고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

본 절차의 전반적인 목표는 비바이러스성 고분자 나노입자를 사용하여 유전자 전달 실험을 수행하고 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유전자 전달 입자로 세포를 형질전환시킨 후, 현미경 관찰과 고처리량 유세포 분석법을 통해 형질전환 효율을 평가합니다.

다음으로, 나노입자 추적 분석 장치를 사용하여 나노입자의 크기 분포 농도와 입자당 플라스미드 수를 측정합니다. 결과적으로, 이 방법을 통해 나노입자의 크기 특성을 분석하고 나노입자를 이용한 형질도입 효율을 확인할 수 있습니다. 유전자 전달을 위해 생분해성 고분자 나노입자를 사용하는 주요 장점은 다른 유전자 전달 방법보다 더 안전하고 효과적일 수 있다는 점입니다.

동적 광산란과 같은 기존 방법과 비교했을 때 나노입자 추적 분석의 주요 장점은 나노입자 추적 분석을 통해 수 평균 분포와 입자 농도를 직접적으로 얻을 수 있다는 점입니다. 이 방법은 공동 발현 연구에 중요한 입자당 플라스미드 수와 같이 비바이러스성 유전자 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 다음 프로토콜은 모델 세포로 인간 망막 내피 세포(hre)를, 모델 폴리머로 poly beta amino esters(PBA AEs)를 사용하여 시연됩니다.

사용하는 세포와 폴리머에 따라 배양 조건과 용매를 조정해야 할 수 있음을 유의하십시오. 형질전환 24시간 전에, 멀티채널 피펫을 사용하여 투명한 조직 배양 처리 플랫 바텀 96-웰 플레이트에 마이크로리터당 25~50 cells 농도로 세포를 분주합니다.

이렇게 하면 transfection 당일에 70~80%의 효율을 얻을 수 있습니다. PBA와 DNA를 조제 및 희석하기 위한 마스터 플레이트로 사용할 조직 배양 처리되지 않은 투명한 96-well plate를 준비하고 라벨을 붙이십시오. 동일한 플레이트 두 개를 준비합니다.

하나는 독성을 평가하기 위한 것이고, 다른 하나는 형질전환 효율을 평가하기 위한 것입니다. 상온에서 poly beta amino ester 또는 PVAE 폴리머와 P-E-G-F-P-N 1D NA 스톡 용액을 준비하십시오. 준비가 완료되면, 12채널 피펫을 사용하여 각 조건마다 25 millimolar sodium acetate 완충액에 녹인 0.06 milligrams per milliliter DNA 50 microliters가 포함된 웰을 준비하십시오.

다음으로 동일한 플레이트에서, PBAE 폴리머를 아세트산 나트륨 완충액으로 10 mg/mL가 되도록 희석합니다. 그런 다음 PBAE 폴리머를 폴리머 중량 대비 DNA 중량 비율이 30 및 60이 되도록 아세트산 나트륨 완충액 50 µL를 사용하여 추가로 희석합니다. 나노입자 형성을 위해, 12채널 피펫을 사용하여 희석된 PBA 50 µL와 희석된 plasma DNA 50 µL를 결합한 후, 피펫팅을 통해 강하게 혼합합니다.

그 다음, 자가 조립이 일어날 수 있도록 혼합물을 상온에서 10분 동안 배양합니다. 자가 조립 후, 12채널 피펫을 사용하여 배지가 포함된 세포가 분주된 각 웰에 나노입자 용액 20 µL를 한 방울씩 첨가하며, 이 도표에 표시된 대로 조건당 4개의 웰을 트랜스펙션합니다. 각 플레이트마다 음성 대조군과 양성 대조군을 위해 각각 최소 4개의 웰을 확보하십시오.

음성 대조군은 처리하지 않은 세포로 구성하며, 양성 대조군은 lipo 2000 또는 Fuge hd와 같은 시판 시약을 사용하여 형질전환시킨 세포로 구성합니다. 형질전환된 세포가 담긴 플레이트를 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 12채널 피펫을 사용하여 세포에서 배지를 제거하고, 웰당 100 µL의 신선한 hre 배지를 보충합니다. 이후 24~48시간 동안 추가로 배양합니다.

다음 날, 인큐베이터에서 플레이트 하나를 꺼냅니다. 형광 현미경을 통해 세포 형질전환 및 독성을 평가하고, 동봉된 텍스트에 설명된 대로 cell titer 96 aqueous one assay를 사용하여 세포 독성을 정량화합니다. 48시간 후, 인큐베이터에서 나머지 플레이트를 꺼냅니다.

