Name: 경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 학습하세요 경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 수량 실시간 PCR을 사용하여 기증자 세포 Engraftment를 정량화하는 방법을. 이 기술은 유전자 배경에 관계없이 다양한 손쥐 계통에 적용 가능하며, 유동세포측정법보다 민감하고 경제적인 대안을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 그의 실시간 PCR 기계의 사용 찰스 박사 그린버그 감사드립니다. 이 작품은 MUSC 홀 링스 암 센터 시작 기금, 홀 링스 암 센터 ACS IRG, ASCO 암 재단 경력 개발 상을 정복, NIH 1K08HL 103780-01A1, 그리고 NIH 3P30CA138313-01S3에 의해 지원됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 건강 또는 다른 기금 대리인의 국립 연구소의 공식 전망을 대표하지 않습니다.

1. 골수 세포 절연 <ol><li> 남성 기증자 FVB / NJ 마우스와 경부 전위 다음 CO 2 방법을 사용하여 여성 FVB / NJ 쥐를 안락사시켜야. 여성 FVB / NJ 골수 세포 경쟁 세포로 사용됩니다. </li><li> 마우스의 대퇴골과 tibiaes을 해부 5 % 열 inactivated FBS 6 ML 얼음처럼 차가운 RPMI1640을 포함하는 60mm 조직 배양 접시에 넣고, 작은 가위와 집게를 사용하십시오. 근육과 다른 조직을 제거 kimwipe 조직을 사용합니다. 접시에 각각의 뼈 샤프트의 양쪽 끝을 잘라. </li><li> 3 CC의 주사기에 23G 바늘로 뼈의 끝을 연결 그릇에 5% 열 inactivated FBS와 RPMI1640과 골수를 제거. 같은 바늘을 사용하여 반복 열망에 의해 골수 조직을 Disaggregate. 15 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 400 XG에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운, 표면에 뜨는을 제거, (155 MM P 상온 적혈구 용해 버퍼 1 ML에있는 세포를 resuspendotassium 중탄산염, 10 밀리미터 염화 암모늄, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), = 7.4 PH 0.1 ㎜)와 5 분 동안 실온에서 배양 한 다음 5% 열 inactivated FBS와 RPMI 1640의 5-10 ML를 추가합니다. </li><li> 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 새로운 튜브에 이르기까지의 흐름을 수집합니다. 400 X g에서 5 분을 위해 스핀 다운. 표면에 뜨는을 제거하고, 세포 펠렛은 붉은 색이 포함되어서는 안됩니다. 붉은 색의 부재는 적혈구의 전체 제거를 나타냅니다. 5% 열 inactivated FBS와 RPMI1640의 10 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend. 확인을 부드럽게 소용돌이 세포 현탁액은 완전히 균일입니다. 나누어지는 가지고 hemacytometer에서 셀을 계산합니다. 계산 얼마나 많은 골수 이식과 나누어지는 충분한 세포에 필요한 세포의 볼륨과 5시 2분의 비율에서 경쟁 암 세포를 가지고 남성 기증자 세포를 섞는다. 400 XG에서 5 분을 위해 스핀 다운, 2에서 5 × 10 6 / ML 및 경쟁 세포에 공여 세포의 최종 농도로 PBS에 PBS로 resuspend을 씻어 × 10 6 </suP&gt; / ML. </li></ol> 2. 경쟁 골수 이식 <ol><li> 골수 이식 전에 11Gy 4-6 시간의 단일 복용에 137Cs 감마 선 방열기로 비추다 여성받는 마우스 (세 8-12 wks). </li><li> 마우스 restrainer의 방사능 여성 마우스를 놓습니다. 각 마우스가 5 × 10 5 기증자 세포 2 × 10 5 경쟁자 골수 세포를받는 등 총 볼륨의 0.1 ML의 꼬리 정맥을 통해 혼합 기증자와 경쟁 세포를 주입. </li></ol> 3. 샘플 수집 커플 주 골수 이식 후 마취 상태에서 역 궤도 출혈에 의해 여성받는 마우스의 말초 혈액 샘플 (~ 50 μl)를 수집합니다. 샘플은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 코팅 튜브로 수집하고 있습니다. BM 샘플도 설명 이전과 동일한 절차 (1 단계)로, 보통 최소 4 개월 후 이식, 실험의 끝에서 수집 될 수있다;의 보통 20~40%한 경골 BM 세포는 DNA의 충분한 양을 만들 정도로 수 있습니다. 혈액 또는 BM 샘플 시대의 검색 일반 여성과 남성 생쥐는 표준 곡선을 준비하기 위해 수집됩니다. 4. 게놈 DNA 절연 <ol><li> 각 혈액 샘플에 방 온도 RBC 용해 버퍼의 4 × 볼륨 (~ 200 μl)를 추가합니다. 