Name: 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 (MAMs)와 Glycosphingolipid 강화 Microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 성체 마우스 뇌에서 미토콘드리아 관련 ER 막(MAMs)과 글리코스핑고지질 강화 미세영역(GEMs)을 분리하는 방법을. 균질화, 원심분리, 불연속 자당 농도 그래디언트를 활용한 이 기법은 신경과학 및 세포 대사 연구에 활용됩니다.

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우리는 초기 프로토콜을 속에에 레 사노의 공헌을 인정합니다. Ad&#39;A. 유전 및 유전자 치료에 의자를 부자 어린이 (JFC)의 보석상을 보유하고 있습니다. 이 작품은 NIH 보조금 GM60905, DK52025 및 CA021764, 그리고 미국의 레바논 시리아 관련 자선 단체 (ALSAC)에 의해 부분적으로 재정 지원을했습니다.

<html> 다음 프로토콜은 마우스 뇌에서 MAMs과 보석의 절연 및 정화를위한 것입니다 솔루션은 미토콘드리아, MAMs와 보석의 절연이 필요 분류 원유 mitochondrial 준비를 얻기 위해 : 솔루션 A : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO 3, 1 MM MgCl 2, 0.5 MM CaCl 2 + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가) 솔루션 B : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO 3 + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가) MAMs 절연 : 절연 매체 : 250 MM 마니 톨, 5 밀리미터 HEPES의 산도 7.4, 0.5 MM EGTA, 0.1 % BSA 그라디언트 버퍼 : 225 MM 마니 톨, 25 밀리미터 HEPES의 산도 7.5, 1 ㎜ EGTA, 0.1 % BSA (최종 농도) 보석 절연 : 내용 &quot;&gt; GEM 추출 버퍼 : 25 MM HEPES 산도 7.5, 0.15 M NaCl, 1 % 트리톤 X-100 + 프로테아제 저해제 (필요한 경우, 신선한 추가) GEM Solubilising 버퍼 : 50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.8, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가). 1. 첫 번째 단계 Subcellular 분류 : 핵의 제거, Unlysed 세포와 세포 파편 <ol><li> CO 2 챔버에 마우스를 안락사시켜야. </li><li> 즉시 뇌를 제거 절반, 얼음에서 2 ML 튜브에 넣고 무게. </li></ol> 참고 : 전체 절차를 통해 뇌 절반은 별도의 유지. 다음은 하나의 뇌의 절반의 치료에 적용됩니다. <ol start="3"><li> 한 ML 차가운 솔루션 A.이 큰 통관 유봉의 15 총 스트로크와 균질화가 포함 된 사전 차가운 두 ML 유리 다운스 호 모지 조직 분쇄기의 장소 반 뇌. </li><li> 얼음에 15 ML 팔콘 튜브에 전송하고 희석10 권 w / V, 예를 들어 0.225 g에 2.25 ML까지 homogenates. </li><li> 4에 10 분에 1,400 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C. </li><li> 조심스럽게 얼음에 표면에 뜨는과 30 ML 둥근 바닥 유리 원심 분리기 튜브로 전송을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 솔루션 같은 10 권의 펠렛을 Resuspend. 작은 통관 유봉, 한 번에 1 ML의 3-6 뇌졸중과 같은 그라인더에 균질화. </li><li> 4에 10 분 ° C.에 710 XG에 신선한 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기로 전송 핵 및 세포 파편의 펠렛에있는이 결과. </li><li> 주의 단계 1.6에서 저장 한 표면에 뜨는있는 표면에 뜨는과 수영장을 제거합니다. </li></ol> 2. 두 번째 단계 : 조잡 미토콘드리아 절연 <ol><li> 4에 10 분에 13,800 XG에서 supernatants을 원심 분리기 ° C. </li><li> 얼음에 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브를 표면에 뜨는 전송 </li><li> Resuspend 펠릿 10 권 솔루션에. 작은 통관 유봉, 한 번에 1 ML의 3-6 뇌졸중과 같은 그라인더에 균질화. </li><li> 단계 2.1로 원심 분리기. </li><li> 단계 2.2-2.4를 반복합니다. </li><li> 그 결과 펠렛은 풍부한 mitochondrial 분수입니다. 풀 supernatants (세포 기질 및 ER), parafilm으로 커버하고 얼음 계속. </li><li> 작은 통관 유봉 6 획으로 펠렛을 Resuspend, 4.8에 ML / g는 신선한 homogeniser에 솔루션 B의 (g는 원래 뇌의 무게라고합니다). </li><li> 유리 파스퇴르 피펫 사용하여, 신중하게 다음과 같이 관의 맨 ​​아래에이어서 추가 더 거품이 형성되지 않습니다 보장 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브에서 불연속 자당의 그라디언트를 준비 : Resupended 펠렛 (0.32 M의 자당) 3 ML 850 밀리미터 자당 (1 MM NaHCO 3) 3 ML 1 M의 자당 (1 MM NaHCO 3) 3 ML 1.2 M의 자당 (1 MM NaHCO에서3) </li><li> 4 ° C.에서 2 시간에 82,500 XG에 원심 분리기 그라디언트의 끝에서 그 결과 분리는 세 밴드와 펠렛 생산합니다 : - 2) ER, Golgi, 플라즈마 멤브레인 (0.85 M - 1 M 인터페이스) 0.85 M 인터페이스) 1) myelin 및 기타 막 오염 물질을 (0.32 M, 3) synaptosomes (1 M - 1.2 M 인터페이스), 4) 미토콘드리아 원유 (펠렛) 이후 정화 단계에 사용되는 </li></ol> 3. 미토콘드리아 - 관련 ER 막의 절연, MAMs <ol><li> 갓 추가 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 두 ML 절연 매체에 하나의 뇌 절반에서 미토콘드리아 갓 고립 된 원유를 Resuspend. </li><li> 그라데이션 버퍼 8 이분의 일 뇌 당 ML, 그리고 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브의 장소와 30 % Percoll 기울기를 준비합니다. </li></ol> * 참고 : D 후 정확한 최종 농도를 달성하기 위해 (1.43 배) 기울기 버퍼가 더 집중하기30 % Percoll을 iluting. <ol start="3"><li> 준비된 기울기 상단에 레이어 mitochondrial 정지는 천천히 모든 거품을 방지합니다. </li><li> 30 분, 4 ° C.에 95,000 XG에 원심 분리기 </li><li><ol class="lroman"><li> 유리 파스퇴르 피펫으로 FIRST 중공업 비율 (낮은 밴드)를 제거하고 신선한 왕복 아래 유리관에 전송, 얼음. </li><li> 또 다른 유리 파스퇴르 피펫 두 번째는 빛 분수 (위 밴드)를 제거하고 얼음에 별도의 신선한 왕복 아래 유리관에 전송할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 4에 10 분에 6,300 XG에서 10 ML 절연 매체와 원심 분리기와 단계 3.5 수집 된 두 분수 ° C.를 희석 </li><li> 단계 3.6에서 얻어진 중공업 비율의 표면에 뜨는 폐기하십시오 다른 10 ML 절연 매체로 펠렛을 resuspend과 단계 3.6로, 다시 원심 분리기. 그 결과 펠렛은 순수 mitochondrial 분율 될 것입니다. </li><li> 빛 Frac에서 표면에 뜨는을 전송기가 얼음에 울트라 클리어 Beckman의 원심 분리기 튜브에 단계 3.6에서 얻은. 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 1 시간, 4 ° C.에 100,000 XG의 튜브와 원심 분리기를 작성 단계 3.8에서 얻어진 표면에 뜨는에 충분한 절연 매체를 추가 그 결과 펠렛은 MAMs 분수됩니다. 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거하고 폐기합니다. </li></ol> 참고 :이 단계에서, 여러분은 또한 1 시간, 4 십만 XG에 원심 분리기 수 있습니다 ° C 단계 2.6에서 저장 한 표면에 뜨는. 펠렛은 ER 분수이어야하며 Cytosolic 일부를 표면에 뜨는 것입니다. 4. Glycosphingolipid 강화 Microdomains, 보석 추출 <ol><li> 얼음에 20 분에 추출 버퍼 500 μl-1 ML에 순수 미토콘드리아 및 / 또는 이맘 분수를 Lyse. </li><li> 4에서 2 분에 15,300 XG에 lysates을 원심 분리기 ° C. </li><li> supernatants (트리톤 X-100 수용성 물질)와 다시 원심 분리기 알약을 수집2 분에 용해 물질을 남아 제거합니다. (트리톤 X-100은 미토콘드리아 추출 및 / 또는 트라이 튼 X-100 추출 MAMs). </li><li> 버퍼 Solubilising에서 알약을 Solubilize. 이 solubilized 자료는 GEM의 분수를 상징하며 추가적인 분석을 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

