Name: 칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리 2 + 과도하고 막 전류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 배우세요 인간 심방근세포 분리법으로 칼슘 과도와 막전류를 동시 측정하는 방법을. 심방세동 등 심장질환의 분자적 기전 연구에 활용할 수 있습니다.

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또한, 우리는 그들의 우수한 기술 지원을위한 인간의 심방 조직과 클라우디아 Liebetrau, 카트린 Kupser 및 라모나 나겔의 제공에 하이델베르크 대학에서 심장 외과 감사합니다. 그의 도움이 제안과 칼슘 2 + 과도 측정을 설정하는 동안 조언도 앤디 W. 트래포드에 특별한 감사합니다. 그들은 세포의 전기 생리학 및 심근 분리의 기본 기술과 기술을 배우기 위하여 저희에게 제공하는 기회를 기술의 드레스덴 대학 : 저자는 약리학 및 독물학의 부 (어슐러 까마귀 머리)의 구성원에게 그들의 깊은 감사를 표현하고 싶습니다. 저자의 연구는 독일 연구 재단 (Do769/1-1-3), 심방 세동 역량 네트워크를 통해 독일 연방 교육 연구부 (01Gi0204) 심장 혈관 연구에 대한 독일의 센터를 통해 유럽 연합에 의해 지원됩니다 유럽​​ 연합 (EU)심방 세동의 번역 연구 ropean 네트워크 (EUTRAF, FP7 - 건강 - 2010 년 대규모 적분 프로젝트 제안 번호 261057)과 유럽 북미 심방 세동 연구 연합 (ENAFRA) 매그 Leducq (07CVD03)의 교부. 비디오 파일에 나와있는 회로도 개요는 Servier의 의료 기술을 사용하여 제작되었습니다.