잘 섞은 후 5 분 동안 실온에서 알을 품다. PBS 1 ML을 추가 한 다음 lysed RBC의 대부분을 제거하는 스핀 다운. </li><li> 혈액 DNA 추출 키트 (QIAmp의 DNA 혈액 추출 키트)를 사용하여 DNA를 분리합니다. 37 번 프리 따뜻한 용출 버퍼 (AE) ° C 용출 DNA의 수율을 향상 할 수 있습니다. 표준 곡선에 대한 남성과 여성의 DNAs은 마찬가지로 격리되어 있습니다. </li><li> (선택 사항) 게놈의 DNA가 더 정화 또는 3 M의 아세트산 나트륨 (산도 = 5.5)의 존재에 EtOH 침전 방법을 사용하여 집중 할 수 있습니다. DNA 알약은 다음 즉시 분석을 위해 40-50 μl 증류수에 resuspended하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다. </li><li> DNA의 concentr를 측정Nanodrop ND-1000 스펙트럼의 측광과 ation. OD 260 / 1.8-2.0 사이의 280과 샘플은 추가적인 분석을 위해 사용됩니다. </li><li> 50 μl의 총 볼륨에 4ng/μl 할 DNAase 무료 H 2 O와 DNA를 희석. </li></ol> 5. 표준 곡선 준비 4 NG / μl의 농도에 남성 DNA와 여자 DNA를 희석하고, Table1에 따르면 DNA 혼합물을 <table border="1"><tbody><tr><td> 여성 배경에서 남성의 DNA의 비율 (%) </td><td> 4ng/μl 남성 DNA의 양 (μl) </td><td> 4ng/μl 여성 DNA의 양 (μl) </td><td> 총 볼륨 (μl) </td></tr><tr><td> 0.2 </td><td> 1 </td><td> 499 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 1 </td><td> 199 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 195 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 12.5 </td><td> 25 </td><td> 175 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 87.5 </td><td> 175 </td><td> 25 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 200 </td><td> 0 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> 표준 곡선에 대한 표 1. 샘플 준비. 8 12wks 세의 나이에 일반 남성과 여성의 FVB / NJ 쥐들이 희생되었습니다. 혈액 및 BM 세포가 수집되었습니다. 남성 셀과 여성 셀에서 DNAs은 4ng/μl의 농도에서 분리하고 다시 중지되었습니다. 남성과 여성의 DNAs은 DNA 표준 샘플 혼합물을 생성하기 위해 다양한 비율로 혼합되었다. 6. 실시간 PCR <ol><li> 프리 머와 게놈 DNA와 SYBR 그린 supermix 시약을 혼합하여 PCR 반응 판을 설정합니다. 반응 볼륨 (20 μl)는 각 반응의 각 프라이머 및 혈액 세포 게놈의 DNA (4ng/μl X5의 μl = 20 NG)의 5 μl 400 nm의가 포함되어 있습니다. DNA samp레와 기준은 세중의에 설립되었습니다. 프리 머의 시퀀스는 표 2에 표시됩니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 유전자 이름 </td><td> 앞으로 </td><td> 역 </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> 5&#39;-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA </td><td> 5&#39;-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG </td></tr><tr><td> Zfy1 </td><td> 5 TGGAGAGCCACAAGCTAACCA </td><td> 5&#39;-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC </td></tr></tbody></table> 손쥐 Bcl2 및 Zfy1에 대한 표 2. RT-PCR의 프라이머 순서. <ol start="2"><li> 다음 조건 Biorad iQ5 PCR 기계를 사용하여 PCR 반응을 수행 95 ° C 3 분, 95의 42 증폭 사이클 ° 10 초에 C, 58 ° 15 초 25 초 72 ° C에 대한 C, 녹는 곡선 다음 단계. </li><li> 바이오 RAD iQ5 2.1 일반용 광학 시스템에 의해 순환 임계 값 (CT) 값을 가져옵니다. 계산 δCt (CT Zfy1 &lt;/) 값을&gt; - CT Bcl2를 한모금하고, Zfy1 표현 수준은 2 δ CT의 값으로 계산됩니다. </li><li> 알려진 여성 / 남성 표준 혼합물로부터 2 δCt 읽기를 사용하여 각 반응 시리즈 표준 곡선을 설정합니다. 표준 곡선은 선형 회귀 피팅과 혼합에 알려져 % 남성 DNA에 triplicates의 2 δCt 값의 평균을 플로팅에 의해 생성됩니다. </li></ol>

