Name: 의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티바이러스를 이용한 microRNA 정위 주입 및 행동 평가 방법을. 이 기술은 신경과학 및 인지 기능 연구에 효과적인 유전자 전달 수단을 제공합니다.

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이 연구는 뇌 과학 에드몬드 릴리 프라 센터 (SB 교제), 이스라엘 과학 재단 (HS 권한 부여 번호 11분의 378)의 유산 유산의 생명 과학 파트너십 프로그램 및 과학에 대한 독일 이스라엘 재단에 의해 지원되었다 연구와 개발 (GIF) (HS 권한 부여 번호 1093-32.2/2010).

1. lentivirus를 준비 <ol><li> 90 %의 합류로 HEK-293FT 세포를 성장. </li><li> 혈청이없는 DMEM에 형질 변화 세포 매체의 날에 1 밀리미터 글루타민, 50 MG / ML 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충. </li><li> pLKO.1 - 푸로 벡터로 및 캐리어 9로 1 MG / ML polyethylenimine의 10 μl를 사용하여 델타 R8.2 및 VSV-G 잔기와 관심의 miRNA에 대한 코딩 플라스미드와 세포를 공동 형질. </li><li> 0.45 μm의 필터를 통해 필터, 24 시간 및 48 시간의 포스트 형질에서 패키지 렌티 바이러스를 수집합니다. </li><li> 2 시간 15 ° -70에서 C, 나누어지는 및 저장 ° C.를 들어, 70,000 XG에서 원심을 사용하여 렌티 바이러스를 집중 </li><li> 순차적으로 희석 바이러스 제제 (물론 당 벡터의 1 ~ 10 -6 ML)와 HEK - 293T 세포를 감염시켜 측정 바이러스 역가. 결과 역가가 (~ 1 최소 ML 당 × 10 9 전염성 입자 권장) GE의 발현에 대해 평가됩니다관심 NE, puromycin 선택을 사용하여 형광 세포를 계산을 통해 바이러스를 표현 GFP를 정량화 있습니다. </li></ol> 렌티 바이러스 준비의 자세한 프로토콜 10을 참조하십시오. 2. 수술 동물 준비 <ol><li> 외과 복장은 수술 가운, 멸균 장갑, 모자, 마스크를 포함해야합니다. </li><li> 동물의 무게를 측정 한 후 각 약물에 대해 지정된 동물의 무게에 비례 볼륨, 케타민 혼합물의 IP 주입으로 마취. 케타민을 / Xylazine 혼합물, 80-200 MG / kg 케타민을 및 7-20 ㎎ / kg Xylazine의 복용량 범위는 일반적으로 마우스에 사용됩니다. </li><li> 동물이 완전히 마취 될 때까지 기다린 후 다리를 확장 한 다음 손가락으로 누르면 동물의 뒷다리의 탈퇴 반사의 부족을 확인합니다. </li><li> 상자에 지정된 통증 완화를 위해, Rimadyl 피하 동물을 주입한다. Rymadil에 대한 일반적인 복용량 범위는 5 ~ 10 밀리그램이다. </li><li> 정상 체온을 유지하고 연고와 눈을 축축하게하는 가열 패드에 동물을 배치합니다. </li><li> 트리밍 기계로 두 귀 사이의 영역을 면도. </li><li> 베타 딘과 피부를 소독합니다. </li></ol> 3. 두개골과 드릴링 노출 <ol><li> 동물의 귀 바로 앞쪽에 갈라진 틈에 막대를 조정하여 stereotact 내부에 동물을 배치합니다. </li><li> 귀 사이에 약 1.5 cm의 전방 후방 절개를하고 수술 클램프 (serfines)과 열 유지하기 위해 메스를 사용합니다. </li><li> 브레 그마와 관상 lambdoid 봉합 사이의 교차점 즉; 관상 봉합과 시상 봉합 사이의 교차점까지 면봉으로 두개골의 표면을 청소 즉 람다가 표시됩니다. </li><li> 세 축 모두에서 브레 그마 점에 stereotact에 의해 개최 주사기의 끝을,,, 가리 킵니다. 좌표를 기록합니다. 