실험 프로토콜은 로컬 윤리위원회의 승인을 모든 환자가 서면 동의를 제공해야 할 필요가있다. 우리의 연구는 의료 학부 만하임 윤리위원회, 하이델베르크 대학교 (# 2011-216N-MA)에 의해 승인 된 인간의 복지에 대한 모든, 기관 국가 및 국제 지침을 준수 하였다. 모든 환자는 서면 동의를 주었다. 0. 인간의 심방 조직을 얻는 이식 심폐 바이 패스를위한 오픈 심장 수술을받은 환자의 일상 도관의 과정에서, 오른쪽 심방의 끝은 일반적으로 제거되고 심방 심근의 분리에 사용할 수 있습니다. BDM, 수축 억제제, 심근 C 방지, 절제 후 조직 샘플은 2,3 - butanedione monoxime을 (표 I 포함 + 무료 전송 솔루션은 멸균 칼슘 2 50 ML 팔콘 튜브에 즉시 전송됩니다) ontracture. 30 ~ 45 분 사이의 전송 시간으로, 우리는 고립 된 심방 심근의 수와 질 모두에 대해 냉각 또는 산소의 명확한 이점을 인식하지 않았다. 실험실 일반 교통에 가능한 한 빨리해야한다. 긴 수송 시간은 피할 수없는 경우, 4에서 전송 ° C 산소 용액에 유리할 수 있습니다. 1. Prearrangements <ol><li> 재킷 비커 (표 II)의 온도를 제어하는 thermocirculator에 전환합니다. 비커 내부의 온도가 37 ° C.와 동일해야합니다 전체 분리 과정을 통해 비커 내에서 일정한 온도를 유지하기 위해 유리 뚜껑 비커를 다룹니다. </li><li> 세 개의 유리 비커에 콜라게나 제 I 및 프로테아제 XXIV의 무게를 실온에서 보관하십시오. 효소는 사용 직전에 희석 될 것입니다. </li><li> 칼슘의 저장소 20 ML 4에서 페트리 접시에 + 무료 솔루션 ° C. </li><li>칼슘의 저장 250 ML 37 물 목욕 + 무료 솔루션 ° C. </li></ol> 2. 조직의 청소 <ol><li> 페트리 접시 (~ 10 cm 직경)로 전송 솔루션과 함께 조직 샘플을 전송하고 약 가위를 사용하여 지방 조직을 제거합니다. </li><li> 조직 샘플의 무게. 200과 600 mg의 세포 분리에 사용됩니다. 나머지 조직은 나중에 생화학 적 분석을 위해 액체 질소에 냉동 수 있습니다. </li><li> 20 ML 칼슘이 들어있는 페트리 접시에 조직 샘플을 전송 4에서 + 무료 솔루션 ° C (단계 1.3 참조)의 크기는 약 1mm 3 작은 덩어리로 조직 샘플을 잘라. </li><li> 다음 단계는 100 % O 2 37 ° C에서 지속적인 가스 처리에서 실행해야합니다. 피펫 팁은 강력한 버블 링을 방지하고 지속적인 공기 흐름을 생성하기 위해 산소 튜브에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 에서 칼슘 2 + 무료 솔루션과 함께 조직 덩어리를 전송재킷 비커에와 자석 교반 막대 약 3 분 동안주의 깊게 약동하십시오. </li><li> 교반을 중지하고 조직 덩어리가 몇 초 동안 정착 할 수 있습니다. 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 상층 액을 조심스럽게 변형. 집게를 사용하여 비커에 메쉬 절제된 조직 덩어리를 반환합니다. </li><li> 칼슘과 보충 비커 + 무료 솔루션 및 세척 단계에게 2.4 2.5 두 번 반복합니다. </li></ol> 3. 첫 번째 효소 소화 <ol><li> 콜라게나 제와 단백질 분해 효소를 포함하는 20 ML 효소 솔루션 E1 (표 I)와 조직 덩어리를 다시 중지하고 10 분 동안주의 깊게 약동하십시오. </li><li> 20 μM 칼슘 2 +의 최종 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 2 용액 40 μl를 추가합니다. </li><li> 35 분 조직 덩어리의 대부분은 비커에 남아있는 방식으로 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형 한 후. 나머지를 반환메쉬 비커에 조직 덩어리 비가 내렸다. </li></ol> 4. 두 번째 효소 소화 <ol><li> 난 단지 20 ML 효소 솔루션 E2 포함 된 콜라게나 제 (표 I) 다시 조직 덩어리를 resuspend을. 바로 20 μM 칼슘의 최종 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 2 용액 40 μl를 추가합니다 +. </li><li> 두 번째 소화 용 가위 동안 더욱 가끔 조직의 혈전을 잘라합니다. </li><li> 5 분 후 세포의 분리를 확인 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘​​플을 채취. 막대 모양의 줄이있는 심근이 나타날 때까지 2-3 분마다 반복합니다. </li><li> 교반을 중지하고 조직 덩어리는 약 20 ~ 30 초 동안 정착 할 수 있습니다. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브 (관)에 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형. 