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세포 멤브레인 간 또는 세포 소기관과 세포의 플라즈마 막 사이의 접촉의 사이트는 기본 세포 프로세스에 동적 신호 플랫폼을 나타냅니다. 생리학 및 병리학 조건 모두에 따라 자신의 기능과 구성의 정확한 특성은 안정적이고 재현 정화 프로토콜이 필요합니다. 여기에 설명 된 방법은 특별히 성인 마우스의 뇌에서 MAMs와 해당 보석의 절연 및 정화를 위해 우리 실험실에서 최적화되었습니다. 이 프로토콜이 성공적으로 어린이 4 neurodegenerative 신진 대사 질환에 neuronal 세포 사망에 이르는 + 불균형을이 microdomains을 지정하고, 칼슘 2의 apoptotic 경로의 하류를 기초 분자 effectors의 식별을 위해 구현되었습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 분류 </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> 염화 마그네슘, Hexahydrate </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘 염화물, 이수화 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 이맘 </td></tr><tr><td> D-마니 톨 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, 분수 V, 열 충격은 Lyophilizate </td><td> 로슈 </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T9284-500 ML </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 피셔 과학 </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 로슈 </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCL </td><td> 피셔 과학 </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Dodecyl의 황산 (SDS) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 공통의 </td></tr><tr><td> 전체 단백 분해 효소 저해제의 태블릿, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 </td><td> 로슈 </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 2 ML 조용한 전체가 유리로 조직 분쇄기 </td><td> 킴블 체이스 </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔형 원심 분리기 튜브, BD 매 </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ML 라운드 - 하단 유리 원심 분리기 튜브 </td><td> 킴블 체이스 </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 라운드 - 하단 유리 Centrifuge 튜브 </td><td> 킴블 체이스 </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge 튜브, 울트라 클리어, Thinwall, 14x89 mm </td><td> Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> 콜 - Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 (Pasteur) Pipets, 9 &quot; </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-678 - 20C </td><td></td></tr></tbody></table>

미토콘드리아 - 관련 er의 멤브레인 (mams)와 glycosphingolipid 강화 microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

세포 세포 소기관은 모양과 셀 별 고유 및 외부 신호를 받게 아르 구성을 변화와 고도의 동적 구조입니다. 그들의 멤브레인은 종종 신호 분자와 막 구성 요소 1,2,3,4의 교환을위한 허브가 정의 연락처 사이트에서 juxtaposed 있습니다. endoplasmic 소포체 (ER)와 + 채널이 미토콘드리아 관련-ER 멤브레인 또는 MAMs 4,5,6로 알려져 있습니다 IP3에 민감한 칼슘 2 개구에서 미토콘드리아 사이에 형성되는 간 organellar 막 microdomains. 단백질 / 지질 조성과 이러한 멤브레인 연락처 사이트의 생화학 특성을 광범위하게 특히 세포 내 칼슘 2 + 4,5,6을 조절에서의 역할과 관련하여 연구되었습니다. ER은 +,이 용량에서 칼슘이 세포의 하류 공정의 무수한을 조절 세포 칼슘 (2)의 기본 저장소 역할을 + 신호, incl포스트 병진 단백질 접힘, 단백질 maturation7을 uding. 미토콘드리아, 다른 한편으로,이를 통해 하류 칼슘 2 + 불균형 4,8의 apoptotic 경로의 개시를 방지 cytosolic 칼슘 2 + 농도를 버퍼링하여 칼슘 2 + 항상성을 유지하고 있습니다. MAMs의 동적 특성은 그들에게 이상적인 사이트는 칼슘 2 + 신호와 mitochondrial 칼슘 2 + 농도, 지질 생합성 및 수송, 에너지 신진 대사와 세포 생존 4,9,10,11,12 규제 등의 기본적인 세포 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 여러 프로토콜은 간 조직 및 배양 세포 13,14에서 이러한 microdomains의 정화에 대한 설명되었습니다. 계정에 이전에 다음 ID로 출판 방법을 복용, 우리는 성인 마우스의 뇌에서 미토콘드리아와 MAMs의 절연을위한 프로토콜을 적응하고 있습니다. 이 절차에 우리는 추가 정화 단계, 즉 트리톤의 X100 추출을 추가하는 전자nables MAMs의 glycosphingolipid 강화 microdomain (GEM) 분수의 고립. 이러한 GEM의 준비가 플라즈마 막 나 다른 세포 세포막에서 유래 caveolae과 지질 보트와 여러 단백질 구성 요소를 공유하고 수용체 단백질의 클러스터링에 대한 포인트를 수집처럼 단백질 단백질 상호 작용 4,15에 대한 작동하도록 제안하고 있습니다.