이 점은 제로 PO로 간주됩니다세 축 모두에서 int로. </li><li> 평면 운동 두개골을 긁 올바른 위치에 주사기 헤드를 이동하지 않을 수 있도록 수직 축에 주사기를 들어 올립니다. -2 전방 / 후방 축에서 ± 내측 / 외측 축에서 1.8 지느러미 / 복부 축에서 -1.5 : 해마 CA1 주사는 다음과 mm의 브레 그마에 대한 상대 좌표가 필요합니다. </li><li> 이 두개골에 닿을 때까지 주사기의 끝을 내리고 마커 지점을 표시합니다. 찔러 방지하기 위해 다시 주사기를 제거합니다. </li><li> 단지 좋은 파기을 사용하여 두개골 뼈에 얕은 구멍을 뚫습니다. 그래서 부드러운 조직 아래에 드릴을 계속하지 않을 파기를 고정. 당신은 서로 견고하게 한 손으로 짧은 펄스 천공하여이 작업을 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 의 Lentivirus 주입 <ol><li> 집중 렌티 바이러스 솔루션의 0.5 ML를 철회. </li><li> 구멍 바로 위에 주사기를 배치하고 REA 때까지 천천히 수직으로 내려두개골의 CHES 표면. 아주 천천히 뇌에 주사기를 낮추기 위해 계속합니다. 이 단계에서 약간의 출혈은 반드시 실패 침투를 표시하지 않는 발생할 수 있습니다. 출혈이 발생하는 경우 면봉으로 닦아내시오. </li><li> 디지털 펌프 0.02 ML / 분 (0.5 μL가 25 분에 주입 될 것입니다) 설정하고 주입을 시작합니다. 천천히 주입 조직에 바이러스의 확산 효과를 허용하고 역류를 방지합니다. 일부 주사기 종류의 원래의 좌표와 불어로 후퇴하기 전에 0.5 mm의 여분의 깊이 주사기를 삽입하는 것이 좋습니다. </li><li> 주입이 완료되면 재료가 대신 주사기에 의해 형성된 운하로 다시 후퇴의 두뇌에 확산 할 수 있도록 추가로 5 분 기다립니다. </li><li> 아주 천천히 주사기를 제거하고 다시 흐름을 감시. 다시 흐름이 단계에서 관찰되는 경우, 주입 물질의 일부​​는 아마 분실되었다. </li></ol> 5. 상처 씰링 및 복구 <ol><li> 씰 일E는 histoacryl에 상처. 눈에 histoacryl 누출되지 않도록해야합니다. </li><li> 탈수를 방지하기 위해, 1 ML 예열 식염수 동물 복강 (IP)을 주입한다. </li><li> 가열 패드에 배치되어 복구 케이지에 동물을 배치합니다. 그것은 추가 시간 복구하는 동안 동물을보십시오. </li></ol> 체중 감소, inappetance의 경우, 약점 / 사료 또는 물, 죽어가는 상태 또는 감염 동물의 안락사를 얻기 위해 무능력을 수행해야합니다. 설치류의 안락사 허용 방법은 바르비 투르 산염, 흡입 마취제, CO 2, CO, 또는 전신 마취와 함께 염화칼륨 수 있습니다. 4~6주 후, 동물의 내비게이션 메모리 모리스 물 미로에서 평가되어 평가합니다. 렌티 바이러스는 일반적으로 주입 영역에서 대부분의 세포를 감염됩니다. 6. 모리스 물 미로의 행동 평가 <ol><li> M의 동물을 훈련오리스 물 미로. 정확한 훈련과 테스트 프로토콜 11을 참조하십시오. 각 시험 후, 마른 수건으로 동물을 건조의 케이지를 교체하고 탱크에 물을 새로 고칩니다. </li><li> 매일 연속 3 일, 시험에 대한 모리스 물 미로의 동물을 테스트합니다. 동서 - 남북 둘째 날 : 서쪽 - 남쪽 매일 예를 들어 하루에 하나, 변화하는 순서로 미로 (북쪽, 남쪽, 동쪽과 서쪽)의 4 방향의 각 미로 동물을 삽입 - 북동. 각 실험 후 동물을 닦으십시오. </li><li> 시험 중에 시험은 Noldus 추적 시스템으로 추적 시스템과 동물을 추적 할 수 있습니다. </li><li> 12 일 시험 시행 후 1 분을위한 플랫폼없이 물 탱크에 동물을 삽입합니다. 이 동물이 복용 검색 전략을 분석하는 데 사용됩니다. </li><li> 12 제안으로 데이터를 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li>
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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