비커에 메쉬 구속 조직 덩어리를 반환합니다. </li><li> 20 ML 스토와 비커의 조직 덩어리를 다시 일시 중지합니다GE 용액 (표 I) 10 더 디스펜서로 20 ML 혈청 피펫을 사용하여 부드러운 기계적 분쇄하여 세포를 떼어 놓다. 거품 세포의 생존과 품질에 해로운 때문에 거품 형성을 방지하려고합니다. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브 (튜브 B)에 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형. </li></ol> 5. 최종 칼슘의 최종 준비 및 조정 + 농도 <ol><li> 10 분 95 XG에서 팔콘 튜브와 B (단계 4.5 및 4.7 참조​​)를 모두 원심 분리기. </li><li> 흡인에 의해 조심스럽게 두 튜브에서 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록합니다. 상층 액을 버린다. </li><li> 1.5 ML 스토리지 솔루션 (표 I) 각 (상온)에서 모두 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 두 번 각 팰콘 10 mM의 염화칼슘 용액 7.5 μL를 추가하고 신중하게 약동하십시오. 각 단계 후 10 분 동안 품어. </li><li>0.2 mm의 최종 칼슘 2 + 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 용액 15 μl를 추가합니다. </li></ol> 6. 형광 칼슘 2 + - 표시 플루오 오전 3시 (그림 1) 근육 세포의로드 <ol><li> 2 ML의 microcentrifuge 튜브 (에펜 도르프 튜브)에 세포 현탁액의 1.5 ML (튜브 및 / 또는 관 B)를 전송합니다. </li><li> 다음 단계는 형광 칼슘 2 + 표시 플루오 3의 빛의 감도를 고려에서 실행해야합니다. </li><li> 플루로 닉 F-127 (표 3) 원액 (20 % 무수 DMSO에 W / V)를 얻을 수있는 44 μL에 플루오 3 막 투과 아세 톡시 메틸 에스테르 유도체 (플루오로-3 AM, 표 III)의 50 μg을 용해 1 ㎜ 플루오-3는 최대 1 주 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 원액, 오전. </li><li> 15 μl를 추가 플루오 3 1.5 세포 현탁액의 ML (단계 6.1 참조)와 교반을 포함하는 microcentrifuge 관에 원액 오전주의. </li><li> 광학적으로 불투명 한 상자에 10 분 동안 세포 현탁액을 품어. </li><li> 간단히 약 6,000 rpm에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 1.5 ML 목욕 용액 (표 IV)에서 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 실험을 시작하기 전에 드 에스테르 화 약 30 분 세포 현탁액을 남겨주세요. </li></ol> 7. 동시에 패치 클램프 Epifluorescent 칼슘 2 + 측정 패치 클램프 측정이 리뷰의 주요 주제 아니기 때문에, 우리는이 기술의 깊이 설명에 더 많은을 제공하는 다른 간행물에 관심있는 독자를 참조하십시오. 11-14 완성도를 위해서 우리가 측정 할 수있는 프로토콜의 간단한 요약을 제공합니다 활동 전위 또는 L-형 칼슘 2 + 전류의 동시 칼슘 2 + 과도 녹음과 함께 두. 실험을하는 동안 근육 세포는 목욕 soluti입니다와 37 ° C에서 superfused 있습니다신속한 재관류 시스템 (Octaflow IITM, ALA 과학 악기, NY)를 사용하여 (표 IV)에. 전압 클램프 실험, K + 전류는 목욕 솔루션에 4-아미노 피리딘 (5 mmol / L)와 BaCl 2 (0.1 mmol / L)를 추가로 차단됩니다. 붕 규산염 유리 미세 전극을 사용하고 피펫 용액 (표 V)로 가득 할 때 MΩ 2-5 저항 팁을해야합니다. 플루오 3에 더하여 (6 단계 참조) 근육 세포의로드 오전 플루오 3는 피펫 용액 (표 V)에 포함되어 있습니다. 형광은 488 nm에서 흥분과 방출되는 빛은 (&lt;520 nm의) [칼슘 2 +] 나는 가정으로 변환됩니다 <img alt="식 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> 여기서 K D 플루오 3 일정 = 해리 (864 NM), F = 플루오로-3 형광;. F 최대 = 칼슘 각 실험의 끝에 얻어진 + 포화 형광 12 전기 신호 epifluorescent 칼슘 2 + 신호 모두를 동시에 기록됩니다. 활동 전위는 1.2 임계 강도의 1 밀리 전류 펄스를 사용하여 전류 클램프 모드에서 0.5 Hz로 자극된다. L-타입 칼슘 2 + - 전류 100 밀리가 빠른 나 + 전류, 다음을 비활성화 할 -80 MV의 지주 잠재력과 -40 mV에서 100 밀리 초 램프 펄스를 사용하여 전압 클램프 모드에서 측정 0.5 Hz에서 +10 mV에서 테스트 펄스.

