칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 칼슘 과도 현상과 막 전류를 동시에 측정하는 데 적합한 인간 심방 근세포를 분리하는 것입니다. 우심방 표본은 개심술을 받는 환자로부터 얻으며, 절차를 시작하기 위해 신속하게 운송합니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 조직을 세척하고 작은 조직 덩어리로 자르는 것입니다.

두 번째 단계는 단백질 분해 효소를 이용해 조직을 2단계 효소 소화시켜 심방 심근세포를 분리하는 것입니다. 마지막 단계는 심근세포에 칼슘 민감성 형광 염료를 로딩하는 과정으로 구성됩니다. 최종적으로, 형광 현미경과 패치 클램프 기술을 결합하여 사용함으로써 막 전류 또는 활동 전위와 함께 칼슘 과도 현상을 동시에 기록할 수 있습니다.

이 방법은 심방세동과 같은 심장 질환의 근저에 있는 세포 내 칼슘 처리 이상 현상의 분자적 기초를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 해당 방법을 시연할 사람은 우리 연구실의 수석 기술자인 Claudia Lira입니다. 관상동맥 우회술 또는 승모판 교체술을 위해 개심술을 받는 환자로부터 얻은 인간 심방 조직은 운송 용액에 담아 신속하게 실험실로 운반해야 합니다. 실험실에 도착하면 조직 샘플과 용액을 10 cm 디시에 옮깁니다. 그런 다음 가위로 지방 조직을 대략적으로 제거합니다.

다음으로, 조직 샘플의 무게를 잽니다. 세포 분리를 위해 200~600 mg을 확보하고, 나머지는 생화학 분석을 위해 액체 질소에 냉동 보관합니다. 세포 분리에 사용할 조직을 차가운 칼슘 제거 용액이 담긴 접시로 옮긴 후, 조직을 세척하기 위해 1 mm³ 크기의 조각으로 다집니다.

칼슘 제거 용액과 함께 이를 재킷 비커로 옮깁니다. 37 °C로 가열합니다. 강한 기포 발생을 방지하기 위해 피펫 팁이 씌워진 라인을 통해 산소를 공급합니다.

마그네틱 스터 바를 사용하여 조직을 약 3분 동안 조심스럽게 교반합니다. 그 다음 조직이 가라앉을 때까지 기다립니다. 이제 상층액을 200 micron 나일론 메쉬로 조심스럽게 걸러냅니다.

대부분의 조직은 비커에 그대로 두어야 합니다. 비커에 37 °C로 데운 칼슘 제거 용액을 다시 채웁니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 메쉬에 걸러진 조직 덩어리들을 비커로 다시 옮기고, 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.

콜라게나제(collagenase)와 프로테아제(protease)가 포함된 37 °C로 가온된 효소 용액 E one 20 mL를 준비하여 이 절차 단계를 시작합니다. 최종 세척 단계 후 칼슘 제거 용액을 조심스럽게 걸러내고, 세척된 조직을 E one 용액에 재현탁합니다. 메쉬에 수집된 조직을 다시 비커로 옮깁니다.

현탁액을 10분 동안 조심스럽게 교반합니다. 그런 다음 10 millimolar 염화칼슘 40 µL를 첨가하고 35분 동안 계속 교반합니다. 이어서 상층액을 나일론 메쉬로 조심스럽게 걸러냅니다.

대부분의 조직은 비커에 그대로 두어야 합니다. 콜라게나제 1만 포함된 20 milliliters의 효소 용액 E 2를 준비하여 비커를 다시 채웁니다. 메쉬에 수집된 조직을 다시 비커로 옮깁니다.

그런 다음 2차 소화 과정 중에 10 millimolar 염화칼슘 용액 40 µL를 즉시 첨가하고, 때때로 가위를 사용하여 조직 덩어리를 잘게 자릅니다. 5분 후, 현탁액 샘플을 취해 현미경으로 세포의 해리 상태를 확인합니다. 막대 모양의 가로무늬 심근세포가 명확하게 보일 때까지 2~3분마다 계속해서 샘플을 채취합니다.

그런 다음 교반을 중단하고 조직이 가라앉도록 둡니다. 조직이 가라앉으면 상층액을 나일론 메쉬로 조심스럽게 걸러 50 milliliter 플라스틱 튜브에 담습니다. 다음으로, 조직을 20 milliliters 보관 용액에 현탁시키고 메쉬에 걸러진 조직 덩어리들을 다시 비커로 옮깁니다.

부드러운 기계적 교반을 통해 세포를 추가로 해리시킵니다. 20 milliliter 피펫을 사용할 때 기포 형성을 피하도록 주의하십시오. 다음으로, 상층액을 나일론 메쉬로 조심스럽게 걸러낸 후, 원심분리기를 통해 두 상층액 수집물을 90 5G에서 10분 동안 원심분리합니다.