<ol><li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%2C+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li>
<li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316(2010).</li>
<li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li>
<li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FVB%2FN%3A+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li>
<li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li>
<li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum%3A+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li>
<li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894(2008).</li>
<li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li>
<li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li>
<li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+%28Zfy-1+and+Zfy-2%29+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes & development. 4, 63-74 (1990).</li>
<li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+PIM+serine%2Fthreonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li>
</ol>

우리는 금융 이익은 공개 경쟁 없습니다.

현재 연구의 목적은 고객에게 경쟁력있는 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 engraftment을 수량화 할 수있는 PCR 기반 기술을 제공하는 것입니다. 여러 연구 이식 모델 9-10에 공여 세포를 감지 할 수 RT-PCR을 사용하여보고되었습니다. 박사 Schwarzenberger의 그룹은 먼저 Y-염색체 별 8 증폭하기 위해 실시간 PCR을 사용하여 손쥐 골수 이식 모델을 개발했습니다. 이 방법은 HSC 활동 11 Gli-1 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 더 프로토콜을 수정 및 시각화 형식으로 상세한 단계별로 실험 프로토콜을 제공했습니다. 우리 프로토콜의 시각화 프레젠테이션은 청중이 쉽게 우리의 프로토콜을 수행 할 수 있습니다. 우리는 또한 말초 혈에서 BM 샘플을 비교 DNA의 게놈 DNA를 사용하여 PCR 결과를 비교했다. BM 및 혈액 샘플에서 기증 engraftment 데이터는 기본적으로 일관성이 있지만, 보통 덜 변화는 BM 샘플에서 발견되었...

