당뇨병과 신진 대사 메모리의 Zebrafish 모델

신진 대사 메모리는 당뇨병 합병증이 지속하고 euglycemia이 약물 달성 후에도 unimpeded 진행되는이 현상이다. 여기 우리는 신진 대사 메모리의 mitotically 보낼 수있는 epigenetic 구성 요소의 시험을 할 수 있다는 점에서 고유 한 당뇨병 zebrafish 모델을 설명

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 모델을 생성하는 것이며, 이는 진성 당뇨병 합병증의 분자적 기초를 발견하고 더 중요하게는 지속성에 대한 유전적 기초를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 먼저 당뇨병 유발 약물인 STZ를 일련의 주사로 고혈당을 유도하고 낮은 온도에서 물고기를 배양함으로써 달성됩니다. 다음으로, 3주 후, 고혈당 상태가 유도되었는지 확인하기 위해 공복 혈당 수치를 측정하고 베타 세포 회복을 시작하기 위해 약물을 중단합니다.

그런 다음 카우델 핀을 절단하고 재생하여 유전적으로 전염될 수 있는 대사 기억 구성 요소를 분리하고 이전의 고혈당 환경의 잠재적으로 복잡한 요인을 제거합니다. 마지막으로, 핀 재생의 지속적인 감소를 문서화하고 관심 분석을 통해 형질전환 조직에서 유도된 변화를 식별하기 위해 핀 재생 분석이 수행됩니다. 기존 모델에 비해 당뇨병성 제브라피시 모델의 주요 장점은 췌장 이식 후 환자에서 볼 수 있는 것과 비교하여 진정한 U 혈당 환경에서 여름에 대사 기억을 연구할 수 있다는 것입니다.

이 모델은 대사 기억의 기초가 되는 후성유전학적 변형의 발견과 당뇨병 합병증의 지속성을 발견하는 데 활용될 것으로 기대됩니다.당뇨병을 앓고 있는 제브라 피쉬를 생성하기 위해 일반 어수가 있는 회수 탱크와 흄 후드 아래에 두 개의 페녹시에탄올을 1에서 1000 희석한 어수 마취 탱크를 준비합니다. 0.09% 염화나트륨 2밀리리터에 STZ 6mg을 첨가하여 0.3% 스트렙토조토신 또는 STZ 용액을 준비하고 즉시 용액을 별도의 튜브에 있는 얼음에 놓습니다. 조절을 위한 충분한 식염수를 분취하십시오.

물고기는 27 및 2/2 게이지 바늘이 장착된 하프 CC 주사기에 STZ 또는 제어 솔루션을 채워 기포가 갇히지 않도록 합니다. 물고기 한 마리를 마취수에 넣고 수영 동작이 약 1-2분 정도 멈출 때까지 기다립니다. 마취가 끝나면 물고기를 종이 타월 위에 잠시 올려 여분의 물을 흡수한 다음 물고기를 웨이 보트에 넣고 무게를 잰다.

다음으로 물고기를 단단한 표면에 놓습니다. 그런 다음 베벨을 지나 바늘을 복부 복막의 뒤쪽으로 삽입하고 주사 후 TZ 그램당 0.35mg 또는 이에 상응하는 양의 제어 용액을 물고기의 복강에 주입합니다. 물고기를 회수 물 탱크에 넣고 정상적인 수영 활동을 모니터링하십시오.

실험에 필요한 물고기를 충분히 주입한 후 일반 수조로 옮기고 섭씨 22-24도의 온도를 유지합니다. 체온 감소는 고혈당증의 효율적인 유도를 위해 매우 높은 고혈당 상태를 장기간 유도하는 데 중요하며, 유도 단계에서 잦은 주사 일정을 따른 다음 혈액을 채취하기 위해 여기에 표시된 대로 매주 유지 주사를 주사합니다. FBGL을 측정하기 위해 5마이크로리터의 생리식염수가 포함된 각 혈액 샘플에 대해 라벨링된 PCR 튜브를 준비합니다.