렌티 바이러스의 정위 주입을위한 두 위쪽 또는 다른 유전자와 miRNA에의 다운 규제 생체 내 평가에 대한 상대적으로 빠른 방법입니다. 주요 대안은 다음 훨씬 더 힘들고 시간이 많이 소요되는 기술을 직접 lentivirus를 주입이다 유전자 조작 마우스입니다. 또한, 최대 규제, lentivirus의 주입에 성인 마우스의 특정 시간에 발생하고 대부분 시간적 컨트롤을 포함 유전자 조작 생쥐의 경우와 같이, 개발하는 동안 leakiness의 가능성을 포함하지 않습니다. 변경된 규정은 동물의 삶에서 늦게 발생하는 퇴행성 신경 질환에서 다른 유전자의 관련성을 평가할 때 전체 시간적 조절이 필수적이다. 또한, lentivirus를 주입, 다시 유전자 조작 시스템 leakiness의 일정 금액이 적용됩니다, 정확한 공간 제어 할 수 있습니다. 마우스 엔지니어링 시스템은 내생을 활용단지 특정 지역이나 세포 유형에서 활성화 될 특정 발기인의 삽입을 추가하여 다른 전사 인자의 포르 탈 누 특이성. 비교, lentivirus의 ...

신경계의 기능의 특정 miRNA에의 역할은 최근 여러 연구에서 렌티 바이러스 주입에 의해 도전되었다. 의 miRNAs는 시냅스 구조 1, 시냅스 2 시냅스 리모델링 및 유지 보수 3을 유지하고 재 형성에 중요한 것으로 발견되었습니다. 이러한 연구는 강하게 최대 형성 모두와 신경계,인지 기능의 메인 출력을 유지하고있는 다중 수준 조절 효과를 통해, miRNAs는이 종사하는 것이 좋습니다. 쥐 뇌의 특정 영역으로 렌티 바이러스 입자의 정위 주사 시냅스 형태와 신경 활동의 변화를 검색 가능하게하고, 4,5 이상 발현의 성적 기능 중요성을 설정하는 데 사용되었다. miRNA의 발현 렌티 바이러스와 잘 정의 된 뇌 영역의 뉴런의 직접적인 감염은 노화, 뇌 질환 및 신경 변성 연구에 연루 될 수 있으며 miRNA에 대한 연구들 행동 규칙 6-8의 영역에서 훨씬 적은 고급 상태에있다, 그리고 정위 주입 miRNA의 발현 행동 검사 다음 렌티 바이러스 입자는 이러한 목적을 위해 유용 할 수 있습니다. 위로 또는 아래의 발현을 유도하기위한 훨씬 더 힘드는 방법은 유전자 녹아웃 또는 녹아웃 마우스 조작이 포함됩니다. 유전 시스템은 더 발현 조건과 시간적 제어 (예를 들어, 크레 - 훈제 연어, 테트 시스템)을 허용 할 수 있지만, 이것들은 거의 주입 절차의 공간 특이성을 제공하지 않으며 leakiness의 일정 금액은 거의 항상있다. 또한, 설계 절차는 수술을 필요로하지 않는 비교적 좋은 재현성 실험실에서 사용할 수 있지만, 그들은 느린 그리고 더 많은 인력과 재정 자원을 필요로합니다. 또한,의 시간적 제어를 통해 또는 주입 생쥐에서 아래의 발현은 유전자 조작 생쥐에 비해 훨씬 더 정확합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Rodent weigh scale</td><td>Burtons (UK)</td><td>115-455</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>FIRstTechnology</td><td>DCT-25</td><td></td></tr><tr><td>트리밍 머신</td><td>스톨팅</td><td>51465</td><td></td></tr><tr><td>stereotact</td><td>스톨팅</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>메스와 블레이드</td><td>켄트 사이언티픽</td><td></td><td></td>INS500348</tr><tr><td>Harland 주사기</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td></td></tr><tr><td>드릴러</td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>디지털 펌프</td><td>Harvard 장치</td><td>704507</td><td></td></tr><tr><td>물 탱크 및 플랫폼</td><td>Stoelting</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4">Reagents</td></tr><tr><td>ketamine </td><td>Vetoquinol (Lure France)</td><td></td><td></td>3055503</tr><tr><td>도미터</td><td>Orion pharma</td><td>107140-10</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer 동물 건강</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>수분 연고 - Synthomycine 5%</td><td>Rekah Pharmaceutical</td><td>195</td><td> </td></tr><tr><td>히스토아크릴릴</td><td>브라운</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr></tbody></table>

