Name: 고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 배우세요 고분자 나노입자를 이용한 비바이러스 유전자 전달 실험 방법을. 나노입자 추적 분석과 고처리량 유동 세포 계측법으로 전달 효율을 정량 평가하여 유전자 치료 연구에 활용합니다.

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저자 지원 TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE - 0098-00)와 NIH R21CA152473 감사드립니다.

1. 셀 심는 <ol><li> 세포가 overconfluency로 성장하는 것을 허용하지 않습니다. 기본 셀을 transfecting 때 초기 통로 세포를 사용합니다. </li><li> transfection하기 전에 24 시간 정도, 세포를 trypsinize hemocytometer를 사용하여 세포 수를 계산하고, 원하는 세포 밀도 (세포 / 볼륨)를 달성하기위한 매체와 세포 현탁액을 희석. 명확한 조직에 종자 세포는 저수지와 다중 채널 피펫을 사용하여 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 문화 취급. 선택한 밀도는 transfection 당일 confluency 70~80%를 제공해야합니다. 표 1에 표시로 예를 들어, 셀은 여기에 표시 transfection 데이터를 25-50 셀 / μl로 희석되었다. </li></ol> 2. 세포 Transfection <ol><li> 폴리머와 DNA 주식의 희석. 실온 (RT)에서 폴리머와 DNA 주식 솔루션을 해동. 12 채널 피펫을 사용하여 명확 96 - 웰 플레이트에서 별도로 폴리머 주식 솔루션과 DNA 주식 솔루션을 희석, DNA 중량 비율 (중량 / 중량)에 원하는 폴리머 무게를 얻기 위해 필요한 농도에 해당 용매를 갖추고 있습니다. 이 경우, 선택된 용매는 25 MM 나트륨 아세테이트 버퍼 (산도 = 5.2)입니다. <ol><li> DNA 희석. 일반적으로, 1 MG / ML에 저장된 DNA가 아닌 조직 문화 취급 분명 96 - 웰 플레이트 (단일 제제에 대한 잘 하나)의 0.03-0.06 MG / ML의 농도에 나트륨 아세테이트 버퍼에 희석되어 있습니다. 표 2 쇼 1 단계의 세포를 놓는 96 - 웰 플레이트에 모두 복제 우물을 transfect하는 데 사용되는 단일 제제에 대한 일반적인 DNA 희석 프로토콜. </li><li> 폴리머 희석. 100 MG / ML 폴리머 / DMSO 솔루션은 DNA 중량 / 중량 비율로 원하는 폴리머를 얻기 위해 필요한 농도에 따라 아세트산 나트륨 버퍼에 희석되어 있습니다. 일반적으로 폴리 (베타 - 아미노 에스테르) S (PBAEs)와 유전자 전달에 사용되는 중량 / 중량 비율의 범위은 20 100입니다. PBAE의 폴리머 먼저 희석 P에 이어, 10 MG / ML에 희석 아르rotocol는 표 3에 표시. 폴리머 dilutions는 DNA 희석 판의 샘플 방향을 일치하지 않는 조직 문화 취급 분명 96 - 웰 플레이트에서 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Nanoparticle 형성. 12 채널 피펫을 사용하여 플라스미드 DNA 솔루션의 동일한 볼륨에 PBAE 솔루션을 추가하고 힘차게 섞는다. 자기 조립을 허용하는 10 분 동안 RT에서 혼합 배양합시다. </li><li> Nanoparticle의 transfection. 