경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

이 절차의 전반적인 목적은 경쟁적 마우스 골수 이식 모델에서 공여 세포의 생착률을 정량화하기 위해 PCR 기반 기술을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 수컷 공여 세포를 사용하여 암컷 수용 마우스에 골수 이식을 수행함으로써 이루어집니다. 다음으로, 서로 다른 시점에서 수용 마우스로부터 말초혈을 채취하고 게놈 DNA를 분리합니다. 이후 표준 곡선을 작성하기 위해 샘플을 준비합니다.

마지막으로, 표준 샘플과 테스트 샘플을 이용하여 실시간 PCR을 수행합니다. 최종적으로, 남성과 여성 DNA의 알려진 비율을 이용한 표준 곡선 대비 계산을 통해 여성 수용 마우스 내에 남성 공여자 유래 세포가 생착되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 유세포 분석 기반 방법과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 민감도가 더 높고 경제적이며, 샘플을 장기간 보관할 수 있다는 점입니다.

가장 중요한 점은, 본 기술이 염색체 독립적이며, 공여 세포와 수 recipient 세포를 구별하기 위해 잘 정의된 세포 표면 마커와 같이 생쥐의 어떤 유전적 배경에서도 사용 가능하다는 것입니다. 층류 후드(laminar flow hood) 아래에서 수컷 공여 생쥐와 암컷 FVB nj 생쥐를 안락사시킨 후, 작은 가위와 핀셋을 사용하여 대퇴골과 경골을 적출하여 5% 열 불활성화 FBS가 포함된 6mL의 차가운 RPMI 1640이 담긴 60mm 조직 배양 접시에 넣습니다. 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 근육 및 기타 조직을 제거하고, 접시 내에서 각 뼈 샤프트의 양끝을 절단합니다. 그런 다음 뼈의 끝부분을 5% 열 불활성화 FBS가 포함된 RPMI 1640이 채워진 3cc 주사기에 연결된 23게이지 바늘에 연결하여 골수를 세척하여 추출합니다.

동일한 바늘을 사용하여 반복적으로 흡인함으로써 골수 조직을 해리합니다. 세포 현탁액을 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고 400 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 세포를 상온의 적혈구 용해 버퍼 1 milliliter에 재현탁하고 상온에서 5분 동안 배양합니다. 그 후 5% heat inactivated FBS가 포함된 RPMI 1640 5~10 milliliter를 첨가하고, 세포를 세포 스트레이너에 통과시켜 여과액을 새 튜브에 수집합니다. 세포를 400 G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하면, 펠렛에서 붉은색이 사라져 적혈구가 완전히 제거되었음을 확인할 수 있습니다. 5% heat inactivated FBS가 포함된 RPMI 1640 10 milliliter에 재현탁한 후 가볍게 볼텍싱하고, 소량을 헤모사이토미터에 분주하여 세포 수를 측정합니다.

골수 이식을 위해 공여 세포와 경쟁 암컷 세포를 5:2 비율로 혼합하는 데 필요한 세포 부피를 계산합니다. 세포 주입을 위한 최종 준비 단계로, 골수 이식 4~6시간 전에 공여 세포와 경쟁 세포를 혼합하여 세포를 펠렛화하고 PBS로 세척한 다음, 최종 농도가 공여 세포는 5×10⁶/mL, 경쟁 세포는 2×10⁶/mL가 되도록 PBS에 재부유합니다. 암컷 수혜 쥐에게 cesium 137 감마선을 11 Gy 단일 용량으로 조사합니다.

방사선 조사된 암컷 마우스를 마우스 보정기에 넣고, 혈액 샘플 채취를 위해 공여 세포와 경쟁 세포 혼합액을 꼬리 정맥을 통해 총 0.1 mL 부피로 주입하여 각 마우스가 5 × 10⁵개의 공여 세포와 2 × 10⁵개의 경쟁 골수 세포를 받도록 합니다. 마우스를 마취시킨 후, 안와하 정맥 채혈을 통해 EDTA 코팅 튜브에 약 50 µL의 혈액을 수집합니다. 또한 연령이 일치하는 수컷 및 암컷 마우스로부터 샘플을 수집합니다.