의 정위 주입 microrna의 발현 마우스 해마 ca1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

마이크로 RNA는 (miRNAs는) ​​오래 22 세포핵 주변에 작은 규제 단일 가닥 RNA 분자하는 수있는 각 대상 다수의 mRNA의 성적 증명서 및 유도 파괴 및 / 또는 이러한 대상의 억제에 의해 번역 희미 전체 유전자 발현 통로. 몇 가지의 miRNAs는 신경 세포의 구조와 기능을 유지하고 높은 수준의 뇌 기능에 중요한 역할을하고, 방법은 이러한 기능을 탐험에 대한 자신의 수준을 조작하기위한 돕고 있습니다. 여기, 우리는 miRNA의 인코딩 바이러스 입자의 정위 주사 생쥐의 과잉 적용의 miRNAs의인지 결과를 조사하기위한 생체 방법으로 직접 제시한다. 특히, 현재의 프로토콜은 포유류의 메모리 통합, 학습, 스트레스 반응에 기여하고, 편리 주사 부위를 제공하는 해마 CA1 영역,에 주입을 포함한다. 좌표는 마우스 브레 그마 및 바이러스 관류 디지털 제어와 매우 느린 유지에 따라 측정됩니다.주사 후, 수술 상처 밀봉 동물 복구합니다. 해당 mRNA의 목표 소음기를 인코딩 렌티 바이러스는 순진 마우스와 관찰 결과에 대한 책임 특정 miRNA에 / 타겟 상호 작용을 내포하는 역할을, 식염수 컨트롤과 같은 &quot;빈&quot;lentivirus를 벡터로 주입 생쥐에 주입 쥐. 한 달 후 주입, 동물들은 탐색 학습과 기억 능력을 평가하기위한 모리스 물 미로 (MWM)에서 검토된다. MWM 1 센티미터 물 표면 아래 물속에 작은 플랫폼과 색 물이 가득 라운드 탱크. 탱크 주위에 꾸준한 시각적 공간적 탐색 (소리와 지구의 자기장도 탐색에 동물을 도움이 될)을 허용합니다. 비디오 카메라 모니터링 찾아 플랫폼을 양에 수영 시간의 경로를 측정 할 수 있습니다. 마우스가 먼저 숨겨진 플랫폼을 장착하면 강제 수영에서 탈출을 제공하는 배운, 그것은 다음이 탈출와 f를 사용하기위한 테스트inally, 플랫폼을 제거하고 마우스의 이전 위치를 기억하는 경우 프로브 테스트 검사합니다. 여러 개의 연속적인 일 동안 반복 테스트 플랫폼을 찾아 마운트 짧은 대기 시간의 테스트 생쥐의 향상된 성능을 강조하고 더 직접적인 경로는 플랫폼 또는 그 위치에 도달 할 수 있습니다. 이러한 개선 후 (고가 플러스 미로 등) 구체적으로 테스트 할 수 있습니다 장애 학습과 기억 및 / 또는 불안을 나타냅니다 표시하는 오류가 발생했습니다. 이 방법은 연구인지 및 / 또는 스트레스 관련 프로세스의 특정 miRNA에 및 대상 증명서의 유효성을 검사 할 수 있습니다.

프로토콜 섹션에 표시된 유량 마우스 해마의 CA1 지역에 0.5 μL 렌티 바이러스의 주입 주동이의 - 꼬리 축에서 약 1 mm의 감염 영역을 산출하고, 0.5 내측 - 외측에서 mm와 전방에 관하여 - 후방 축 (그림 3). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> 그림 1. 브레 그마 점과 주입 장치. (가) 보이는이 브레 그마 (관상 및 시상 봉합 교차로)와 절개를 수행 한 후 같이 람다 (Lambdoid 및 시상 봉합의 교차점)의 개략적 인 맵입니다. (B) 그림 정위 장치의 주요 기계 구성 요소를 묘사. <img a...

마이크로 RNA는 뇌의 구조와 기능에 중요한 역할을한다. 여기에 우리가 과다 발현은 설계 miRNA의 발현 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 해마 miRNA의를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은을 평가하는 상대적으로 빠른 방법으로 사용할 수 있습니다<em&gt; 생체 내</em&gt; 특정 뇌 영역의 이상 발현의 miRNAs의 효과.