자기 조립 후, 20 μl 나노 입자는 12 채널 피펫을 사용하여 문화 매체 dropwise에 따라 잘 추가됩니다. 복제 우물이 치료 남아 있습니다 또는 컨트롤과 같은 상업적으로 이용 가능한 시약으로 transfected 수 있습니다. transfected 세포는 37 incubated 아르 ° 2-4시간 한 다음 우물에 대한 C는 신선한 미디어 (100 μl / 잘)로 대체됩니다. 부화 시간의 선택은 세포 라인, 문화 조건 및 transfection 시스템에 따라 달라집니다. transfection의 차이잠복기가 변화의 결과로 효율성과 세포 독성은 3 단계에 설명 된 분석 프로토콜에 의해 정량화 될 것입니다. </li></ol> 3. Transfection의 효율성 세포 독성 분석 Transfection 효율은 형광 현미경으로 시각적 분석과 흐름 cytometer 사십팔시간 후 transfection을 사용하여 정량하고 있습니다. 세포 독성은 형광 현미경으로 시각적으로 분석 CellTiter 96 수성 한 검정 이십사시간 후 transfection을 사용하여 정량하고 있습니다. <ol><li> 형광 현미경. 시각적으로 적절한 형광 채널을 사용하여 transfected 리포터 유전자 (예를 들어, EGFP 또는 DsRed)의 표현을위한 우물을 분석 할 수 있습니다. 적절하게 특정 공법 (그림 1)의 transfection 효율을 나타내는 뷰의 필드를 선택, 각도에 대한 이미지를 취득. 시각적으로 관찰하는 세포 독성을 적어 둡니다. </li><li> 유동 세포 계측법. <ol><li> 유동 세포 계측법의 96 - 웰 플레이트를 준비하는 다중 채널 피펫을 사용합니다. PBS로 씻어, μl / 잘 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 30, 가장자리 등의 각 우물에, 170 μl FACS 버퍼 (PBS + 2% FBS)와 피펫을 중화 아래로 trypsinize, 그리고 전체 200 μl 볼륨을 전송 둥근 바닥이나 V-하단에 96도 판에 해당 우물에 각도. </li><li> 4에서 5 분 130 XG에서 판을 원심 분리기 ° C. </li><li> 거품을 피하면서 각 resuspend을 잘하고 피펫 세포로부터 170 μl 미디어를 제거합니다. 각도에; 가능성이 propidium의 요오드화물 (PI) 같은 얼룩을 사용하려면, FACS 버퍼 + PI (PI 주식 농도 1 MG / ML PI 희석 50:1 FACS 버퍼) 10 μl를 추가합니다. 즉시 얼음에 넣고 빛으로부터 다룹니다. </li><li> C6 Accuri 흐름 cytometer, 96 - 웰 첨부 파일 HyperCyt하고 HyperView 소프트웨어를 시작합니다. 적절한 P를 선택합니다 HyperView 디자인 및 프로토콜 탭을 사용하여후반 유형, 판 레이아웃, 그리고 셰이크 / 한모금과 같은 다른 설정은 / 린스 / 시간을 잡아 봐요. 위의 프로토콜은 다음 매개 변수는 한 분, 2,400 rpm에서 30 초 동안 미리 판 흔들림에 대해 미리 판 프라임을 사용했다. 십 시간이 15 rpm으로 15 초에 설정 한 탐사선이 2 초에 잘 때마다 씻어, 그리고는 간뿐만 2,400 rpm으로 12 초 동안 매 12 우물을 흔들. 간 잘 흔들림은 세포가 우물 그룹 사이의 시간이 초과되었습니다 나누기를 (이 경우 12 초)을 포함하여 데이터를 처리 할 수​​있는 능력 향상을 위해뿐만 아니라, 미디어에 분산 보관하는 것이 중요합니다. </li><li> 적절한 아니라 (그림 2)에 데이터를 별도의를 처리 할 HyperView 잘 확인 탭을 사용하십시오. 