고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

이 절차의 전반적인 목표는 비바이러스 고분자 나노입자를 사용하여 유전자 전달 실험을 수행하고 평가하는 것입니다. 이는 먼저 유전자 전달 입자가 있는 세포를 transection하여 수행됩니다. 그런 다음 transfection 효율은 현미경 검사와 고처리량 유세포 분석 분석을 통해 평가됩니다.

다음으로, 나노입자 크기 분포, 농도 및 입자당 플라스미드를 나노입자 추적 분석 장비를 사용하여 측정합니다. 궁극적으로 이 방법은 나노 입자를 사용하여 나노 입자 크기를 특성화하고 트랜스펙션(transfection) 효능을 얻을 수 있습니다. 유전자 전달을 위해 생분해성 고분자 나노입자를 사용하는 주요 이점은 다른 유전자 전달 방법보다 안전하고 효과적일 수 있다는 것입니다.

동적 광 산란과 같은 기존 방법에 비해 나노 입자 추적 분석의 주요 이점은 나노 입자 추적 분석이 숫자, 평균 분포 및 입자 농도를 직접 제공한다는 것입니다. 이 방법은 동시 발현 연구에 중요한 입자당 플라스미드 수와 같은 비바이러스 유전자 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 다음 프로토콜은 인간 망막 내피 세포 또는 hre를 모델 세포로, 폴리 베타 아미노 에스테르 또는 PBA AE를 모델 폴리머로 사용하여 시연됩니다.

배양 조건과 용매는 24시간 전에 사용된 세포와 폴리머에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 형질주입. 다채널 피펫을 사용하여 평평하게 처리된 투명 조직 배양물에 파종합니다. 바닥 96 웰 플레이트는 마이크로리터당 25-50 세포의 농도로 되어 있습니다.

이것은 transfection 당일에 70-80% co의 유창성을 제공하고 처리된 투명한 비조직 배양을 준비하고 라벨링합니다. PBA 및 DNA를 준비하고 희석하기 위한 마스터 플레이트 역할을 하는 96개의 웰 플레이트. 두 개의 동일한 접시가 준비됩니다.

하나는 독성을 평가하기 위한 것이고 다른 하나는 transfection 효율을 평가하기 위한 것입니다. 실온에서 폴리 베타 아미노 에스테르 또는 PVAE 폴리머 및 P-E-G-F-P-N 1D NA 원액을 따릅니다. 깎아내린 후에는 12채널 피펫을 사용하여 각 조건에 대해 25밀리몰 아세트산 나트륨 완충액에 밀리리터당 0.06밀리그램 DNA가 50마이크로리터로 들어 있는 웰을 준비합니다.

다음으로 같은 플레이트에서 PBAE 폴리머를 아세트산 나트륨 완충액에서 밀리리터당 10mg으로 희석합니다. 그런 다음 PBAE 폴리머를 30 및 60 및 50 마이크로 리터의 아세트산 나트륨 완충액의 폴리머 중량 대 DNA 중량 비율로 추가로 희석합니다. 나노 입자 형성을 위해 12채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 희석된 PBA와 50마이크로리터의 희석된 혈장 DNA를 위아래로 피펫팅하여 격렬하게 혼합합니다.

그런 다음 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양하여 자가 조립을 허용합니다. 자가 조립 후, 12채널 피펫을 사용하여 이 다이어그램과 같이 조건당 4개의 웰을 형질주입하는 4개의 웰을 포함하는 시딩된 세포의 각 웰에 나노 입자 용액 20마이크로리터를 적가합니다. 각 플레이트에 대해 음극 대조군과 양수 대조군 각각에 대해 최소 4개의 웰을 예약합니다.

negative control은 처리되지 않은 세포와 positive control로 구성되며, lipo 2000 또는 Fuge hd와 같은 상업적으로 이용 가능한 시약으로 transfection된 세포로 구성됩니다. 형질주입된 세포와 함께 플레이트를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다.배양 후 12채널 피펫을 사용하여 세포에서 배지를 제거하고 well당 100마이크로리터의 새로운 hre로 교체합니다. 중간 배양은 추가로 24-48시간 동안 배양합니다.

다음 날, 인큐베이터에서 접시 하나를 꺼냅니다. 형광 현미경 검사로 세포 transfection 및 독성을 평가하고 첨부 텍스트에 설명된 대로 cell titer 96 aqueous one assay를 사용하여 세포 독성을 정량화합니다. 48시간 후 인큐베이터에서 다른 플레이트를 제거합니다.