우리가 안전하게 MAMs, 보석 및 마우스의 뇌에서 mitochondrial 분수의 절연 및 정화를 위해 추천 할 수 있습니다이 프로토콜을 사용하여와의 경험을 바탕으로. 명시된 절차는 매우 재현과 일치합니다. 그림 1에서 우리는 Percoll 기울기 (단계 3.4)의 방법으로 순수 미토콘드리아와 MAMs 층의 대표 이미지를 보여줍니다. 이맘 분율은 미토콘드리아 위의 확산과 폭 넓은 대역을 구성하는 동안 포함 된 정의, 우유 밴드, ultracentrifuge 튜브의 하단에있는 미토콘드리아 (미토 P) segregates를 정화. 개별 기울기 밴드의주의 회복 후, 정화 분수는 용해 버퍼에 resuspended 아르 SDS의 polyacrylamide 젤에서 분리 PVDF 막을에 blotted. Blots은 다음 분수와 단백질 성분의 순도를 확인합니다 특정 단백질 마커에 대한 항체의 배터리로 탐색합니다. 그림 2A는 cytos의 분포를 보여줍니다고립 된 MAMs과 mit...

이 절차는 성인 마우스 뇌 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 또는 MAMs 및 MAMs과 mitochondrial 준비에서 glycosphingolipid 강화 microdomain 분수에서 분리하는 방법을 보여줍니다.

미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 (MAMs)와 Glycosphingolipid 강화 Microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