개인 우물을 식별하기 위해, 그것은 소프트웨어의 노이즈 필터뿐만 아니라 고급 설정에서도 필터 기준을 포함​​하여 사용하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 다른 팝업을 구분하기 위해 적절한 게이팅에 의해 긍정적으로 transfected 라이브 세포의 비율을 수량화ulations (그림 3). 첫 번째 파편 (그림 3A)에서 별도의 셀에 위해 FSC 대 SSC 분산 형 플롯에 흐름 데이터를 볼 수 있습니다. propidium의 요오드화물 (PI)가 사용 된 경우, 게이트 개별 세포 인구 전망이 FSC 대 FL3 플롯에 대한 데이터 죽은 세포 및 게이트 라이브 세포에서 라이브 세포를 분리하는 순서를 유지해야합니다. transfected 세포의 수를 수량화하기 위해, 해당 채널에서 라이브 셀 인구를 보려면 예를 들어, GFP는 FL1에서 볼 수 있습니다. 문은 배경 신호 (그림 3B)을 식별하기 위해 치료 인구를 치료 세포 사용합니다. 긍정적 transfected 세포는 다음이 게이트를 사용하여 분리 분산 및 윤곽 플롯 (그림 3C 및 3D)을 모두 사용하여 transfected 인구를 보면. 할 수 있습니다 다른 세포가 형광의 다른 도로 transfected 될 것 같은 긍정적 transfected 세포의 연속이있을 수 있습니다. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 수성 한 분석 <ol><li> 세포 독성 측정이 정확히 같은 방식으로 다른 판을 Transfect. </li><li> 10 ML 신선한 매체와 CellTiter 96 수성 한 분석 솔루션의 Premix 1 ML. 세포에서 미디어를 제거하고 premixed 솔루션의 110 μl + 잘 당 미디어를 추가 할 채널 피펫을 사용합니다. </li><li> 치료 상태와 잘의 흡광도는 분석의 선형 범위에서 될 때까지 490 nm의 1에서 4 시간까지 1 시간 간격으로 흡광도를 측정합니다. 배경 흡광도 읽기에 대해서만 솔루션 + 미디어 4 개의 제어 우물을 포함합니다. </li><li> 평균 흡광도 조건에 따라 네 개의 복제 우물의 값을 각각 평균​​에서 평균 배경 흡광도를 뺍니다. %의 세포 생존 능력을 결정하는 치료 조건의 수정 평균 각 처리 조건에 대한 수정 평균을 정상화. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. Nanoparticle은 NTA와 플라스미드 당 입자의 계산과 크기 조정 <ol><li> 약 1/5th의 최대 속도와 최대 속도 약 1/10th에서 뒤로 샘플 펌프에서 앞으로 희석제 펌프를 실행하여 Nanosight의 NS500의 주요 fluidics 시스템입니다. fluidics 시스템이 희석제로 플러시 될 때까지 계속합니다. </li><li> 분석 할 수있는 나노 입자를 준비합니다. PBAEs의 경우, 별도로 주식 플라스미드 DNA (1 MG / ML)와 Eppendorf 튜브에 아세트산 나트륨 버퍼의 주식 PBAE를 (100 MG / ML) (25 MM, 산도 5) 희석. </li><li> 0.06 MG / ML에 플라스미드 DNA 농도를 희석. 폴리머 농도가 DNA에 폴리머의 필요한 무게 중량 비율에 따라 달라질 수 (60 중량 / 중량 입자에 대한 예를 들어, 폴리머는 3.6 MG / ML에 희석합니다.) </li><li> 플라스미드 DNA 솔루션의 동일한 볼륨에 폴리머 솔루션을 추가하고 힘차게 섞는다. 