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<li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li>
<li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li>
</ol>

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여기에서 우리는 오픈 심장 수술을받은 환자에서 얻은 심방 부속기에서 인간의 심방 근육 세포의 분리 방법을 설명합니다. 세포질 칼슘의 측정이 근육 세포를 사용하기 위해서는 + 우리는 스토리지 솔루션에서 EGTA를 생략하여 앞에서 설명한 방법 4-11 적응. 이미 1970 년에 그것은 근육 세포가 + 소화하는 동안 칼슘의 존재 해리 있지만, 그들 모두가 따라서 수축과 비 생존. 16, 17에 있었다는 것을 관찰되었고, 세포의 분리는 칼슘 2 + 무료 솔루션에서 수행됩니다. 그러나 칼슘의 생리적 농도의 재 도입 + 빠른 칼슘 2 + 유입과 세포의 죽음을 초래. 이것은 원래 짐머만과 훌스에 의해 관류 마음에서 관찰되었다 칼슘 2 + 역설 현상으로 설명하고있다. 7.0의 pH 감소 등의 절연 매체의 18 수정 &lt;타우린 20 또는 칼슘 2 + (단계 3.2 및 4.1 참조), 21뿐만 아니라 스토리지 솔루션 22을 포함 EGTA 격리 된 근육 세포의 저장을 소량의&gt; 19 추가 한모금은 칼슘 2 + 역설 17.을 방지하기 위해 제안되었다 그러나, 그것은 또한 칼슘 2 + EGTA를 통해 버퍼링 L-타입 칼슘의 진폭 + 전류에 의한 칼슘 2 + 과도 진폭과 칼슘 2 + 과도 이상성 붕괴의 결과를 감소하는 것으로 알려져있다. 23 그러므로 우리는 EGTA 생략 일반적인 속성과 monophasic 붕괴와 칼슘 2 + 과도를 얻기 위해 전체 분리 과정을 통해. 칼슘의 세포를 보호하기 위해 + 역설 우리는 0.2 밀리미터까지 단계적 방식의 스토리지 솔루션의 최종 칼슘 2 + 농도를 증가했다. 콜라의 선택은 아마도 성공 심근 절연을위한 가장 중요한 단계입니다. 기존 콜agenases은 클로 스트 리듐 속의 세균 histolyticum에서 얻은 원유 준비하고 다른 단백, polysaccharidases 및 리파제의 숫자뿐만 아니라 콜라가 포함되어 있습니다. 그들의 일반적인 구성 collagenases에 따라 다른 유형으로 나뉩니다. 24 워딩 턴 콜라 유형 I 및 II가 성공적으로 우리의 현재 기술 프로토콜에서 인간의 심방 근육 세포의 분리. 4-10,15,25-30에 사용 된 우리는 콜라게나 제의 사용을 권장합니다 우리는 또한 교원질 유형 II를 사용하여 가능한 세포의 수용 양을 얻을 수 있었지만, I를 입력합니다. 그러나 단 한 번의 콜라 유형 내에서 효소의 활동에 관한 중요한 배치 별 변화가있다. 이러한 변화는주의 일괄 선택 및 분리 절차를 최적화하기 위해 다양한 배치의 테스트를 필요로합니다. 워딩 턴 생화학 공사 (에서 온라인으로 사용할 일괄 선택 도구 <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php)는 인간의 심방 근육 세포의 분리에 적합한 것으로 표시되었습니다 조성 사용할 배치를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 현재 우리는 콜라가 250 U / MG 콜라 활동, 345 U / MG caseinase 활동, 2.16 U / MG clostripain 활동과 0.48 U / MG 트립신 활동 (제비 # 49H11338)와 I를 입력하십시오. 이 논문에 설명 된 절차를 사용하여 얻은 세포 패치 - 클램프 연구, 칼슘 2 + 과도 측정하고 또한 모두. 15 조합을 8 시간에서 사용할 수 있습니다,이 세포는 전기장 자극에 대한 응답으로 세포의 수축을 측정 할 수 있도록 또는 전기 자극 패치 - 클램프 피펫 (게시되지 않은 관찰)를 사용.

패치 클램프 기술과 + 핸들링 이상 격리 된 심근을 필요로 세포의 칼슘의 탐사와 심장 이온 채널의 전기 생리학 특성을 공부합니다. 이들은 일반적으로 소화 효소에 심장 조직 샘플의 체외 노출 (콜라, 히알루, 펩티드 등)에 따라 얻을 수 있습니다. 1955 2 가능한 심장 근육 세포의 분리의 첫 번째 보고서 이후 프로토콜의 큰 양 마우스, 쥐, 토끼, 개, 기니 돼지와 인간을 포함한 다른 종에서 하나의 심방과 심실 심근를 수확하기 위해 개발되었습니다. 이 리뷰에서 우리는 인간의 심방 근육 세포의 분리에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 워딩 턴 생화학 공사, 미국 (에서 제공하는 &quot;워딩 턴 조직 해리 가이드&quot;를 참조하십시오 다른 종에서 근육 세포의 분리 절차에 관한 <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com을</a> ). 외. 3에 설명 된 방법에서 파생됩니다 패치 클램프 실험뿐만 아니라, 동시에 세포 내 칼슘 2 + 측정뿐만 아니라 적당한 심방 근육 세포를 얻을 수 있습니다. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Protease XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>조절 시 사용</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;운송 용액&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free 용액&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;효소 용액 E1 및 E2&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;보관 용액&lt;/em&gt;: 1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">별도로 명시되지 않은 경우 농도는 mM임. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV는 효소 용액 E1에만 포함됨.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;표 I. 용액.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬 (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>자켓형 반응 비커</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;표 II. 특정 장비.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl-sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (특수 포장)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;표 III. Fluo-3 AM을 이용한 심근세포 로딩용 물질.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopyridine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>조절 시 사용</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;배스 용액&lt;/em&gt;: 1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;표 IV. 패치 클램프용 배스 용액.&lt;/strong&gt; *4-aminopyridine 및 BaCl은 전압 클램프 실험에만 포함됨.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartat K+-salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;피펫 용액&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;피펫 용액&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;피펫 용액&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;피펫 용액&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;피펫 용액&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;피펫 용액&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;피펫 용액&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;피펫 용액&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>조절 시 사용</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;표 V. 패치 클램프용 피펫 용액*. &lt;/strong&gt;*실험 당일 피펫 용액은 사용 전까지 얼음 위에 보관함. **Fluo-3는 실험 당일 1 mM 스톡 용액에서 첨가함.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