이 절차의 전반적인 목적은 마우스 뇌에서 미토콘드리아, 소포체 막, 마이크로 도메인 또는 MAM을 분리하는 것입니다. 정제된 MAM은 추가로 추출되어 당지질 풍부 마이크로 도메인 분획(glyco finger lipid enriched micro domain fractions) 또는 gem을 얻는 데 사용됩니다. 이를 위해 먼저 마우스 뇌를 적출한 후, Dounce homogenizer를 사용하여 특정 완충액 내에서 균질화합니다. 이렇게 얻은 균질액을 저속으로 원심분리하여 핵, 미분해 세포 및 세포 파편을 제거합니다.두 번째 단계는 조분획 미토콘드리아 분획물(crude mitochondrial fraction)을 준비하는 것입니다. 상층액을 추가로 원심분리하여 얻은 펠릿을 재현탁하고, 불연속 설탕 농도 기울기(discontinuous sucrose gradient)를 이용하여 추가로 분리합니다. 다음으로, 조분획 미토콘드리아 분획물을 Percoll 기울기에 적용합니다.원심분리와 여러 번의 세척 단계를 거쳐 정제된 미토콘드리아 분획과 MAMs를 얻습니다. 마지막 단계로, TRITTON X 100이 포함된 용액으로 MAMs를 처리하여 글리코 핑거 지질이 풍부한 미크로 도메인 분획 gem을 추출합니다. 최종적으로, 각 소기관 분획의 특성인 단백질 마커에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 분획의 순도를 검증합니다.기존 방법들과 비교하여 이 절차의 주요 장점은 상대적으로 적은 양의 연구 재료를 사용하여 성체 생쥐 뇌에서 미토콘드리아, 막 및 세포질 분획을 분리할 수 있도록 최적화되었다는 점입니다. 이 최적화된 절차는 재현성이 매우 뛰어나며, 특히 신경생물학 분야의 연구자들이 관심 단백질을 분석하는 데 사용할 수 있을 만큼 충분한 양의 다양한 세포 소기관 분획을 분리할 수 있게 해줍니다. 본 영상에서는 저희 실험실의 기술자가 이 절차를 시연할 것입니다.이산화탄소로 안락사시킨 생쥐로부터 뇌를 적출한 후, 뇌를 절반으로 잘라 이 절차를 시작합니다. 각 절반을 얼음 위에 놓인 별도의 2 mL 튜브에 넣습니다. 미리 냉각시킨 빈 2 mL 튜브를 사용하여 저울의 영점을 맞춘 후 튜브의 무게를 측정하고, 이를 얼음 위에 보관합니다.뇌의 절반을 1 mL의 차가운 분획 용액이 들어있는, 미리 냉각시킨 2 mL 유리 조직 분쇄기에 옮깁니다. 간극이 큰 페스틀(pestle)을 사용하여 총 15회 스트로크로 균질화합니다. 균질물을 얼음 위에 놓인 멸균 15 mL Falcon 튜브에 넣고, 샘플의 무게를 기준으로 차가운 분획 용액 A를 10배 부피가 되도록 희석합니다.그다음 샘플을 4°C에서 1,400 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거하고, 얼음 위에 놓인 30 mL 라운드 바텀 유리 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이어서, 펠렛을 동일한 10배 부피의 분획 용액에 재현탁합니다.동일한 그라인더에서 재부유된 펠렛을 한 번에 1 mL씩 균질화합니다. 이때 간극이 작은 페스틀을 사용하여 3~6회 문지릅니다. 균질화된 시료를 15 mL Falcon 튜브에 모으고 4 °C에서 710 ×g로 10분간 원심분리합니다.그 결과 핵 조각과 세포 잔해물이 생성됩니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 이전 원심분리 단계에서 보관해 둔 상층액과 합칩니다. 미토콘드리아 분리를 시작하기 위해 상층액을 4°C에서 13,800 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오. 그 후, 상층액을 얼음 위에 놓인 UltraClear Beckman 원심분리 튜브로 옮기십시오.미토콘드리아 분획이 포함된 펠릿을 분획 용액 A 10배 부피로 재현탁하고, 1mL씩 순차적으로 균질화합니다. 이때 좁은 간격의 페스틀(Pele)로 3~6회 젓고, 균질화된 시료를 얼음 위의 새로운 30mL 원형 바닥 유리 원심분리 튜브에 모읍니다. 이 단계들을 한 번 더 반복하여 시료를 추가로 정제합니다.균질액을 원심분리합니다. S 상층액을 회수하고, 세포 펠릿을 solution A의 10배 부피로 현탁시킨 후 1mL씩 다시 균질화합니다. 다음 단계는 농축된 미토콘드리아 분획이 포함된 펠릿을 원래 뇌 무게 1g당 4.8mL의 fractionation solution B에 재현탁하는 것입니다. 