자기 조립을 허용하도록 10 분 동안 실온에서 혼합을 품다. </li><li> 디류트 nanoparticle 농도 위해서는 100 배 PBS로 nanoparticle 솔루션은 NTA에 해당하는 범위에하고 적어도 500 μl의 최종 볼륨을 얻을 수 있습니다. </li><li> 샘플 Eppendorf 튜브 (그림 4A)에로드 관을 배치하여 Nanosight에 샘플을로드합니다. 공기 거품을 소개하지 있는지 확인하십시오. </li><li> 입자을 볼 수있을 때까지 캡처 모드에서 카메라 수준을 향상시킬 수 있습니다. 입자 (그림 4A 및 4B) 부드러운 볼 수 있도록 초점을 조정합니다. </li><li> 일반 모드에서 모든 입자가 화면에 볼 수 있다는 점을 통과 카메라 수준을 조정합니다. 그런 다음 입자가 모든 여전히 관찰 할 수 있도록 가장 낮은 수준에 카메라 수준을 낮출 수 있습니다. 중간 카메라 수준이 필요한 경우, 고급 모드로 가서 카메라 셔터를 수정하고 적절한 수준으로 파악할 수 있습니다. </li><li> 시각 20 사이에있을 것 확인 - s의 100 입자를creen. nanoparticle 추적을위한 이상적인 숫자는 약 50 입자입니다. 너무 많은 또는 너무 적은 경우, NS500를 플러시 PBS로 희석을 조정하고, 샘플을 다시로드합니다. </li><li> 표준 모드 표에 따라 촬영 시간을 조정합니다. 일반적으로 30-60 초는 적절한 캡처 길이 (그림 4B)입니다. </li><li> 다음 샘플을로드하려면 다시로드하여 새 샘플 다음, 시스템을 플러시. </li><li> 일단 동영상을 캡처, 비디오 파일을 열어 처리 단계로 진행합니다. </li><li> 가장 (그림 4C) 비디오를 처리하기 위해 조정 할 수 있습니다 매개 변수의 숫자가 있습니다. 목표는 최선의 각 입자 (그림 5)를 통해 화면에 적십자 마크가 표시된 화면에서 각 입자를 캡처하는 매개 변수를 선택하는 것입니다. </li><li> 더 나은 입자를 보려면 화면 이득을 향상시킬 수 있습니다. 표준 또는 고급 모드에서 자동으로 clickin하여 매개 변수에 대한 조정을 선택g 해당 상자. 자동 설정이 적절하게 입자를 선택하지 않습니다 경우, unclick 상자 수동으로 매개 변수를 (그림 4C)을 설정합니다. </li><li> 일단 모든 입자가 화면에 선택됩니다, 비디오 파일 (그림 4C)를 처리하는 소프트웨어의 프로세스 버튼을 클릭합니다. 이것은 입자 크기 분포, 크기의 평균뿐만 아니라, 입자 농도를 제공합니다. </li><li> 입자 농도가 정확 특정하기 위해서, 배에 희석을 증가하여 PBS 희석 같은 변경하고, 위의 절차를 반복합니다. 동일한 샘플의 여러 dilutions을 측정하는 것은 샘플의 농도 측정이 정확한지 확인하는 것이 좋습니다. 측정을위한 좋은 범위는 10 7 -10 9 입자 / ML입니다. </li><li> 모든 plasmids은 나노 입자의 젤 전기 영동을 실행하고 무료로 DNA가 존재 여부를 평가함으로써 나노 입자에 포함되어 있는지 확인합니다.모든 plasmids를 캡슐화하는 경우, 총 캡슐화 plasmids을 수량화하기 위해 DNA의 흡광도를 측정하는 표준 기술을 사용합니다. </li><li> 입자 당 plasmids의 평균 수를 계산하려면 NTA 측정 입자 농도에 의한 총 캡슐화 플라스미드 농도를 나눕니다. 플라스미드 당 입자 샘플 분포를 추정하기 위해, 먼저 입자의 각 1 나노 미터 빈의 볼륨 분율을 계산하는 NTA 입자 크기 히스토그램을 사용합니다. 각 병원에 plasmids의 수를 얻기 위해 전체 플라스미드 금액하여이 볼륨 분율 분포를 곱합니다. 각 입자 크기 (그림 6)에 대한 plasmids 당 입자의 수를 얻기 위해 각 빈에있는 입자의 수가이 숫자를 나눕니다. </li></ol>