다음으로 대상 마우스와 대조군 마우스로부터 게놈 DNA를 분리합니다. 표준 곡선을 위해, 각 혈액 샘플에 실온의 RBC 용해 버퍼 약 200 µL를 첨가하고 5분 동안 배양합니다. PBS 1 mL를 첨가하고 원심 분리하여 용해된 대부분의 RBC를 제거합니다.

그런 다음, 용출 버퍼를 37 °C로 예열한 후 혈액 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 수율을 높이기 위해 각 샘플의 DNA 농도를 측정합니다. OD 260/280 비율이 1.8에서 2.0 사이인 샘플을 후속 분석에 사용합니다.

표준 곡선을 설정하려면, 수컷 및 암컷 DNA를 4 ng/µL 농도로 희석하고 다음 지침에 따라 DNA 혼합물을 준비하십시오. Cyber Green Super Mix 시약과 여기에 표시된 프라이머 및 게놈 DNA를 혼합하여 PCR 반응 플레이트를 구성합니다. 각 20 µL 반응액에는 각 프라이머 400 nM과 혈구 게놈 DNA 5 µL가 포함되며, 3회 반복 실험(triplicate)으로 진행합니다.

텍스트 프로토콜에 기재된 조건에 따라 PCR을 수행하여 사이클 임계값(cycle threshold) 또는 CT 값을 구합니다. delta CT 곱하기 수량 CT의 ZY1 승 마이너스 CT의 BCL2 승, 그리고 ZY1 발현 수준 또는 2의 마이너스 delta CT 승을 계산합니다. 혼합물 내의 알려진 남성 DNA 백분율에 대해 3회 반복 측정된 2의 delta CT 승 평균값을 플롯하여 선형 회귀 피팅이 표시된 표준 곡선을 생성합니다. 다음은 남성 DNA 백분율 대비 2의 delta CT 승 평균값으로 플롯한 표준 곡선의 예시입니다.

이 도표에는 각각 78.5°C와 88.5°C에서 나타나는 BCL2 및 ZFY1 증폭 산물의 특이적 융해 온도가 포함되어 있습니다. BCL2는 각 PCR 반응에 로딩된 총 DNA 양을 정규화하기 위한 참조 유전자로 사용됩니다. 각 표준 시료의 BCL2 증폭 곡선은 수컷 DNA 농도와 상관없이 서로 일치하며, 이는 로딩된 DNA 양이 동일함을 나타냅니다.

하지만, PIM TKO 마우스의 샘플 조혈모세포 내 수컷 DNA 양이 증가함에 따라 ZFY 하나의 증폭 곡선이 왼쪽으로 이동했습니다. PIM TKO 마우스는 치사량의 방사선을 조사한 마우스의 재구성을 하는 데 결함이 있었으며, 예상대로 PIM TKO 세포를 이식받은 수신 마우스는 야생형 세포를 이식받은 마우스에 비해 수컷 세포의 비율이 훨씬 낮았습니다. 당사의 방법을 검증하기 위해, 야생형 또는 PIM 트리플 녹아웃(TKO) 마우스의 골수 세포를 이식받은 암컷 마우스에서 공여 수컷 세포의 생착 여부를 이식 후 서로 다른 시점인 6주 차의 말초혈액과 16주 차의 골수 샘플에서 분석하였습니다. 이 비디오를 시청하신 후 분석해 보시기 바랍니다.

경쟁적 해양 골수 이식 모델에서 공여 세포의 생착 정도를 정량화하기 위한 PCR 기반 방법의 사용법을 충분히 숙지하고 있어야 합니다.