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스에서 micro RNA 과발현이 신경학적 및 인지적 효과에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 micro RNA를 발현하는 렌티바이러스를 준비함으로써 달성됩니다. 렌티바이러스를 뇌의 특정 부위에 주입하면 micro RNA가 과발현되어 그 표적들을 조절할 수 있게 됩니다.마우스 뇌로 렌티바이러스를 해부학적으로 표적 전달함으로써 마이크로 RNA 과발현에 따른 인지적 효과를 보여주는 결과를 얻었습니다. 유전 공학과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 유전 공학이 직접적인 렌티바이러스 주입보다 훨씬 더 많은 노동력과 시간이 소요되는 기술이라는 점입니다. 또한, 렌티바이러스 주입을 통해 과발현되는 분자에 대한 완전한 공간적, 시간적 제어 및 추적 관찰이 가능합니다.이 방법은 행동 테스트를 통해 평가한 특정 miRNA의 과발현 또는 저발현이 학습과 기억에 미치는 영향과 같은 뉴로 miRNA 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. miRNA는 치료적 개입이 가능하다는 점에서 이 기술의 함의는 신경퇴행성 질환의 치료로까지 확장됩니다. 플레이트에 분주된 패키징 세포가 90% 컨플루언스에 도달할 때까지 배양한 후, 먼저 세포를 트랜스펙션하고, 배지를 1 mM glutamine과 50 mg/mL가 첨가된 무혈청 DMEM으로 교체하십시오.페니실린 스트렙토마이신을 처리한 후, delta R 8.2와 VSVG 부분을 코딩하는 A-P-L-K-O 0.1 pur 벡터 플라스미드와 관심 마이크로 RNA가 포함된 플라스미드를 세포에 공동 형질전환합니다. 24시간과 48시간에 캐리어로 1 mg/mL 농도의 폴리에틸렌 10 µL를 사용하십시오. 형질전환 후, 패키징된 렌티바이러스를 수집하고 0.45 µm 필터로 여과합니다.15 °C, 70,000 Gs 조건의 초원심분리기로 2시간 동안 원심분리하여 렌티바이러스가 포함된 여과액을 농축합니다. 상층액을 제거하고, 펠렛에 눈에 보이는 덩어리가 남지 않고 완전히 용해될 정도의 최소량의 탈이온 증류수를 가해 렌티바이러스를 현탁합니다. 그 후, 농축액을 소분하여 -70 °C에서 보관합니다.다음으로, 연속 희석한 바이러스를 사용하여 패키징 세포의 바이러스 타이터를 측정합니다. 12-well 플레이트의 각 well에 1 mL에서 10⁻⁶ mL까지 벡터를 분주합니다. 결과 타이터는 1 mL당 최소 10⁹ infectious particles 이상이어야 합니다.동물의 체중을 측정하고 케타민 혼합물을 복강 내(IP) 주사하여 마취시킵니다. 각 약물에 대해 명시된 대로 동물의 체중에 비례하는 부피를 사용하십시오. 동물이 완전히 마취될 때까지 기다립니다.그 다음, 반사가 나타나지 않을 때 뒷다리의 회피 반사 결여 여부를 확인하십시오. 상자에 명시된 대로 진통제 IL을 동물에게 피하 주사하십시오. 동물을 가열 램프 아래나 가열 패드 위에 두고 안연고로 눈을 보습해 주십시오.마지막으로, 트리밍 기계를 사용하여 양쪽 귀 사이의 털을 깎고 70% ethanol로 피부를 소독합니다. 동물을 정위 고정기(stereo T) 내부에 배치하고, 동물의 귀 바로 안쪽 틈새에 맞춰 고정봉을 조정합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 귀 사이에 약 1.5 centimeters 길이의 전후 절개를 실시하고, 수술용 클램프로 절개 부위를 개방 상태로 유지합니다.다음으로, 면상봉합(coronal suture)과 시상봉합(sagittal sutures)의 교차점이 보일 때까지 면봉으로 두개골 표면을 닦아냅니다. 여기에는 bgma 및 면상봉합과 람다상봉합(lambdoid sutures)의 교차점 또는 lambda가 포함됩니다. 이제 스테레오탁스(stereotype)에 고정된 시린지 팁을 세 축의 좌표에 맞춰 bgma 지점으로 위치시킵니다.이 지점들이 영점입니다. 