동봉된 텍스트에 설명된 대로 형광, 현미경 및 유세포 분석법을 통해 형질전환 효율을 평가하십시오. 여기서 얻은 독성 및 형질전환 데이터를 사용하여 향후 실험에 사용할 PBA의 최적 농도를 결정하십시오. nano site NS 500은 개별 나노입자의 확산을 추적하여 나노입자 샘플의 크기 분포 정보를 제공할 수 있는 나노입자 추적 분석 장비입니다. 사용 전 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 nano site의 유체 시스템을 프라이밍하십시오.

이전 섹션에서 사용한 것과 동일한 농도로 분석을 위한 PBA와 plasma DNA를 준비합니다. 자가 조립 후, 새로운 1.5 milliliter 튜브에 nanoparticle 용액을 PBS로 100배 희석하여 최종 부피가 최소 500 microliters가 되도록 합니다. 이렇게 하면 nanoparticle tracking analysis에 적합한 범위의 nanoparticle 농도를 얻을 수 있습니다.

다음으로, 샘플을 나노 사이트에 로딩합니다. 이때 기포가 유입되지 않도록 주의하며, 화면에 20~100개의 입자가 나타나는지 시각적으로 확인합니다. 나노입자 추적을 위한 이상적인 입자 수는 약 50개입니다.

입자 수가 너무 많거나 적은 경우, NS 500을 세척하고 PBS 희석 배율을 조정한 후 샘플을 다시 로드하십시오. 화면에 나타나는 입자 수가 20개에서 100개 사이라면 비디오를 캡처하십시오. 비디오 캡처가 완료되면 동일한 소프트웨어에서 비디오 파일을 열어 처리 단계로 진행하십시오.

파일이 열리면 화면 게인을 높입니다. 해당 상자를 클릭하여 이미지 파라미터의 자동 조정을 선택하십시오. 소프트웨어가 화면상의 입자를 인식하면 빨간색 십자 표시로 표시됩니다.

모든 입자의 표시가 완료되면, 소프트웨어의 프로세스 버튼을 클릭하여 비디오 파일을 처리합니다. 그러면 입자 크기, 분포 크기 평균 및 입자 농도가 표시되어 입자 계수가 정확한지 확인할 수 있습니다. 동일한 샘플을 2배 및 4배로 희석하여 이 절차를 반복하십시오.

이 비디오에서 보여주는 바와 같이, PBS 내의 Forex 세포에 E-G-F-P-P-B-A-E 나노입자를 트랜스펙션하였습니다. 트랜스펙션 효율을 시각적으로 평가하기 위해 형광 현미경 이미징을 수행하였습니다. 이 이미지들은 트랜스펙션된 세포의 형광, 명시야 및 병합 이미지를 보여주며, 병합 이미지에서 볼 수 있듯이 대부분의 세포가 EGFP를 발현하고 정상적인 형태를 유지하고 있습니다.

형광 활성 세포군(live population)을 게이팅한 후, 이 그림에서 볼 수 있듯이 형질전환 효율을 정량화하기 위해 유세포 분석을 수행하였습니다. 처리하지 않은 세포군에서는 EGFP 양성 세포가 검출되지 않았습니다. 반면, 처리된 세포의 71.6%가 EGFP 양성으로 나타났습니다. 그 다음 나노 입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis)을 사용하여 나노 입자의 크기 분포와 농도를 결정하였습니다.

본 분석에서는 입자 크기 분포가 단분산(mono disperse)인 것이 중요합니다. 이 정보를 바탕으로, 용액 내 플라스미드 농도를 NS 500으로 측정된 입자 농도로 나누어 입자당 평균 플라스미드 수를 계산할 수 있습니다. 입자당 플라스미드 수는 입자 크기 분포를 반영하는 분포입니다.

샘플 내에는 입자당 플라스미드 값이 평균보다 큰 더 큰 입자들과, 입자당 플라스미드 값이 평균보다 낮은 더 작은 입자들이 존재하게 됩니다. 이 절차를 수행할 때, 나노입자를 세포에 첨가하기 전까지 분해성 폴리머가 수성 용매에 너무 오래 머물지 않도록 주의하는 것이 중요하며, ncy를 사용하기 위해서는 크기 측정에 적합하게 희석 배수를 조정하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, 비바이러스성 유전자 전달 폴리머를 이용하여 부착성 세포 유형에 형질전환시키는 방법과 형질전환 효율 및 입자 크기 분포를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

인체 세포를 다루는 작업은 생물학적 위험이 따르므로 주의하십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구를 착용하고 생물안전 작업대(biosafety cabinet) 내에서 작업하십시오.