새 균질기에서 간격이 좁은 페스틀(small clearance pestle)을 사용하여 6회 스트로크로 균질화한 후, 이 균질액을 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 UltraClear Beckman 원심분리관에 불연속 자당 밀도 구배(discontinuous sucrose gradient)를 준비합니다.먼저, 재현탁된 펠릿을 넣은 후 850 mM sucrose 3 mL, 1 M sucrose 3 mL, 마지막으로 1.2 M sucrose 3 mL를 순서대로 추가합니다. 기포가 형성되지 않도록 용액을 바닥부터 천천히 첨가하십시오. 마지막으로 4 °C에서 82,500 ×g로 2시간 동안 원심분리합니다.결과적으로 분리 과정을 통해 세 개의 밴드와 펠릿이 생성됩니다. 펠릿에는 이후 정제 단계에서 사용할 조분리된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다. 뇌 반구 하나에서 갓 분리한 조분리 미토콘드리아를 2 mL의 분리 배지로 재현탁합니다.다음으로, 새로운 UltraClear Beckman 원심분리 튜브에 30% Percoll 구배 용액 8 mL를 넣습니다. 기포가 형성되지 않도록 준비된 구배 용액 위에 미토콘드리아 현탁액을 매우 천천히 층을 이루며 얹습니다. 그 후 구배 분리를 위해 4°C에서 95,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다.먼저, 유리 파스타 피펫을 사용하여 하단 밴드인 무거운 분획을 제거하고, 이를 새로운 라운드 바텀 유리 튜브로 옮깁니다. 해당 튜브는 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 새로운 유리 파스타 피펫을 사용하여 상단 밴드인 가벼운 분획을 제거하고 별도의 새로운 라운드 바텀 유리 튜브로 옮깁니다.이 튜브 또한 얼음 위에 둡니다. 두 분획을 10 mL의 분리 배지로 희석하고 4 °C에서 6,300 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 무거운 분획의 상층액은 버리고 펠릿을 다른 10 mL의 분리 배지로 다시 현탁합니다.동일한 조건으로 샘플을 다시 원심분리합니다. 이때 생성된 펠렛이 순수한 미토콘드리아 분획입니다. 다음으로, 가벼운 분획(light fraction)의 상층액을 얼음 위에 놓인 UltraClear Beckman 원심분리 튜브로 옮깁니다.이 분획의 펠렛은 오염된 미토콘드리아를 포함하고 있으므로 폐기합니다. 가벼운 분획의 상층액에 튜브를 채울 만큼 충분한 분리 배지를 추가하고 4°C에서 100,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다. 생성된 펠렛에는 미토콘드리아 연관 소포체 막 또는 MAMs가 포함되어 있을 것입니다.상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. MAM 분획을 얼음 위에서 500 µL에서 1 mL의 추출 버퍼로 20분 동안 처리하여 glyco finger 지질 농축 미세 도메인 또는 gem의 추출을 시작합니다. 다음으로, 용해물을 4 °C에서 15,300 ×g로 2분 동안 원심분리합니다.상층액을 수집하고 펠렛을 2분 동안 원심분리하여 남아 있는 모든 Triton X-100 가용 물질을 제거한 후, 최종적으로 가용화 버퍼를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다. 이 가용화된 물질은 GEM 분획을 나타내며 이후 분석에 사용할 수 있습니다. 세포질 분획 내 소포체, 세포질 단백질 및 미토콘드리아 마커의 순도와 분포를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였습니다.소포체 분획, 순수 미토콘드리아 분획 및 MAMs 분획입니다. 또한 웨스턴 블롯 결과, gems는 cli의 마커인 cavi in one에 대해 양성을 보였으며, 소포체 및 미토콘드리아 단백질에 대해서는 음성을 나타냈습니다. 반면, Triton X 100으로 추출한 MAMs는 소포체 및 미토콘드리아 마커에 대해 양성을 보였으며, 이 절차를 시도하는 동안 cavi in one은 거의 나타나지 않았습니다.갓 분리한 뇌 조직을 사용하고, 이후 모든 용액, 시료 및 튜브를 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다. 또한, 면역 블로팅(immuno blotting)을 통해 정제 과정의 전반적인 성공 여부를 확인할 수 있도록 분획의 각 단계에서 소량의 시료를 보관하는 것을 권장합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