그런 다음, 평면 이동 시 주사기가 두개골의 bgma 부분을 긁지 않도록 수직축 방향으로 주사기를 들어 올립니다. 주사기를 해마 ca1과 같은 필요한 위치로 이동시키는데, 예를 들어 AP축으로 2 mm 아래로, LM축으로 1.8 mm 좌우로, 그리고 DV축으로 1.5 mm 아래로 이동시킵니다.다음으로, 주사기 팁을 두개골에 닿을 때까지 내립니다. 해당 지점을 표시한 후, 드릴이 들어갈 공간을 확보하기 위해 주사기를 뒤로 뺍니다. 미세 드릴을 사용하여 두개골에 얕은 구멍을 뚫습니다.드릴을 안정적으로 잡고 연조직까지 드릴링하지 않도록 주의하십시오. 드릴링 시 짧은 펄스 형태로 작동시키면 도움이 될 수 있습니다. 뼈를 관통하는 드릴링이 연조직 더 깊은 곳까지 확장되지 않도록, 한 손으로 다른 손을 지지하며 작업하십시오.농축된 렌티바이러스 용액 0.5 mL를 시린지로 취합니다. 시린지를 구멍 위에 배치하고 두개골 표면에 닿을 때까지 수직으로 천천히 내립니다. 시린지를 뇌 속으로 매우 천천히 계속해서 내립니다.디지털 펌프를 분당 0.02 milliliters로 설정하여 25분 동안 해당 부피를 천천히 주입합니다. 이는 역류를 방지하고 성공적인 도포를 보장하기 위함입니다. 일부 시린지 유형에서는 주입을 시작하십시오.주사기를 원래 좌표로 되돌아가기 전에 0.5 mm 더 삽입한 후, 물질을 주입하는 동안 주입을 시작하십시오. 조직의 탈수를 방지하기 위해 노출된 부위를 PBS로 적십니다. 완료되면 주사기를 빼내기 전 5분 동안 기다리십시오.이렇게 하면 물질이 주사기 경로로 다시 되돌아가지 않고 뇌 속으로 퍼지게 됩니다. 그런 다음 주사기를 매우 천천히 제거하며 역류가 발생하는지 관찰하십시오. 역류가 관찰된다면, 주입된 물질의 일부가 손실되었을 가능성이 큽니다.histo acron이 동물의 눈으로 흘러 들어가지 않도록 주의하며 상처 부위를 밀봉합니다. 다음으로, 동물의 탈수를 방지하기 위해 가온된 식염수 1 mL를 복강 내로 주사합니다. 동물을 가열 패드 위에 놓인 회복 케이지에 넣습니다.4~6주 후에 동물이 1시간 동안 회복되는 동안 관찰하고, Morris 수중 미로 실험과 동일하게 동물의 공간 탐색 기억력을 평가합니다. 렌티바이러스가 표적 세포의 대부분을 감염시켰을 것입니다. 이때까지 ca.에 0.5 µL의 렌티바이러스를 주입합니다.프로토콜에 설명된 대로 마우스 해마의 한 영역을 제작하였습니다. 이후 동물을 희생시키고, 40 micron 두께의 뇌 절편을 분석하였습니다. GFP 발현을 위해 DAPI 염색을 빨간색으로 표시하였습니다.요약하자면, 이는吻측-미측(rostral-caudal) 축으로 약 1mm, 내외측(medial-lateral) 및 전후(anterior-posterior) AP 축으로 약 0.5mm 크기의 감염된 구형 영역을 형성하였습니다. 마이크로 RNA 인코딩 렌티벡터(lente vector)를 주입한 마우스를 Morris 수중 미로에서 대조군과 비교하였습니다. 3일간의 훈련 후, 초록색으로 표시된 대조군 마우스의 잠긴 플랫폼까지의 대표적인 이동 경로는 빨간색으로 표시된 실험군 동물의 경로보다 훨씬 짧았습니다.전반적으로, 실험 동물들은 대조군보다 과제를 학습하는 데 더 많은 어려움을 겪었습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 마우스 한 마리당 약 40분 정도 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때 유일한 제한 요인은 유속입니다.이 절차가 뇌-신체 간 통신을 어느 정도 변화시키는지와 같은 질문에 답하기 위해 계통적 올리고뉴클레오타이드 주입과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 렌티바이러스를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 일회용 타이벡 실험복과 중성 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 또한, 액체 폐기물이 포함된 유리 기구 및 플라스틱 기구는 생물학적 위험물 봉투에 폐기하기 전에 반드시 오염 제거 과정을 거쳐야 합니다.

