 높은 전방 산란을 보여 높은 세포 부피를 나타내고 낮은 측면 산란은 낮은 세포 입도와 일치합니다. 이 실험에서는 불량 집단에서 대다수의 세포가 낮은 FSC, 높은 SSC를 나타내며 표시된 보행 R 1을 벗어난다는 것을 입증하기 위해 의도적으로 잘못된 세포 준비를 준비했습니다.

이 세포는 세포사멸 및/또는 괴사를 겪고 있을 가능성이 높습니다. 여기에 최대 4 가지 Fluor의 칵테일. 다양한 세포 유형을 구별하는 4개의 접합 단클론 항체.

지불자에서는 패치 단일 세포 현탁액이 사용되었으며, 분화 마커 클러스터와 함께 라벨링되었습니다. CD 19 및 B two 20은 B 세포가 게이트 지불자의 약 60%를 구성한다는 것을 나타냅니다. 패치 세포 집단 특이적 T 세포 하위 집합은 CD 3 및 CD 4 또는 CD 3 및 CD 8, CD 4 양성 및 CD 8 양성 T 세포에 대한 항체로 이중 표지하여 쉽게 열거 할 수 있습니다 각각 총 지불자 패치 세포의 약 23 % 및 9 %를 구성합니다.

DC의 하위 집합은 CD 11 C 양극 및 CD 1 0 3 양극도 이 방법으로 열거할 수 있습니다. CD 11 C 양성 dcs는 총 게이트 인구의 약 8%에 기여하며, 이는 지불자 패치당 10, 000 dcs에 대략 해당합니다. CD 11 C 양성 세포 집단 중 약 4.7%가 B two 20 양성에 대해 이중 양성이었습니다.

지불자가 패치된 세포를 C 57 블랙 6 마우스에서 수집할 때도 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 잘못된 세포 준비는 매우 잘못된 결과를 초래할 수 있는데, 주로 죽거나 죽어가는 세포는 항체를 비특이적으로 결합하는 경향이 있기 때문입니다. 전형적으로, 이들은 B 2 2 0 양성 및 CD 3 개의 양성 이중 양성 세포뿐만 아니라 B 2 개의 20 양성 B 세포 및 CD 4 개의 양성 T 세포의 이중 양성 세포의 과대 표현으로 이어집니다.

mouse payers 패치 cryo section은 조직병리학적 분석과 면역 라벨링이 가능합니다. in sections의 power는 h와 e에 의해 염색될 때 세포 수준에서 더 많은 해상도를 제공하는 반면, payers patch germinal center의 밝은 영역과 어두운 영역은 cryo section 섹션에서 더 쉽게 구분됩니다. 이 일반적인 지불자 패치 극저온 섹션에서는 안티 CD 3 항체, T 세포 안티 CD 11 C 항체를 라벨링합니다.

수지상 세포와 항 B 2 20 항체를 강조합니다. 발달 후 B 세포를 강조 표시합니다. 이 기술은 이 분야의 연구자들이 장 관련 림프 조직 내의 수지상 세포와 같은 특정 세포 유형이 장 항원 및 미생물 병원체에 어떻게 반응하는지 이해할 수 있는 길을 열었습니다.

이 정보는 점막 백신 설계 및 개발에 영향을 미쳤습니다.