Evaluate transfection efficiency by fluorescence, microscopy, and flow cytometry (형광, 현미경 검사, 유세포 분석법)는 첨부된 텍스트에 설명되어 있습니다. 여기에서 획득한 독성 및 transfection 데이터를 사용하여 향후 실험에 사용할 최적의 PBA 농도를 결정할 수 있습니다. 나노 사이트 NS 500은 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 나노 사이트의 유체 시스템을 프라임하기 전에 개별 나노 입자의 확산을 추적하여 나노 입자 샘플의 크기 분포에 대한 정보를 제공할 수 있는 나노 입자 추적 분석 장비입니다.

이 비디오의 이전 섹션에서 사용한 것과 동일한 농도로 이전과 같이 분석을 위해 PBA 및 혈장 DNA를 준비합니다. 자체 조립 후 나노 입자 용액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 PBS에서 100 배 희석하여 최소 500 마이크로 리터의 최종 부피를 얻습니다. 이를 통해 나노 입자 추적 분석에 적합한 범위의 나노 입자 농도를 얻을 수 있습니다.

다음으로, 샘플을 나노 부위에 로드합니다. 화면에 20개에서 100개 사이의 입자가 있는지 확인하기 위해 육안으로 확인한 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 나노 입자 추적에 이상적인 수는 약 50개의 입자입니다.

너무 많거나 너무 적으면 NS 500을 플러시하고 희석액을 PBS로 조정한 다음 샘플을 다시 로드합니다. 화면의 입자 수가 20에서 100 사이인 경우 비디오를 캡처합니다. 비디오가 캡처되면 동일한 소프트웨어에서 비디오 파일을 열어 처리 단계로 진행합니다.

그런 다음 파일이 열리면 화면 게인을 높입니다. 해당 상자를 클릭하여 이미지 매개변수에 대한 자동 조정을 선택합니다. 소프트웨어의 입자가 화면에 인식되면 적십자 표시가 표시됩니다.

모든 입자가 표시되면 소프트웨어의 프로세스 버튼을 클릭하여 비디오 파일을 처리합니다. 그런 다음 입자 크기, 분포 크기 평균 및 입자 농도가 표시되어 입자 수가 정확한지 확인합니다. 2개의 x와 4로 희석된 동일한 샘플을 사용하여 이 절차를 반복합니다.

PBS apre의 Forex는 이 비디오와 같이 E-G-F-P-P-B-A-E 나노 입자로 transfection되었습니다. transfection 효율을 시각적으로 평가하기 위해 형광 현미경 이미징을 수행했습니다. 이러한 이미지는 병합된 이미지에서 볼 수 있듯이 형광 명시야 및 형질주입된 세포의 병합 이미지를 보여주며, 대부분의 세포는 EGFP를 발현하고 정상적인 형태를 유지합니다.

transfection efficiency를 정량화하기 위해 살아있는 모집단에 게이팅한 후 이 그림에서 볼 수 있듯이 유세포 분석을 수행했습니다. 절제되지 않은 집단에는 EGFP 양성 세포가 포함되어 있지 않았습니다. 그러나 처리된 세포의 71.6%가 EGFP 나노 부위에 양성인 나노 입자 추적 분석을 사용하여 나노 입자 크기 분포 및 농도를 측정했습니다.

이 분석에서는 입자 크기 분포가 단일 분산되는 것이 중요합니다. 이 정보를 사용하여 용액 내 플라스미드 농도를 NS 500에 의해 결정된 입자 농도로 나누어 입자당 평균 플라스미드 수를 계산할 수 있습니다. 입자당 플라스미드의 수는 입자 크기 분포를 반영하는 분포입니다.

샘플 내에는 입자당 플라스미드 값이 평균보다 큰 입자와 평균보다 낮은 입자당 플라스미드 값을 가진 더 작은 입자가 있을 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안, ncy를 사용하기 위해 세포에 나노 입자를 추가하기 전에 분해 성 폴리머가 수성 용매에 너무 오래 머무르지 않도록하고 크기 조정에 적합한 희석을 조정하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 non-viral gene delivery polymer를 사용하여 부착 세포 유형을 transfection하는 방법과 transfection 효능 및 입자 크기 분포를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

인간 세포를 다루는 것은 생물학적으로 위험하다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비를 착용하고 생물 안전 캐비닛에서 작업하십시오.