물고기를 마취시킨 후 여분의 물을 닦아내고 물고기를 현미경 슬라이드에 놓고 메스를 사용하여 수술 바닥의 머리를 제거하고 슬라이드에서 방출되는 혈액을 채취하여 혈액이 응고되지 않도록 위아래로 피펫팅하는 멸균 정상 식염수 PCR 튜브에 신속하게 첨가하여 혈액이 응고되지 않도록 즉시 얼음 위에 샘플을 놓습니다. 튜브에 있는 액체의 총 부피를 측정하고 5마이크로리터의 식염수를 빼서 혈액 샘플의 양을 결정합니다. 각 PCR 튜브에서 희석된 혈액 5마이크로리터를 1.5ml 마이크로 퓨지 튜브로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 Quantum Chrome 포도당 분석 키트를 사용하여 혈당 농도를 측정합니다.

물고기를 마취한 후 페트리 접시에 넣고 해부 스코프 아래에 멸균 크기 10 메스를 사용하여 분석의 재생 성장 단계를 위해 첫 번째 지질 기관 분기점에 근접한 직선을 절단하여 코들 핀을 절단합니다. 물고기를 섭씨 33도의 회수 탱크에 넣어 재생 지느러미를 이미지화합니다. 물고기를 마취한 후 지느러미가 완전히 펴지도록 펴고 카메라와 NIS 요소 소프트웨어가 장착된 해부 스코프를 사용합니다.

재생 성장을 측정하기 위해 1배 배율로 이미지를 수집합니다. 이미지를 인쇄하고 이미지 J 소프트웨어와 드로잉 패드를 사용하여 추적의 정확성을 위해 새로운 성장의 전체 영역을 추적합니다. 그림자나 물방울이 없는지 확인하고 각 측정을 5회 수행하여 평균을 계산합니다.

측정값을 정규화하려면 등쪽 배쪽 축을 따라 절단 부위의 길이를 측정하고 이전에 결정된 영역을 이 측정으로 나눕니다. 21일에 DM FISH 그룹과 그 대조군을 생성한 후 그룹의 하위 집합에 대한 FBGL을 결정하고 실험 기간 동안 DM 물고기를 두 개의 하위 그룹으로 나눕니다. 두 번째 그룹에 대한 DM 대조군이 STZ 주입을 중단하고 물고기를 정상 온도에서 부화시키므로 그룹 중 하나에 대해 매주 STZ 주입을 계속합니다.

이 얼룩말 물고기는 14일 이내에 췌장 재생을 통해 정상적인 혈중 인슐린과 포도당 조절을 회복합니다. 이 물고기는 이제 대사 기억 또는 MM이라고 불리며, 약물 제거 후 30일째에 물고기는 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 대조군 DM 및 MM 물고기의 코들 지느러미를 절단하여 대사 기억 조직의 성장을 허용합니다. 60일째에 30일 동안 지느러미 재생을 위해 물고기를 정상적인 물 상태로 되돌립니다.

30일에서 60일 사이에 재생된 조직 내에서 두 번째 절단을 수행하고 코들 핀 재생 분석을 수행하고 조직을 분리하고 관심 분석을 수행합니다. 제1형 당뇨병성 제브라피쉬는 망막병증 및 신병증의 알려진 2차 합병증을 나타낼 뿐만 아니라 절단 후 72시간이 지나면 여기에서 볼 수 있듯이 코들 핀 재생에 장애가 있는 추가 합병증을 보입니다. 이 합병증은 고혈당 기간 후 정상적인 포도당 조절을 회복한 물고기의 대사 기억으로 인해 지속되며, mm 얼룩말 물고기는 대조군 물고기에 비해 지느러미 재생이 약 40%의 결핍을 보이며, 절단 후 150일까지 손상이 관찰되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 제브라 피쉬에서 고혈당 상태를 시작하고, 공복 혈당 수치를 측정하고, 지느러미 재생 연구를 수행하고, 궁극적으로 대사 기억 물고기를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.