손쥐 골수 (BM) 이식 모델이 처음 1960 년대 1 개발되었습니다. 이 모델은 광범위하게 기증 조혈 줄기 세포 (HSC) 호스트받는 마우스 생물학 연구에 사용되었습니다. 손쥐 골수 이식 모델은 HSC 기능과 규제에 대한 귀중한 지식으로 우리를 제공하고 HSC 연구에 필수 불가결합니다. C56Bl/6J CD45.2 - B6.SJL CD45.1 같은 C57Bl/6J H2b-Balb / C H2d 또는 congenic 이식 모델 같은 Allogeneic 골수 이식 모델은 효과, HSC 활동 2 유전자 기능을 연구하기 위해 여러 실험실에서 사용되는 이러한 이식 - 대 - 호스트 질병 (GvHD) 4 등 HSC 기능 3 이식 관련 질환에 대한 약물 치료. 이러한 MHC haplotype 또는 CD45.1 등의 세포 표면 마커는 일반적으로받는 사람 - 유래 세포에서 구별 기증자 파생 셀에 사용됩니다. C57Bl/6J H2b, CD45.2 </su기증자 세포 기여 쉽게 CD45.1 대 CD45.2 또는 H2b 대를 측정 유동 세포 계측법에 의해 평가 될 수 있기 때문에 P는&gt;, Balb / C H2d 및 B6.SJL CD45.1는 골수 이식에서 가장 일반적으로 사용되는 마우스 변종 아르 H2d. 그러나, 이러한 FVB / NJ 5 C3H 등 여러 다른 변종은 종종 유전 공학 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스를 생성하는 데 사용됩니다. 이 마우스는 타고난 줄에 backcrossed와 혼합 MHC / 유전 배경에서 유지 될 수 있습니다. 기증자 특정 세포 표면 마커를 사용할 수 없습니다 이러한 경우에는 기증자 세포 engraftment 및 HSC 기능을 결정하는 것은 어려울 수 있습니다. 섹스 일치하지 않는 골수 이식의 남부 얼룩으로 기증자 남성 세포를 감지하는 Y-염색체 특정 DNA 프로브를 사용하면 첫째 박사 미와의 그룹 6 개발되었습니다. 그런 다음 섹스를 결정 지역 Y에 대한 실시간 PCR은 교장 quantitate 할 수있는 정확하고 구체적인 방법으로 발견되었다산모 혈액 시스템 7 르 태아 세포. 이 개념은 공여 세포 engraftment 8 결정하는 손쥐 골수 이식 모델에서 실시간 PCR 기술의 개발을위한 박사 Schwarzenberger의 그룹에 의해 조정되었다. 우리는 더 FVB / NJ 마우스 골수 이식 모델에서 기증자 세포 engraftment의 측정을 위해이 방법을 수정했습니다. 이 방법은 현재 광범위하게 HSC 생물학 Pim1 키나제의 역할을 공부에 대한 우리의 그룹에 사용된다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> inactivated 열 </td></tr><tr><td> 염화 암모늄 </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> 칼륨 중탄산염 </td><td> 어부 </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA 혈액 minikit </td><td> Qiagen </td><td> 51,106 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 </td><td> bioscience BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ의 SYBR 그린 supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 실시간 PCR 기계 </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 스펙트럼 측광 </td><td> ND-1000 Nanodrop </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 engraftment를 확인하려면 수량 실시간 pcr을 사용하여

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

손쥐 골수 이식 모델은 조혈 줄기 세포 (HSC) 기능과 결정 유전자 / HSCs를 조절 분자를 측정에 중요한 도구를 제공합니다. 이러한 이식 모델 시스템에서 HSCs의 기능이 합치다 및 reconstitute lethally 방사능받는 마우스에 이러한 세포의 능력에 의해 결정됩니다. 일반적으로, 기증자 세포 기여 / engraftment는 유동 세포 계측법을 사용하여 기증자 특정 세포 표면 단백질에 대한 항체에 의해 측정됩니다. 그러나,이 방법은 크게 특이성 및 모든 마우스 변종을 사용할 수 없습니다 수신자 - 유래 세포에서 기증자 파생 세포를 차별화 할 수있는 세포 표면 마커의 능력에 따라 달라집니다. 시장에서 유전자 변형 마우스 변종의 다양한 배경을 고려,이 세포 표면 / 흐름 세포 계측법 기반의 방법은 특히 congenic받는 CE에서 별도의 기증자 세포에 잘 정의 된 표면 마커를 결여 마우스 변종에 상당한 한계를 가지고있다재편. 여기, 우리는 이식받는 마우스에 기증자 세포 engraftment / 공헌을 결정하는 PCR 기반 기술을 발표했다. 우리는 lethally 방사능 congenic 여성 마우스로 남성 기증 골수 HSCs를 이식. 주변 혈액 샘플은 다른 시간 지점 게시물 이식에서 수집되었다. 골수 샘플은 실험의 끝에 획득했다. 게놈 DNA의 고립 된와 Y 염색체 특정 유전자 Zfy1은 정량 실시간 PCR을 사용하여 증폭되었다. 여성받는 쥐 남성 기증자 파생 세포의 engraftment는 남성 대 여성 DNAs의 알려진 비율과 표준 곡선으로부터 계산되었다. Bcl2은 전체 DNA 금액을 정상화 할 수있는 참조 유전자로 사용되었다. 우리의 데이터는 접근이 안정적으로 공여 세포 engraftment을 결정하고 손쥐 골수 이식 모델에서 조혈 세포 reconstitution을 측정에 유용하면서도 간단한 방법을 제공합니다 것을 제안했습니다. 우리의 방법은 정기적으로 대부분의 실험실에서 수행 할 수 있기 때문에 더이러한 유동 세포 계측법과 같은 비용이 많이 드는 장비가 필요합니다.