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저자는 관심의 충돌을보고하지 않습니다.

위의 프로토콜 nanoparticle 공법의 transfection 효율뿐만 아니라 입자 크기와 나노 입자의 DNA 로딩을 특성화 할 수있는 방법을 평가하는 방법을 설명합니다. 입자 당 plasmids의 수는 입자의 효과를 예측 할 수 있습니다 중요한 매개 변수이며, 또한 용량 결정에 사용할 수 있습니다. Nanoparticle 추적 분석 등 소금 농도에 차이가있는 등 다양한 수성 솔루션의 범위에서 수행 할 수 있습니다. 종종이 특성은 생리 식염수을 모방하기 위해 PBS에 수행됩니다. PBS에서 크기 조정하는 미디어 또는 생리 식염수에있는 나노 입자의 크기의 좋은 견적을 줄 수 있지만, 혈청 현재의 양이 나노 입자 17의 크기와 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 혈청의 다양한 농도의 입자 특성도 특정 응용 프로그램에 중요 할 수 있습니다. 혈청, additio에서 입자를 특성화하기 위하여NAL 단계는 혈청 단백질의 높은 배경 산란으로 인해 권장합니다. 이 경우 입자 휘황 형광 필터의 사용을 통해,...

nanoparticle 당 complexed plasmids의 수의 결정은 특히 동일한 셀 대상에 대해 여러 plasmids의 공동 제공을위한 효과적인 nanoparticle 기반의 유전자 전달 전략을 설계,하는 것이 중요합니다, 등은 종종 연구 12 재 프로그래밍 줄기 세포에 필요합니다. 하나의 nanoparticle과 관련된 plasmids의 수를 계산하는 몇 가지 방법이 설명, 각 접근 방식은 추정 13-16에 사용되는 기술의 단점을 가지고있다되었습니다. TEM과 결합 양자 점 (QD) 라벨은 키토산 기반의 나노 입자에 입자 당 plasmids를 추정하는 데 사용되었습니다. 캡슐화 라벨이없는 DNA가 직접 감지되지 않는 가능성; 잠재적으로 중복 plasmids과 입자의 2D TEM 이미지에서 QDs,이 QD 기술을 추정 인해 그 자체 조립 속성을 변경할 수있는 DNA를 레이블 할 필요에 복잡하고 다른 단순화 가정 13. 이 대안 접근 방식pplicable 주문 microdomains의 입자에 존재하면 cryo - 전송 전자 현미경 (cryo-TEM), X-선 산란, 및 동적 광 분산 (DL을) 14,15을 통해 Lipopolyamine-DNA 단지를 연구하는 데 사용되었습니다. 불행하게도, 이러한 여기 조사 고분자 나노 입자 등의 자료는이 방법으로 적용되지 않습니다. . 그러나, 그들의 방법은 큰, 마이크론 크기의 입자 16 평가할 수 있습니다, 또 다른 연구에서, 콜린스 외 공부하는 흐름 입자 이미지 분석 기술 (LYS) 16 - 포함 펩타이드 / DNA 복합체를 사용했습니다. 따라서, 우리는 최근에 nanoparticle 11 당 plasmids의 수를 수량화 할 수있는 소설하고 유연한 분석을 개발했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> 인산염은 1X (PBS)를 식염 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 10,010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV의 BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Invitrogen </td><td> 25,300 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 아세테이트 버퍼 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S7899 </td><td> 탈 이온수에 25mM로 희석 </td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> 엘림의 Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21,718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, 분기 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 408727 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 수성 하나 </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 자료 </td></tr><tr><td> 삭제 평면 바닥 96 - 웰 플레이트, 무균 </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> 삭제 둥근 바닥 96 - 웰 플레이트, 무균 </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 채널 Finnpipette </td><td> 열 과학 </td><td> NA </td><td> 5-50과 50-300 μl </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> 모델 번호 : AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri 흐름 cytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt 첨부 </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> Nanosight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

고분자 나노 입자를 사용하여 비 바이러스 성 유전자 전달은 유전 질환 1을 치료하는 유전자 치료에 대한 매력적인 접근 방식으로서 재생 의료 2 기술로 등장했다. 중요한 안전 문제가 바이러스, 달리, 고분자 나노 입자는 더 큰 핵산화물과 생분해 성 및 / 또는 환경 대응을 들고 할 수있는, 화학적으로 다양한, 합성 무독성, 비 immunogenic, 비 mutagenic, 쉽게 할 수 있도록 설계 할 수 있습니다. 양이온 폴리머는 일반적으로 고분자 나노 입자를 칭했다 아르 100 나노 미터의 순서에 복합체를 형성하기 위해 정전기 상호 작용을 통해 부정적인 요금이 부과 DNA와 자기 조립. nanoscale polycationic 유전자 전달 나노 입자를 형성하는 데 사용 biomaterials의 예로는 비 degradable 재고품입니다 polylysine, polyphosphoesters, 폴리 (amidoamines) s와 polyethylenimine (PEI)를 포함 일반적으로 핵산 전달 1,3에 사용되는 양이온 폴리머. 폴리 (베타 - 아미노에스테르) S (PBAEs)는 5,6 hydrolytically degradable이며, 인간의 망막 내피 세포 (HRECs) 7과 같은 어려운 transfect 세포 유형에 대한 유전자 전달에 효율적으로 표시되어 양이온 폴리머 4의 최신 수업 마우스 유방 상피 세포 8, 인간의 뇌 암 세포 9 및 10 macrovascular (인간 배꼽 정맥, HUVECs) 내피 세포. nanoparticle 추적 분석 (NTA)를 활용 한 고분자 나노 입자를 특성화 할 수있는 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법에서 입자 크기 분포와 입자 당 plasmids의 수 분포 모두 11 얻을 수 있습니다. 또한, 고분자 나노 입자의 transfection 효율의 급속한 진단을위한 높은 처리량 96 - 웰 플레이트 transfection 분석이 제공됩니다. 이 프로토콜에서는 폴리 (베타 - 아미노 에스테르) S (PBAEs)이 모델 고분자와 인간 망막 내피 세포 (HRECs)로 사용되는은 MO로 사용됩니다델 인간의 세포. 이 프로토콜은 쉽게 고분자 nanoparticle 및 멀티뿐만 판 형식에 대한 관심의 세포 유형을 평가하도록 구성 할 수 있습니다.