패치 클램프 기법과 심장 세포의 칼슘의 탐사와 심장 이온 채널의 전기 생리학 특성의 연구는 + 처리 이상 격리 심근이 필요합니다. 또한, 이러한 기술을 사용하여 환자의 근육 세포를 조사 할 수있는 가능성은 심방 세동 (AF)와 같은 심장 질환의 분자 기초를 해명하는 귀중한 요구 사항입니다. 여기에 1 우리는 모두에 적합한 인간의 심방 근육 세포의 분리 방법을 설명 패치 클램프 연구와 세포 내 칼슘 2 + 농도의 동시 측정. 첫째, 오픈 심장 수술을받은 환자에서 얻은 심방 부속기는 작은 조직 덩어리 ( &quot;청크 방법&quot;)로 잘게 + 무료 솔루션 칼슘에 씻어 수 있습니다. 그런 다음 조직 덩어리가 20 μM 칼슘 2 + 솔루션을 포함하는 콜라게나 제와 단백질 분해 효소로 소화된다. 그 후, 고립 된 근육 세포는 하브 있습니다조직 현탁액의 여과 및 원심 분리하여 STED. 마지막으로, 세포 스토리지 솔루션에 칼슘 2 + 농도는 0.2 mm까지 단계적으로 조정됩니다. 우리는 간단히 +와 칼슘 2 + 분리 과정에서 버퍼링도 활동 전위와 막 전류의 대표 녹음을 제공하고, 모두 함께 동시에 칼슘 2 + 과도 측정이 고립 된 근육 세포에서 수행과 칼슘의 의미를 설명합니다.

