배양 세포에서 염색체 준비

이 절차의 전반적인 목표는 GB 밴딩 및 분자 세포유전학 검사를 위해 염색체를 수확하고 준비하는 것입니다. 먼저 세포를 로그 단계로 배양합니다. 그런 다음 smid, hypotonic 및 fixative로 염색체를 수확합니다.

세포 현탁액을 슬라이드에 떨어뜨립니다. 슬라이드 하나를 더럽힙니다. 염색체 준비의 모니터로서 나머지 슬라이드의 GB 밴딩 또는 분자 기술로 진행합니다.

GB 밴딩의 마지막 단계로, 광학 현미경 검사와 핵형 분석으로 염색체를 분석합니다. 궁극적으로 염색체와 핵은 핵형 분석 또는 물고기 ish에 사용할 수 있습니다. 제가 이 방법을 발표하게 된 계기는 다양한 유기체의 다양한 유형의 세포에서 염색체 불안정성을 검출하고 후속 분자 세포유전학 검사에 대한 도움을 요청하는 다른 연구자들의 수요가 높았기 때문입니다.

이 기술은 암을 포함한 많은 선천성 유전 질환의 진단과 궁극적으로 예후에 필수적인데, 이는 진단적인 염색체 재배열을 시각화할 수 있기 때문입니다. 이러한 장애의 경우,이 방법은 다양한 유형의 인간 세포에서 발견되는 염색체 재배열에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 Resus Maca 쥐 및 마우스 배양과 같은 다른 유기체의 세포에도 적용할 수 있습니다.

200만 개의 부착 세포가 80%con 유창성에 결합하고 밀리리터당 10마이크로그램의 10마이크로리터를 추가합니다. 세포 밀리리터당 열. 섭씨 37도의 5%CO2 인큐베이터에서 45분 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 멸균 피펫을 사용하여 배양액의 배지를 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 나중에 세포를 세척하기 위해 2 밀리리터의 HBSS를 플라스크에 넣고 소용돌이 치고 완충액을 제거합니다. 다음으로, 트립신 1ml를 첨가하여 플라스크의 전체 표면을 덮도록 합니다. 대부분의 세포가 분리되면 원뿔형 튜브의 배지를 세포에 다시 피펫으로 주입합니다.

10 밀리리터의 세포 현탁액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 분취합니다. 200G에서 10분 동안 원심분리기. 슈퍼nat을 제거합니다.

펠릿을 10 밀리리터의 75 밀리몰 염화칼륨에 다시 매달아 37 °C의 10 분 배양 후 37 °C로 예열합니다. 200Gs에서 5분 동안 원심분리기. 섭씨 25도에서 0.5 밀리리터의 상등액을 제외한 모든 것을 제거하고 펠릿을 조심스럽게 재현탁시킵니다.

셀에 5ml의 새로운 자동차 소음 고정제를 첨가합니다. 그런 다음 5ml를 더 넣고 200Gs에서 5분 동안 고정제 및 와류 원심분리기를 추가합니다. Resus, 각 세포 펠릿을 5 밀리리터의 고정액에 현탁시킵니다.

세포를 4도에서 최대 1년 동안 보관하십시오. 200Gs에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 섭씨 25도에서.

펠릿을 부드럽게 현탁시킨 후 0.3-0.5밀리리터만 남을 때까지 sup natant를 제거합니다. 피펫을 사용하여 약 2인치 거리에서 셀 현탁액을 약 45도 각도로 기울어진 슬라이드에 떨어뜨립니다. 그리고 서스펜션이 슬라이드를 가로질러 굴러가도록 합니다.

슬라이드에 고정제로 신선한 자동차 소음을 한 방울 떨어뜨립니다. 종이 타월로 슬라이드 뒷면을 밀어 넣은 다음 슬라이드를 완전히 말리기 위해 앉힙니다. 신선한 김 서스테닝 솔루션을 준비합니다.

슬라이드를 염색 선반에 놓습니다. gim sustaining solution의 전체 슬라이드를 덮습니다. 5분 후 증류수 배수구로 슬라이드를 헹구고 자연 건조시킵니다.

슬라이드에 파마 마운트 4방울을 추가하고 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인하기 위해 커버 슬립을 놓습니다. 종이 타월로 마운트당 초과분을 제거하십시오. 10배 및 100배 배율에서 광학 현미경으로 세포를 분석합니다.

중기 세포가 풍부하고 잘 퍼져 있으면 나머지 슬라이드를 다른 실험 절차에 사용할 수 있습니다. 4개의 Copeland 용기에 50ml의 처리 용액을 추가합니다. 각 슬라이드를 1번 항아리에 5초 동안 담급니다.

두 번째 항아리에 슬라이드를 빠르게 헹굽니다. 3번 항아리에 최소 30초 동안 그대로 두십시오. 4번 항아리에 헹구고 슬라이드를 말리십시오.

새로운 GIM 서스테이닝 솔루션을 준비합니다. 슬라이드를 염색 선반에 놓습니다. 김 서스테인링 용액의 전체 슬라이드를 5분 동안 덮습니다.

슬라이드와 증류수를 얼룩진 순서와 같은 순서로 헹굽니다. 그런 다음 최소 10분 동안 건조시킵니다. 앞서 그림과 같이 파마 마운트를 사용하여 커버 슬립을 놓습니다.

그런 다음 광학 현미경으로 나머지 슬라이드에 대한 세포를 분석합니다. 트립신 잠복기 시간을 조정합니다. 첫 번째 슬라이드의 결과를 기반으로 합니다.

성공적인 분석은 잘 퍼져 있고 적합한 염색체 형태를 가진 염색체를 생성합니다. 제대로. GB 줄무늬 염색체는 특징적인 밝은 줄무늬와 어두운 줄무늬 패턴을 포함합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 GB 밴딩을 위해 염색체를 수확하는 방법과 염색체 불안정성을 규명할 때 추가 분자 세포유전학 검사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 수확 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하기만 하면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다. GB 밴딩 절차의 경우 GB 밴드로 진행하기 전에 먼저 하나의 슬라이드에서 트립신 배양 시간을 테스트하는 것이 중요합니다. 나머지 슬라이드.