그림 1과 2는 표준 곡선의 예는 남성 DNA의 비율에 대한 2 δCt의 평균 값으로 꾸몄다 보여 주었다. 그림 1A는 각각, 78.5 ° C와 88.5 ° C에서 지역화 Bcl2 및 Zfy1 amplicons에 특정 녹는 온도를 보여 주었다. Bcl2는 각 PCR 반응에로드 DNA의 총 양을 정상화 할 수있는 참조 유전자로 사용됩니다. 각 표준 시료에 대한 Bcl2 증폭 곡선 (로그보기)로드의 DNA (그림 1B)의 동등한 양을 나타내는 남성 DNA 농도의 독립적 인 서로 병합합니다. 그러나, Zfy1 증폭 곡선은 샘플에서 남성의 DNA의 증가 금액 (그림 1C)와 왼쪽으로 마이그레이션. 우리의 방법의 유효성을 검사하기 위해, 우리는 다른 시간 지점 게시물 이식에 WT 대 핌 트리플 한방 (망가) 마우스에서 BM 세포를받을 이식 생쥐에서 남성 기증자 세포 engraftm...

기증자 세포 engraftment을 결정하는 것은 잘 정의 phenotypical 마커를 부족 마우스 골수 이식 모델에서 도전을 선물한다. 우리는 여성 이식받는 마우스의 남성 기증자 세포 engraftment을 수량화하는 방법을 설명했다. 이 방법은 HSC 기능의 연구에 대한 모든 마우스 변종에 사용할 수 있습니다.