그림 2a는 고립 된 인간의 심방 근육 세포에서 세 가지 대표적인 예를 보여줍니다. 우리는 CellFinder 현미경 슬라이드 (에 세포 현탁액 (단계 5.5) 10 μL 피펫 세포 수율 계량 <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html을</a> ). 16.5 ± 3.1 cells/10 μL (n은 = 29) 대 5.1 ± 2.3 cells/10 μL : 그림 2B의 평균 세포 수율은 분명히 만성 AF (CAF)의 낮은 세포 수율 경향 환자 샘플 (튜브가 있음을 나타냅니다 (N = 10)는 각각 SR 및 카페에서, p &lt;0.05; 관 B : 17.9 ± 3.9 cells/10 μL (N = 29) 대 5.9 ± SR과 카페에서 2.0 cells/10 μL (n은 = 10), 각각, p = 0.107). 활동 전위 측정 및 세포질 칼슘 2 + 과도의 동시 녹음의 대표적인 예는 그림 3에 나와있다. 조사 세포, T의 약 90 %에그는 액션 잠재적 인 트리거 칼슘 2 + 릴리스는 명확하고 일반 세포의 수축을 발생합니다. 이전에보고 된 세포의 무결성에 대한 허용 지표 휴식 막 잠재력은 -73.9에 대한 평균 ± 2.7 MV (N = 10분의 23 근세포 / 명)와 -77.7 ± 1.8 MV (N = 8분의 19 근세포 / 환자 )는 각각 SR, 커피 (p&gt; 0.05) 인치 15 그림 4는 전압 문 L-타입 칼슘 2 + 전류와 세포질 칼슘 2 + 과도의 대표 동시 녹음을 보여줍니다. 비 선택적 β-아드레날린 수용체 작용제 isoprenaline (1 μM)의 적용은 그대로 β-아드레날린 성 신호 전달 폭포를 제안, I 칼슘, L 및 세포질 칼슘 2 + 과도 모두의 진폭을 증가시킵니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> 에프igure 1. 근육 세포 플루오 3의 흐름도는 (단계 6.1-6.5 참조) 프로토콜을로드 오전. M / V, 질량 / 부피. <img alt="그림 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> 그림 2. 스토리지 솔루션에서 한 한시간, 고립 된 인간의 심방 근육 세포. B는 스토리지 솔루션에서 세포의 10 μL에서 계산 셀 수율의 ± SEM (단계 5.5 참조)를 의미합니다. 여기서 n은 각 그룹 내에서 준비의 수를 나타냅니다. * P &lt;0.05. <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> 액션 잠재적 인 트리거 칼슘 2 동 율동에서 심방 근육 세포에서 + - 과도 (CAT) 및 CHR의 그림 3. 대표 기록술폰산 심방 세동 환자. 최고 : 주입 된 자극 (0.5 Hz에서)에 사용되는 현재의 막 (I M). 아래의 : 막 전위 (V M), 및 트리거 된 고양이 (아래)의 동시 녹음. (보이트 등의 허가를 Replotted. 2012) 15 <img alt="그림 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> L-타입 칼슘 2 isoprenaline (1 μM) 효과의 그림 4. 대표 녹음 + 전류 트리거 칼슘 부비동 리듬과 만성 심방 세동 환자에서 심방 근육 세포에서 + - 과도 (CAT). 최고 : 전압 클램프 프로토콜 (0.5 Hz에서). 아래 : 현재 총 순 막 동시 녹음 (I M), 주로 L-타입 칼슘 2 + 전류 (가운데) 및 트리거 된 고양이 (아래) 반영합니다. (보이트의 허가를 Replotted,외. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="표 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> 표 I. 솔루션을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="표 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> 표 2. 특정 장비. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="표 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> 표 3. 플루오-3와 근육 세포의로드 물질하십시오. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="표 4" fo:conteNT 너비 = &quot;2.5 인치&quot;FO : SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot;/&gt; 표 IV. 패치 클램프 목욕 솔루션입니다. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="표 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> 패치 클램프 * 표 V. 피펫 솔루션입니다.

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를 설명<sup&gt; 2 +</sup전기 생리학 패치 - 클램프 연구와 함께&gt; 측정.