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

이 비디오는 쥐 해마 뇌 절편에서 흥분성 시냅스 전류의 microRNA 매개 억제를 보여줍니다. CA3 뉴런은 형광 리포터, 광 활성화 막 채널 및 전위의존성 칼슘 채널의 발현을 하향 조절하는 microRNA를 발현하기 위한 구조를 품고 있는 재조합 바이러스 벡터에 감염되었습니다. 기록 챔버에 슬라이스를 배치하고 기록 피펫으로 CA1 뉴런을 패치하면 광 펄스를 사용하여 광 활성화 채널을 자극하여 이온 유입을 일으키고 활동 전위를 생성했습니다. CA3 뉴런에 전위의존성 칼슘 채널이 없으면 신경전달물질 방출이 억제되어 시냅스로 연결된 CA1 뉴런에서 흥분성 시냅스후 전류가 억제됩니다.

마우스 해마 절편에서 흥분성 시냅스후 전류의 MicroRNA 매개 억제

출처: Chen, S., et al., 신생아 마우스 뇌의 선조체 세포에서 유전자 조작을 위한 정위 수술. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 Cre 재조합효소와 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 암호화하는 바이러스 벡터를 유전자 변형 마우스 새끼의 선조체에 정위 주입하여 loxP 측면 STOP 카세트를 절제하여 적색 형광 단백질 또는 RFP를 리포터로 활성화하여 유전자 조작을 달성하는 방법을 보여줍니다.

마우스 새끼 선조체에서 유전자 조작을 위한 바이러스 벡터의 정위 미세 주입

출처: Pereira, M. et. al., 바이러스 벡터의 뇌내 주사에 의한 상주 신경교세포를 인터뉴런으로 생체 내 직접 재프로그래밍. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 형질전환 마우스의 대뇌 피질에 아데노 관련 바이러스를 정위 주사하여 Cre 의존성 뉴런 재프로그래밍 및 형광 리포터 유전자를 신경교세포에 전달하는 방법을 보여줍니다.

마우스 모델에서 신경교세포 재프로그래밍을 위한 바이러스 벡터의 정위 주입

출처: Fricano-Kugler, CJ, et al. 정위 주사를 통한 고역가 CRISPR 레트로 및 렌티바이러스의 설계, 포장 및 전달. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 뇌에서 정밀한 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 치상회로의 정확한 바이러스 전달을 보장하여 형광 표지 및 CRISPR 매개 유전자 녹아웃을 가능하게 하여 생체 내에서 신경 회로, 유전자 기능 및 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 표적 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주사

이 문서에서는 마우스의 뇌에 바이러스 벡터를 microinject하고 수집, 멸종 위기 및 회복 단계를 포함하는 에어컨 장소 환경 패러다임에서 테스트하는 방법에 대해 설명합니다.

크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

렌티 바이러스는 cDNA를 표현 또는 shRNA를 생쥐의 특정 뇌 영역에서 유전자 발현을 조절할 수의 정위 주입. 여기, 우리는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST)와 같은 행동 작업으로 정위 주사를 결합하는 프로토콜을 제시한다.

정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

여기에서는 아밀로이드-베타의 직접 입체성 뇌 주입을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 뇌 뉴런에 대한 아밀로이드-베타의 단기적인 영향을 해결하기 위한 대안적인 생체 내 마우스 모델을 제공합니다.

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

MicroRNAs는 뇌에서 중요한 역할을 하며 신경 퇴행을 모델링하기 위한 잠재적인 표적입니다. 그러나 miRNA의 길이가 짧고 뇌 조직에 접근하기 어렵기 때문에 miRNA 수치를 교란하는 것은 어렵습니다. 이 비디오는 마우스에서 뉴로펩타이드를 사용하여 antagomir 설계 및 뇌 특이적 전달 방법을 제시합니다.

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

이 문서는 주입 캐뉼라와 마우스의 해마의 CA1 영역에 이식으로 보충 된 맞춤형 이미징 창의 준비를 보여줍니다.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

학습하세요 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티바이러스를 이용한 microRNA 정위 주입 및 행동 평가 방법을. 이 기술은 신경과학 및 인지 기능 연구에 효과적인 유전자 전달 수단을 제공합니다.

의 정위 주입 MicroRNA의 발현 마우스 해마 CA1 영역으로 렌티 바이러스 및 행동 결과의 평가

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