세포를 펠렛화하려면, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 각 펠렛을 실온에서 1.5 milliliters의 보관 용액에 현탁합니다. 다음으로, 각 튜브에 10 millimolar 염화칼슘 용액 7.5 microliters를 첨가하고 10분 동안 기다립니다.

그 다음, 염화칼슘을 7.5 µL 더 추가하고 10분 동안 더 기다립니다. 대기 시간이 지난 후, 10 mM 염화칼슘 15 µL를 세 번째로 추가하여 용액 내 염화칼슘의 최종 농도를 0.2 mM로 맞춥니다. 이 분리 과정의 목적은 세포 내 칼슘 측정에 적합한 세포를 얻는 것입니다.

따라서 저장 용액에서 EGGA와 같은 칼슘 완충액을 제외하는 것이 필수적입니다. 세포 현탁액 1.5 milliliters를 2 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음 단계들은 형광 칼슘 지시약의 빛 민감성을 고려하여 수행해야 합니다.

FluO-3. 먼저 1 mM FluO-3 스톡 솔루션을 제조합니다. 이 솔루션은 -20 °C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

다음으로, 1.5 mL 세포 현탁액에 flu oh 3:00 AM 스톡 용액 15 µL를 첨가합니다. 혼합물을 조심스럽게 교반하고, 불투명한 상자에 넣어 실온에서 10분 동안 현탁액을 배양합니다. 배양 후, 조직을 약 6,000 RPM에서 짧게 원심분리합니다.

그런 다음 상층액을 버리고 펠렛을 1.5 milliliters의 bath solution에 다시 현탁합니다. 실험을 시작하기 전, 탈에스테르화(de-esterification)를 위해 세포 현탁액을 약 30분 동안 둡니다. 그 후, 설명된 프로토콜에 따라 패치 클램프와 에피 형광 칼슘 측정을 동시에 진행합니다.

심방 조직에서 심근세포를 분리하고 셀 파인더(cell finder) 현미경 슬라이드를 통해 정량화하였습니다. 평균 세포 회수량은 만성 심방세동 환자의 샘플에서 세포 회수량이 낮아지는 경향이 있음을 분명히 보여줍니다. Flu oh three가 로딩된 심근세포를 전류 클램프(current clamp) 구성에서 0.5 hertz로 자극하여 활동 전위를 유도하였으며, 조사된 세포의 약 90%가 규칙적인 수축을 보였습니다.

이러한 자극에 반응하여 형광 현미경으로 전환하면, 세포 수축을 유도하는 근소포체에서의 활동 전위 유발 칼슘 방출을 시각화할 수 있습니다. 동리듬 및 심방세동 환자의 대표적인 기록을 보면, 일반적인 환자의 활동 전위는 스파이크와 돔 형태를 띠는 반면, 활동 전위의 삼각형화 및 단축은 심방 리모델링의 전형적인 특징입니다.

심방세동 환자의 세포 내 칼슘 과도 현상을 동시에 기록한 결과, 심방세동 환자의 심근세포에서 이완기 칼슘 수준이 증가하고 칼슘 과도 진폭이 감소한 것이 나타났으며, L형 칼슘 전류를 기록하였습니다. 칼륨 전류는 4-aminopyridine과 염화바륨을 사용하여 차단하였습니다. 전압 클램프 구성에서 유지 전위 -80 mV, -40 mV로의 100 ms 램프 및 10 mV로의 100 ms 테스트 펄스를 사용하여 0.5 Hz로 세포를 자극하였습니다.

대표적인 기록 결과는 심방세동이 L형 칼슘 전류의 감소와 연관되어 있음을 보여줍니다. 또한, 이완기 칼슘 수준은 증가한 반면, 칼슘 과도 진폭은 더 낮게 나타났습니다. 심방세동에서.

비선택적 베타 아드레날린 수용체 작용제인 이소프레닐(isoprene)을 처리했을 때 L형 칼슘 전류의 진폭과 세포질 칼슘 과도 현상이 증가하였습니다. 두 그룹 모두에서 이는 세포의 베타 아드레날린 신호 전달 폭포(signal transduction cascade)가 온전함을 시사합니다. 이러한 결과는 본 방법이 패치 클램프와 칼슘 과도 측정을 동시에 수행하기에 적합한, 고품질의 칼슘 내성 심근세포를 제공한다는 것을 보여줍니다.

또한, 이렇게 얻은 근세포는 세포 단축 측정, 면역 염색 또는 TTU 염색에 유용하게 사용할 수 있습니다.