그림 1은 플라스미드 EGFP와 HRECs를 성공적으로 transfection의 예를 형광 현미경 이미지를 보여줍니다. brightfield 이미지는 세포가 자신의 일반적인 형태를 유지하도록 도움이됩니다. 또한, 이러한 MTS 또는 이와 유사한 assays 같은 세포 생존 능력의 assays은, nanoparticle 독성 7 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 설명 된대로, transfection 효율을 수량화하는 데 사용할 수 있습니다. HyperCyt 멀티 잘 플레이트 첨부 파일을 사용하는 경우, 데이터가 제대로 우물을 식별하기 위해 적절하게 처리해야합니다. 셀 카운트가 (물론 당 세포의 수천) 좋은, 그리고 fluidics가 제대로 작동하는 경우 그림 2의 오른쪽 패널에서 볼 수 있듯이, 각각의 우물은 모두 수동 및 소프트웨어에 의해 선택하기 쉬워졌습니다. 셀 카운트가 너무 낮은 또는 fluidics에 문제가있을 경우에는,...

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

본 절차의 전반적인 목표는 비바이러스성 고분자 나노입자를 사용하여 유전자 전달 실험을 수행하고 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유전자 전달 입자로 세포를 형질전환시킨 후, 현미경 관찰과 고처리량 유세포 분석법을 통해 형질전환 효율을 평가합니다.다음으로, 나노입자 추적 분석 장치를 사용하여 나노입자의 크기 분포 농도와 입자당 플라스미드 수를 측정합니다. 결과적으로, 이 방법을 통해 나노입자의 크기 특성을 분석하고 나노입자를 이용한 형질도입 효율을 확인할 수 있습니다. 유전자 전달을 위해 생분해성 고분자 나노입자를 사용하는 주요 장점은 다른 유전자 전달 방법보다 더 안전하고 효과적일 수 있다는 점입니다.동적 광산란과 같은 기존 방법과 비교했을 때 나노입자 추적 분석의 주요 장점은 나노입자 추적 분석을 통해 수 평균 분포와 입자 농도를 직접적으로 얻을 수 있다는 점입니다. 이 방법은 공동 발현 연구에 중요한 입자당 플라스미드 수와 같이 비바이러스성 유전자 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 다음 프로토콜은 모델 세포로 인간 망막 내피 세포(hre)를, 모델 폴리머로 poly beta amino esters(PBA AEs)를 사용하여 시연됩니다.사용하는 세포와 폴리머에 따라 배양 조건과 용매를 조정해야 할 수 있음을 유의하십시오. 형질전환 24시간 전에, 멀티채널 피펫을 사용하여 투명한 조직 배양 처리 플랫 바텀 96-웰 플레이트에 마이크로리터당 25~50 cells 농도로 세포를 분주합니다.이렇게 하면 transfection 당일에 70~80%의 효율을 얻을 수 있습니다. PBA와 DNA를 조제 및 희석하기 위한 마스터 플레이트로 사용할 조직 배양 처리되지 않은 투명한 96-well plate를 준비하고 라벨을 붙이십시오. 동일한 플레이트 두 개를 준비합니다.하나는 독성을 평가하기 위한 것이고, 다른 하나는 형질전환 효율을 평가하기 위한 것입니다. 상온에서 poly beta amino ester 또는 PVAE 폴리머와 P-E-G-F-P-N 1D NA 스톡 용액을 준비하십시오. 준비가 완료되면, 12채널 피펫을 사용하여 각 조건마다 25 millimolar sodium acetate 완충액에 녹인 0.06 milligrams per milliliter DNA 50 microliters가 포함된 웰을 준비하십시오.다음으로 동일한 플레이트에서, PBAE 폴리머를 아세트산 나트륨 완충액으로 10 mg/mL가 되도록 희석합니다. 그런 다음 PBAE 폴리머를 폴리머 중량 대비 DNA 중량 비율이 30 및 60이 되도록 아세트산 나트륨 완충액 50 µL를 사용하여 추가로 희석합니다. 나노입자 형성을 위해, 12채널 피펫을 사용하여 희석된 PBA 50 µL와 희석된 plasma DNA 50 µL를 결합한 후, 피펫팅을 통해 강하게 혼합합니다.그 다음, 자가 조립이 일어날 수 있도록 혼합물을 상온에서 10분 동안 배양합니다. 자가 조립 후, 12채널 피펫을 사용하여 배지가 포함된 세포가 분주된 각 웰에 나노입자 용액 20 µL를 한 방울씩 첨가하며, 이 도표에 표시된 대로 조건당 4개의 웰을 트랜스펙션합니다. 각 플레이트마다 음성 대조군과 양성 대조군을 위해 각각 최소 4개의 웰을 확보하십시오.음성 대조군은 처리하지 않은 세포로 구성하며, 양성 대조군은 lipo 2000 또는 Fuge hd와 같은 시판 시약을 사용하여 형질전환시킨 세포로 구성합니다. 형질전환된 세포가 담긴 플레이트를 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 12채널 피펫을 사용하여 세포에서 배지를 제거하고, 웰당 100 µL의 신선한 hre 배지를 보충합니다. 이후 24~48시간 동안 추가로 배양합니다.다음 날, 인큐베이터에서 플레이트 하나를 꺼냅니다. 