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

이 절차의 전반적인 목표는 칼슘 과도 현상과 막 전류를 동시에 측정하는 데 적합한 인간 심방 근세포를 분리하는 것입니다. 우심방 표본은 개심술을 받는 환자로부터 얻으며, 절차를 시작하기 위해 신속하게 운송합니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 조직을 세척하고 작은 조직 덩어리로 자르는 것입니다.두 번째 단계는 단백질 분해 효소를 이용해 조직을 2단계 효소 소화시켜 심방 심근세포를 분리하는 것입니다. 마지막 단계는 심근세포에 칼슘 민감성 형광 염료를 로딩하는 과정으로 구성됩니다. 최종적으로, 형광 현미경과 패치 클램프 기술을 결합하여 사용함으로써 막 전류 또는 활동 전위와 함께 칼슘 과도 현상을 동시에 기록할 수 있습니다.이 방법은 심방세동과 같은 심장 질환의 근저에 있는 세포 내 칼슘 처리 이상 현상의 분자적 기초를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 해당 방법을 시연할 사람은 우리 연구실의 수석 기술자인 Claudia Lira입니다. 관상동맥 우회술 또는 승모판 교체술을 위해 개심술을 받는 환자로부터 얻은 인간 심방 조직은 운송 용액에 담아 신속하게 실험실로 운반해야 합니다. 실험실에 도착하면 조직 샘플과 용액을 10 cm 디시에 옮깁니다. 그런 다음 가위로 지방 조직을 대략적으로 제거합니다.다음으로, 조직 샘플의 무게를 잽니다. 세포 분리를 위해 200~600 mg을 확보하고, 나머지는 생화학 분석을 위해 액체 질소에 냉동 보관합니다. 세포 분리에 사용할 조직을 차가운 칼슘 제거 용액이 담긴 접시로 옮긴 후, 조직을 세척하기 위해 1 mm³ 크기의 조각으로 다집니다.칼슘 제거 용액과 함께 이를 재킷 비커로 옮깁니다. 37 °C로 가열합니다. 강한 기포 발생을 방지하기 위해 피펫 팁이 씌워진 라인을 통해 산소를 공급합니다.마그네틱 스터 바를 사용하여 조직을 약 3분 동안 조심스럽게 교반합니다. 그 다음 조직이 가라앉을 때까지 기다립니다. 이제 상층액을 200 micron 나일론 메쉬로 조심스럽게 걸러냅니다.대부분의 조직은 비커에 그대로 두어야 합니다. 비커에 37 °C로 데운 칼슘 제거 용액을 다시 채웁니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 메쉬에 걸러진 조직 덩어리들을 비커로 다시 옮기고, 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.콜라게나제(collagenase)와 프로테아제(protease)가 포함된 37 °C로 가온된 효소 용액 E one 20 mL를 준비하여 이 절차 단계를 시작합니다. 최종 세척 단계 후 칼슘 제거 용액을 조심스럽게 걸러내고, 세척된 조직을 E one 용액에 재현탁합니다. 메쉬에 수집된 조직을 다시 비커로 옮깁니다.현탁액을 10분 동안 조심스럽게 교반합니다. 그런 다음 10 millimolar 염화칼슘 40 µL를 첨가하고 35분 동안 계속 교반합니다. 이어서 상층액을 나일론 메쉬로 조심스럽게 걸러냅니다.대부분의 조직은 비커에 그대로 두어야 합니다. 콜라게나제 1만 포함된 20 milliliters의 효소 용액 E 2를 준비하여 비커를 다시 채웁니다. 메쉬에 수집된 조직을 다시 비커로 옮깁니다.그런 다음 2차 소화 과정 중에 10 millimolar 염화칼슘 용액 40 µL를 즉시 첨가하고, 때때로 가위를 사용하여 조직 덩어리를 잘게 자릅니다. 5분 후, 현탁액 샘플을 취해 현미경으로 세포의 해리 상태를 확인합니다. 막대 모양의 가로무늬 심근세포가 명확하게 보일 때까지 2~3분마다 계속해서 샘플을 채취합니다.그런 다음 교반을 중단하고 조직이 가라앉도록 둡니다. 조직이 가라앉으면 상층액을 나일론 메쉬로 조심스럽게 걸러 50 milliliter 플라스틱 튜브에 담습니다. 다음으로, 조직을 20 milliliters 보관 용액에 현탁시키고 메쉬에 걸러진 조직 덩어리들을 다시 비커로 옮깁니다.부드러운 기계적 교반을 통해 세포를 추가로 해리시킵니다. 20 milliliter 피펫을 사용할 때 기포 형성을 피하도록 주의하십시오. 다음으로, 상층액을 나일론 메쉬로 조심스럽게 걸러낸 후, 원심분리기를 통해 두 상층액 수집물을 90 5G에서 10분 동안 원심분리합니다.세포를 펠렛화하려면, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 각 펠렛을 실온에서 1.5 milliliters의 보관 용액에 현탁합니다. 다음으로, 각 튜브에 10 millimolar 염화칼슘 용액 7.5 microliters를 첨가하고 10분 동안 기다립니다.그 다음, 염화칼슘을 7.5 µL 더 추가하고 10분 동안 더 기다립니다. 대기 시간이 지난 후, 10 mM 염화칼슘 15 µL를 세 번째로 추가하여 용액 내 염화칼슘의 최종 농도를 0.2 mM로 맞춥니다. 이 분리 과정의 목적은 세포 내 칼슘 측정에 적합한 세포를 얻는 것입니다.따라서 저장 용액에서 EGGA와 같은 칼슘 완충액을 제외하는 것이 필수적입니다. 세포 현탁액 1.5 milliliters를 2 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음 단계들은 형광 칼슘 지시약의 빛 민감성을 고려하여 수행해야 합니다.FluO-3. 먼저 1 mM FluO-3 스톡 솔루션을 제조합니다. 이 솔루션은 -20 °C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.다음으로, 1.5 mL 세포 현탁액에 flu oh 3:00 AM 스톡 용액 15 µL를 첨가합니다. 혼합물을 조심스럽게 교반하고, 불투명한 상자에 넣어 실온에서 10분 동안 현탁액을 배양합니다. 배양 후, 조직을 약 6,000 RPM에서 짧게 원심분리합니다.그런 다음 상층액을 버리고 펠렛을 1.5 milliliters의 bath solution에 다시 현탁합니다. 실험을 시작하기 전, 탈에스테르화(de-esterification)를 위해 세포 현탁액을 약 30분 동안 둡니다. 그 후, 설명된 프로토콜에 따라 패치 클램프와 에피 형광 칼슘 측정을 동시에 진행합니다.심방 조직에서 심근세포를 분리하고 셀 파인더(cell finder) 현미경 슬라이드를 통해 정량화하였습니다. 평균 세포 회수량은 만성 심방세동 환자의 샘플에서 세포 회수량이 낮아지는 경향이 있음을 분명히 보여줍니다. Flu oh three가 로딩된 심근세포를 전류 클램프(current clamp) 구성에서 0.5 hertz로 자극하여 활동 전위를 유도하였으며, 조사된 세포의 약 90%가 규칙적인 수축을 보였습니다.이러한 자극에 반응하여 형광 현미경으로 전환하면, 세포 수축을 유도하는 근소포체에서의 활동 전위 유발 칼슘 방출을 시각화할 수 있습니다. 동리듬 및 심방세동 환자의 대표적인 기록을 보면, 일반적인 환자의 활동 전위는 스파이크와 돔 형태를 띠는 반면, 활동 전위의 삼각형화 및 단축은 심방 리모델링의 전형적인 특징입니다.심방세동 환자의 세포 내 칼슘 과도 현상을 동시에 기록한 결과, 심방세동 환자의 심근세포에서 이완기 칼슘 수준이 증가하고 칼슘 과도 진폭이 감소한 것이 나타났으며, L형 칼슘 전류를 기록하였습니다. 칼륨 전류는 4-aminopyridine과 염화바륨을 사용하여 차단하였습니다. 전압 클램프 구성에서 유지 전위 -80 mV, -40 mV로의 100 ms 램프 및 10 mV로의 100 ms 테스트 펄스를 사용하여 0.5 Hz로 세포를 자극하였습니다.대표적인 기록 결과는 심방세동이 L형 칼슘 전류의 감소와 연관되어 있음을 보여줍니다. 또한, 이완기 칼슘 수준은 증가한 반면, 칼슘 과도 진폭은 더 낮게 나타났습니다. 심방세동에서.비선택적 베타 아드레날린 수용체 작용제인 이소프레닐(isoprene)을 처리했을 때 L형 칼슘 전류의 진폭과 세포질 칼슘 과도 현상이 증가하였습니다. 두 그룹 모두에서 이는 세포의 베타 아드레날린 신호 전달 폭포(signal transduction cascade)가 온전함을 시사합니다. 이러한 결과는 본 방법이 패치 클램프와 칼슘 과도 측정을 동시에 수행하기에 적합한, 고품질의 칼슘 내성 심근세포를 제공한다는 것을 보여줍니다.또한, 이렇게 얻은 근세포는 세포 단축 측정, 면역 염색 또는 TTU 염색에 유용하게 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