포유류 뇌 조직에서 미토콘드리아 시각화 및 분석은 어려운 작업입니다. 여기에서는 연속 블록면 주사 전자 현미경(SBFSEM)의 3차원(3D) 재구성 분석을 사용하여 이 중요한 에너지 생성 소기관의 형태학적 및 체적 분석에 대한 통찰력을 얻는 방법을 설명합니다.

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 뇌 미토콘드리아 분석

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

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미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

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깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

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대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

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여기에서는 알츠하이머병(AD) 뉴런에서 신경독성 β-아밀로이드(Aβ) 생성을 실시간으로 증가 또는 유지하여 미토콘드리아 관련 소포체(ER) 막(MAM)의 구성 안정제의 축삭 수송 속도를 측정하여 MAM 안정화를 측정하고 AD 치료제 개발을 돕기 위한 직접적이고 정량적인 지표로 사용하는 방법을 설명합니다.

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Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

미세아교세포에서 정제된 미토콘드리아를 준비하고, N-글리칸 방출을 위한 미토콘드리아 단백질을 분리하고, 고해상도 정밀 질량 분석기 질량 분석기와 결합된 적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전기 분무 이온화를 사용하여 세포 내 미토콘드리아 글라이칸을 신속하게 검출하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다.

글라이칸 분석을 위한 Microglia의 미토콘드리아 제제

배우세요 성체 마우스 뇌에서 미토콘드리아 관련 ER 막(MAMs)과 글리코스핑고지질 강화 미세영역(GEMs)을 분리하는 방법을. 균질화, 원심분리, 불연속 자당 농도 그래디언트를 활용한 이 기법은 신경과학 및 세포 대사 연구에 활용됩니다.

미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 (MAMs)와 Glycosphingolipid 강화 Microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연

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