형광 현미경을 통해 세포 형질전환 및 독성을 평가하고, 동봉된 텍스트에 설명된 대로 cell titer 96 aqueous one assay를 사용하여 세포 독성을 정량화합니다. 48시간 후, 인큐베이터에서 나머지 플레이트를 꺼냅니다.동봉된 텍스트에 설명된 대로 형광, 현미경 및 유세포 분석법을 통해 형질전환 효율을 평가하십시오. 여기서 얻은 독성 및 형질전환 데이터를 사용하여 향후 실험에 사용할 PBA의 최적 농도를 결정하십시오. nano site NS 500은 개별 나노입자의 확산을 추적하여 나노입자 샘플의 크기 분포 정보를 제공할 수 있는 나노입자 추적 분석 장비입니다. 사용 전 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 nano site의 유체 시스템을 프라이밍하십시오.이전 섹션에서 사용한 것과 동일한 농도로 분석을 위한 PBA와 plasma DNA를 준비합니다. 자가 조립 후, 새로운 1.5 milliliter 튜브에 nanoparticle 용액을 PBS로 100배 희석하여 최종 부피가 최소 500 microliters가 되도록 합니다. 이렇게 하면 nanoparticle tracking analysis에 적합한 범위의 nanoparticle 농도를 얻을 수 있습니다.다음으로, 샘플을 나노 사이트에 로딩합니다. 이때 기포가 유입되지 않도록 주의하며, 화면에 20~100개의 입자가 나타나는지 시각적으로 확인합니다. 나노입자 추적을 위한 이상적인 입자 수는 약 50개입니다.입자 수가 너무 많거나 적은 경우, NS 500을 세척하고 PBS 희석 배율을 조정한 후 샘플을 다시 로드하십시오. 화면에 나타나는 입자 수가 20개에서 100개 사이라면 비디오를 캡처하십시오. 비디오 캡처가 완료되면 동일한 소프트웨어에서 비디오 파일을 열어 처리 단계로 진행하십시오.파일이 열리면 화면 게인을 높입니다. 해당 상자를 클릭하여 이미지 파라미터의 자동 조정을 선택하십시오. 소프트웨어가 화면상의 입자를 인식하면 빨간색 십자 표시로 표시됩니다.모든 입자의 표시가 완료되면, 소프트웨어의 프로세스 버튼을 클릭하여 비디오 파일을 처리합니다. 그러면 입자 크기, 분포 크기 평균 및 입자 농도가 표시되어 입자 계수가 정확한지 확인할 수 있습니다. 동일한 샘플을 2배 및 4배로 희석하여 이 절차를 반복하십시오.이 비디오에서 보여주는 바와 같이, PBS 내의 Forex 세포에 E-G-F-P-P-B-A-E 나노입자를 트랜스펙션하였습니다. 트랜스펙션 효율을 시각적으로 평가하기 위해 형광 현미경 이미징을 수행하였습니다. 이 이미지들은 트랜스펙션된 세포의 형광, 명시야 및 병합 이미지를 보여주며, 병합 이미지에서 볼 수 있듯이 대부분의 세포가 EGFP를 발현하고 정상적인 형태를 유지하고 있습니다.형광 활성 세포군(live population)을 게이팅한 후, 이 그림에서 볼 수 있듯이 형질전환 효율을 정량화하기 위해 유세포 분석을 수행하였습니다. 처리하지 않은 세포군에서는 EGFP 양성 세포가 검출되지 않았습니다. 반면, 처리된 세포의 71.6%가 EGFP 양성으로 나타났습니다. 그 다음 나노 입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis)을 사용하여 나노 입자의 크기 분포와 농도를 결정하였습니다.본 분석에서는 입자 크기 분포가 단분산(mono disperse)인 것이 중요합니다. 이 정보를 바탕으로, 용액 내 플라스미드 농도를 NS 500으로 측정된 입자 농도로 나누어 입자당 평균 플라스미드 수를 계산할 수 있습니다. 입자당 플라스미드 수는 입자 크기 분포를 반영하는 분포입니다.샘플 내에는 입자당 플라스미드 값이 평균보다 큰 더 큰 입자들과, 입자당 플라스미드 값이 평균보다 낮은 더 작은 입자들이 존재하게 됩니다. 이 절차를 수행할 때, 나노입자를 세포에 첨가하기 전까지 분해성 폴리머가 수성 용매에 너무 오래 머물지 않도록 주의하는 것이 중요하며, ncy를 사용하기 위해서는 크기 측정에 적합하게 희석 배수를 조정하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, 비바이러스성 유전자 전달 폴리머를 이용하여 부착성 세포 유형에 형질전환시키는 방법과 형질전환 효율 및 입자 크기 분포를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.인체 세포를 다루는 작업은 생물학적 위험이 따르므로 주의하십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구를 착용하고 생물안전 작업대(biosafety cabinet) 내에서 작업하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서 디블록 공동 폴리머를 사용하여 폴리머 기반 nanoparticles를 합성하는 nanoprecipitation 방법을 설명합니다. 우리는 디블록의 합성 공동 고분자, nanoprecipitation 기술, 그리고 잠재적인 애플 리케이션을 설명합니다.