KV 채널 장애는 심장 arrhythmias과 연결되어 있습니다. 우리가 KV 채널 보조의 subunit의 녹아웃 마우스에서 심방과 심실 cardiomyocytes의 분리에 대한 체계적인 프로토콜을 활용 이러한 arrhythmias로 이어질 분자 메커니즘을 연구하기 위해. 절연 cardiomyocytes는 다음 즉시 세포 electrophysiological 연구, 생화학 또는 immunofluorescence (IF) assays에 사용하실 수 있습니다.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

방법은 패치 클램프 전기 생리학 또는 이미징 연구를위한 성인 마우스의 동방 노드 근육 세포 (SAM을)의 분리를 위해 증명된다. 분리 된 세포를 직접 사용할 수 또는 부호화 유전자 리포터로서 관심 단백질의 발현을 허용하는 배양에서 유지 될 수있다.

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이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

이 프로토콜은 청크 소화 접근법을 사용하여 성인 마우스 심장으로부터 단일 심방 심근세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 접근법은 패치 클램프 연구에서 심방 근세포 전기 생리학을 특성화하는 데 사용할 수 있는 우측 또는 좌심방 근세포를 분리하는 데 사용됩니다.

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

이 프로토콜은 성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 대동맥 통조림의 깊이를 포함하는 Langendorff 방법의 변형을 설명합니다.

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

배우세요 인간 심방근세포 분리법으로 칼슘 과도와 막전류를 동시 측정하는 방법을. 심방세동 등 심장질환의 분자적 기전 연구에 활용할 수 있습니다.

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리

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