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

이 절차의 전반적인 목적은 경쟁적 마우스 골수 이식 모델에서 공여 세포의 생착률을 정량화하기 위해 PCR 기반 기술을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 수컷 공여 세포를 사용하여 암컷 수용 마우스에 골수 이식을 수행함으로써 이루어집니다. 다음으로, 서로 다른 시점에서 수용 마우스로부터 말초혈을 채취하고 게놈 DNA를 분리합니다. 이후 표준 곡선을 작성하기 위해 샘플을 준비합니다.마지막으로, 표준 샘플과 테스트 샘플을 이용하여 실시간 PCR을 수행합니다. 최종적으로, 남성과 여성 DNA의 알려진 비율을 이용한 표준 곡선 대비 계산을 통해 여성 수용 마우스 내에 남성 공여자 유래 세포가 생착되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 유세포 분석 기반 방법과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 민감도가 더 높고 경제적이며, 샘플을 장기간 보관할 수 있다는 점입니다.가장 중요한 점은, 본 기술이 염색체 독립적이며, 공여 세포와 수 recipient 세포를 구별하기 위해 잘 정의된 세포 표면 마커와 같이 생쥐의 어떤 유전적 배경에서도 사용 가능하다는 것입니다. 층류 후드(laminar flow hood) 아래에서 수컷 공여 생쥐와 암컷 FVB nj 생쥐를 안락사시킨 후, 작은 가위와 핀셋을 사용하여 대퇴골과 경골을 적출하여 5% 열 불활성화 FBS가 포함된 6mL의 차가운 RPMI 1640이 담긴 60mm 조직 배양 접시에 넣습니다. 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 근육 및 기타 조직을 제거하고, 접시 내에서 각 뼈 샤프트의 양끝을 절단합니다. 그런 다음 뼈의 끝부분을 5% 열 불활성화 FBS가 포함된 RPMI 1640이 채워진 3cc 주사기에 연결된 23게이지 바늘에 연결하여 골수를 세척하여 추출합니다.동일한 바늘을 사용하여 반복적으로 흡인함으로써 골수 조직을 해리합니다. 세포 현탁액을 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고 400 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 세포를 상온의 적혈구 용해 버퍼 1 milliliter에 재현탁하고 상온에서 5분 동안 배양합니다. 그 후 5% heat inactivated FBS가 포함된 RPMI 1640 5~10 milliliter를 첨가하고, 세포를 세포 스트레이너에 통과시켜 여과액을 새 튜브에 수집합니다. 세포를 400 G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하면, 펠렛에서 붉은색이 사라져 적혈구가 완전히 제거되었음을 확인할 수 있습니다. 5% heat inactivated FBS가 포함된 RPMI 1640 10 milliliter에 재현탁한 후 가볍게 볼텍싱하고, 소량을 헤모사이토미터에 분주하여 세포 수를 측정합니다.골수 이식을 위해 공여 세포와 경쟁 암컷 세포를 5:2 비율로 혼합하는 데 필요한 세포 부피를 계산합니다. 세포 주입을 위한 최종 준비 단계로, 골수 이식 4~6시간 전에 공여 세포와 경쟁 세포를 혼합하여 세포를 펠렛화하고 PBS로 세척한 다음, 최종 농도가 공여 세포는 5×10⁶/mL, 경쟁 세포는 2×10⁶/mL가 되도록 PBS에 재부유합니다. 암컷 수혜 쥐에게 cesium 137 감마선을 11 Gy 단일 용량으로 조사합니다.방사선 조사된 암컷 마우스를 마우스 보정기에 넣고, 혈액 샘플 채취를 위해 공여 세포와 경쟁 세포 혼합액을 꼬리 정맥을 통해 총 0.1 mL 부피로 주입하여 각 마우스가 5 × 10⁵개의 공여 세포와 2 × 10⁵개의 경쟁 골수 세포를 받도록 합니다. 마우스를 마취시킨 후, 안와하 정맥 채혈을 통해 EDTA 코팅 튜브에 약 50 µL의 혈액을 수집합니다. 또한 연령이 일치하는 수컷 및 암컷 마우스로부터 샘플을 수집합니다.다음으로 대상 마우스와 대조군 마우스로부터 게놈 DNA를 분리합니다. 표준 곡선을 위해, 각 혈액 샘플에 실온의 RBC 용해 버퍼 약 200 µL를 첨가하고 5분 동안 배양합니다. PBS 1 mL를 첨가하고 원심 분리하여 용해된 대부분의 RBC를 제거합니다.그런 다음, 용출 버퍼를 37 °C로 예열한 후 혈액 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 수율을 높이기 위해 각 샘플의 DNA 농도를 측정합니다. OD 260/280 비율이 1.8에서 2.0 사이인 샘플을 후속 분석에 사용합니다.표준 곡선을 설정하려면, 수컷 및 암컷 DNA를 4 ng/µL 농도로 희석하고 다음 지침에 따라 DNA 혼합물을 준비하십시오. Cyber Green Super Mix 시약과 여기에 표시된 프라이머 및 게놈 DNA를 혼합하여 PCR 반응 플레이트를 구성합니다. 각 20 µL 반응액에는 각 프라이머 400 nM과 혈구 게놈 DNA 5 µL가 포함되며, 3회 반복 실험(triplicate)으로 진행합니다.텍스트 프로토콜에 기재된 조건에 따라 PCR을 수행하여 사이클 임계값(cycle threshold) 또는 CT 값을 구합니다. delta CT 곱하기 수량 CT의 ZY1 승 마이너스 CT의 BCL2 승, 그리고 ZY1 발현 수준 또는 2의 마이너스 delta CT 승을 계산합니다. 혼합물 내의 알려진 남성 DNA 백분율에 대해 3회 반복 측정된 2의 delta CT 승 평균값을 플롯하여 선형 회귀 피팅이 표시된 표준 곡선을 생성합니다. 다음은 남성 DNA 백분율 대비 2의 delta CT 승 평균값으로 플롯한 표준 곡선의 예시입니다.이 도표에는 각각 78.5°C와 88.5°C에서 나타나는 BCL2 및 ZFY1 증폭 산물의 특이적 융해 온도가 포함되어 있습니다. BCL2는 각 PCR 반응에 로딩된 총 DNA 양을 정규화하기 위한 참조 유전자로 사용됩니다. 각 표준 시료의 BCL2 증폭 곡선은 수컷 DNA 농도와 상관없이 서로 일치하며, 이는 로딩된 DNA 양이 동일함을 나타냅니다.하지만, PIM TKO 마우스의 샘플 조혈모세포 내 수컷 DNA 양이 증가함에 따라 ZFY 하나의 증폭 곡선이 왼쪽으로 이동했습니다. PIM TKO 마우스는 치사량의 방사선을 조사한 마우스의 재구성을 하는 데 결함이 있었으며, 예상대로 PIM TKO 세포를 이식받은 수신 마우스는 야생형 세포를 이식받은 마우스에 비해 수컷 세포의 비율이 훨씬 낮았습니다. 당사의 방법을 검증하기 위해, 야생형 또는 PIM 트리플 녹아웃(TKO) 마우스의 골수 세포를 이식받은 암컷 마우스에서 공여 수컷 세포의 생착 여부를 이식 후 서로 다른 시점인 6주 차의 말초혈액과 16주 차의 골수 샘플에서 분석하였습니다. 이 비디오를 시청하신 후 분석해 보시기 바랍니다.경쟁적 해양 골수 이식 모델에서 공여 세포의 생착 정도를 정량화하기 위한 PCR 기반 방법의 사용법을 충분히 숙지하고 있어야 합니다.