Nanoprecipitation 기법을 통해 디블록 고분자 Nanoparticles의 제형

B 타입 젤라틴 기반 공학 nanovectors 시스템 (GENS)은 췌장암의 치료 체계 유전자 전달 및 transfection을 위해 개발되었습니다. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) nanparticles의 표면에 특정 펩타이드와 수정함으로써, 그들은 EGFR 수용체에서 대상 수와 같은 높은 세포내 글루타티온의 농도로, 환경을 감소 밑에 플라스미드 놓습니다.

표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

이 원고는 살아있는 세포에서 직접 형광 표지된 나노 입자의 세포내이입 후 세포 내 유전자 발현을 검출할 수 있는 새로운 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포의 조작을 필요로 하지 않으며 표적 유전자 또는 종에 대해 제한되지 않습니다.

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

나노 의약품의 생체 내 성능에 대한 이해가 부족하여 임상 번역이 지연됩니다. 종양 보유 면역 능력이 있는 마우스에서 전신, 조직, 단세포 및 세포 내 수준에서 암 나노의약품의 생체 내 거동을 평가하는 절차가 여기에 설명되어 있습니다. 이 접근 방식은 연구자가 임상 번역을 위한 유망한 암 나노의약품을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

나노 소재 기초 과학 및 변환 응용 프로그램에 대 한 제어 치료 납품의 다양 한 메커니즘을 제공 하지만 그들의 제조를 종종 가장 생물 의학 연구소에서 제공 하는 전문. 여기, 우리가 현재 확장 가능한 제조 및 플래시 nanoprecipitation를 사용 하 여 다양 한 자기 조립된 nanocarriers의 치료 로드에 대 한 프로토콜.

급속 하 고, 확장 가능한 어셈블리 및 플래시 Nanoprecipitation 통해 다양 한 합성 Nanocarriers에 생리 활성 단백질의 Immunostimulants 로드

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

이 프로토콜은 Rayleigh 분해를 비바이러스성 mRNA 벡터의 에어로졸라이징을 위한 가벼운 과정으로 제시합니다. 에어로졸화된 mRNA 벡터의 지역적 침착은 앨버타 이상화된 비강 입구(AINI) 모델로 평가됩니다. 인간 폐세포 내 녹색 형광 단백질(GFP) 발현은 에어로졸화 후 mRNA 벡터의 물리화학적 및 생물학적 기능 유지를 나타냅니다.

레이리 분해 에어로졸을 통한 mRNA 폴리플렉스의 비강 전달: 비강 증착 및 기능 검사를 위한 시험 관 내 방법

배우세요 고분자 나노입자를 이용한 비바이러스 유전자 전달 실험 방법을. 나노입자 추적 분석과 고처리량 유동 세포 계측법으로 전달 효율을 정량 평가하여 유전자 치료 연구에 활용합니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

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