using-quantitative-real-time-pcr-to-determine-donor-cell-engraftment

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는...

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

골수 이식은 골수 유래 세포의 유전자형을 변경하는 방법을 제공합니다. 관심 유전자는 골수 유래 세포 및 비 골수 유래 세포 모두에 표현되어있는 경우, 골수 이식이 아닌 골수 유래 세포 유전자형을 변경하지 않고 다른 유전자형에 골수 유래 세포를 변경할 수 있습니다.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

이 비디오는 동종 조혈모세포와 GvHD 유도 비장 동종성 T 림프구를 사용하여 치사량에 방사선 조사를 받은 마우스에서 장 이식편대숙주병(GvHD)의 유도를 보여줍니다. 이 프로토콜은 중증 급성 장 GvHD 모델을 확립하여 질병의 메커니즘을 이해하고 혁신적인 치료 옵션을 개발하는 데 도움이 됩니다.

동종 골수 및 비장 세포 이식을 통한 마우스 모델에서 이식편 대 숙주 질환 유도

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

우리는 단일 T 세포 수용체(TCR) 레트로바이러스 기반 생체 내 발현 시스템을 위한 빠르고 유연한 프로토콜을 제시합니다.  레트로바이러스 벡터는 골수 전구 세포를 transduction하여 TCR 형질전환 마우스의 대안으로 in vivo에서 단일 TCR의 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

이 프로토콜은 세포 분류에 의한 줄기세포의 사전 정제 없이 조혈 줄기세포/전구 세포 기능을 연구하기 위해 경쟁력 있는 마우스 골수 이식 실험을 설정하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

이 원고는 형질도입-이식 마우스 모델을 확립하는 데 사용되는 방법론에 대한 설명을 제공합니다. 골수 이식을 수행할 때 피해야 할 기술적 오류에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 높은 바이러스 역가, transfection/transduction 및 방사선 조사의 중요성에 대한 명확한 이해를 얻어야 합니다.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.

디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

우리는 골수 이식의 세 가지 방법을 설명 (BMT): 총 몸 조사와 BMT, 차폐 조사와 BMT, 그리고 마우스 모델에서 클로날 조혈의 연구를위한 사전 컨디셔닝 (입양 BMT)와 BMT 방법.

클로날 조혈을 연구하기 위해 마우스에 있는 골수 이식 절차

이 프로토콜은 쥐 이종 이식 모델에서 유전자 편집 세포를 포함한 몇 가지 조혈 또는 백혈병 줄기 세포의 대퇴 내 주사를 설명하며, 이를 통해 세포의 빠르고 안전한 이식뿐만 아니라 골수의 연속 분석도 가능합니다.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

학습하세요 경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 수량 실시간 PCR을 사용하여 기증자 세포 Engraftment를 정량화하는 방법을. 이 기술은 유전자 배경에 관계없이 다양한 손쥐 계통에 적용 가능하며, 유동세포측정법보다 민감하고 경제적인 대안을 제공합니다.

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

더 많은 동영상 탐색