라이브 세포주기 분석

이 절차의 전반적인 목표는 초파리에서 유전적으로 조작되고 GFP 또는 RFP로 표지된 세포 집단이 있는 조직의 상대적인 세포주기 단계와 세포 크기를 측정하는 것입니다. 먼저 유전자 교배를 설정하여 특정 조직 또는 세포 집단에서 원하는 형광 단백질과 원하는 유전자 조작으로 표지된 세포를 포함하는 자손을 생성합니다. 연구 결과, 적절한 발달 단계의 자손에서 원하는 조직을 깨끗하게 분리한 다음 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리하고 생존 가능한 DNA 염료로 염색하여 DNA 함량을 측정합니다.

유세포 분석법으로 염색된 해리된 샘플을 분석합니다. 궁극적으로, 생체 내 결과는 연구 중인 유전자 조작으로 인한 세포 크기 및 세포 주기 단계의 변화를 측정합니다. 자외선 염료를 사용하여 살아있는 초파리 조직에 대한 기존 유세포 분석 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 염료 주기 보라색 염료가 적은 예산으로 구매하고 단일 실험실 규모로 유지할 수 있는 보라색 4 0 5 레이저를 포함하는 저렴한 탁상용 세포분석기와 호환된다는 것입니다.

이 방법은 전체 조직 크기와 증식 속도를 측정하는 것보다 더 자세한 세포주기 단계 및 세포 크기에 대한 정보를 제공함으로써 세포주기 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Kagel과 Dan Sun, 그리고 Olga Guko입니다. 우리 기술자는 유충 해부를 위해 알을 낳은 후 약 110-120시간에 세 번째 유충 Instar에서 성숙한 유충을 수집합니다.

정확한 동공 단계는 변태 초기에 이 수확 흰색 프리 번데기를 위한 변태 중 연구에 필수적입니다 필요한 경우, 나는 번데기의 페트리 접시 또는 유충의 바이알을 섭씨 37도의 수조에서 밀봉하여 열을 활성화합니다. 혈통 추적 클론을 위한 척 플립 베이스. 페트리 접시의 밀봉을 푼 후 인큐베이터에 넣어 동공 해부를 위해 원하는 발달 단계로 숙성시킵니다.

손상되지 않도록 기포가 있는 동공 케이스의 앞쪽 끝으로 번데기를 부드럽게 잡고 번데기가 손상되지 않도록 내부에 떠 있는 번데기를 적절하게 잡을 수 있도록 놓습니다. 그런 다음 마이크로 가위로 번데기의 뒤쪽 끝을 동물의 등쪽 부분을 향해 약간 각도로 잘라 내부 압력을 해제하고 흉부의 원하는 조직에 hist 지방을 밀어 넣지 않고 머리를 등쪽 중앙을 따라 조심스럽게 자르고 날개와 앞쪽 눈 뇌 복합체가 지방을 제거하기 위해 씻습니다. 그런 다음 집게로 동공 표피의 뒤쪽 가장자리를 잡고 동공 케이스에서 당겨 동공 케이스에서 동공을 제거합니다.

해부된 번데기를 깨끗한 해부 접시에 옮깁니다. 집게로 눈의 뇌 복합체 앞쪽에 있는 큐티클에 작은 구멍을 뚫습니다. 고무 전구가 있는 유리 파스티 피펫 사용.

부분적으로 절개된 번데기를 통해 PBS 해부 용액을 부드럽게 세척하여 남아 있는 지방과 장 조직을 제거합니다. 동공 날개를 얻으려면 두 번째 집게를 사용하여 한 집게로 번데기의 머리를 잡습니다. 날개 표피의 가장 뒤쪽 끝을 잡고 사체 측면에서 당겨 빼냅니다.

그런 다음 경첩에서 날개를 자르거나 당겨 몸에서 제거하고 사체 및 기타 물질에서 멀리 떨어진 더미에 넣어 동공, 눈 또는 뇌를 얻습니다. 눈의 뇌 복합체가 제거되고 번데기에서 자유로워질 때까지 번데기를 씻으십시오. 집게를 사용하여 동공의 눈을 뇌에서 부드럽게 당겨 원하는 조직을 저장합니다.윤활된 과거 피펫을 사용하여 절개된 조직을 조심스럽게 옮깁니다.

섭씨 23도에서 500RPM으로 70분 동안 흔들면서 튜브를 배양합니다. 그런 다음 중간 속도로 5초 동안 부드럽게 소용돌이치고 추가로 15-20분 동안 샘플을 셰이커에 다시 넣습니다. Vortex는 뇌와 동공의 눈을 중간 속도로 5초 동안 다시 샘플링합니다.

36시간 이상 지났습니다. PF는 섭씨 23도, 500RPM에서 45-60분 동안 DNA 염색 용액의 조직을 해리합니다. 그런 다음 약 50마이크로리터의 DNA 염색 용액과 함께 해부 접시로 옮겨 큰 조직 덩어리를 하나씩 수동으로 해리합니다.

약 100-150 마이크로미터 개구부의 피펫을 수동으로 당겨 위아래로 빠르게 피펫팅합니다. 해리된 표본을 5ml 튜브에 모읍니다. 섭씨 23도에서 500RPM으로 흔들면서 30분 더 배양합니다.

샘플이 완전히 분리되었는지 육안으로 확인합니다. 무세포 투명 동공 날개 큐티클은 연결되지 않는다는 점에 유의하십시오. 검체를 세포분석기에 로드하여 팩스 분석을 시작합니다.

그런 다음 전방 산란(forward scatter)과 측면 산란(side scatter)을 검출할 채널을 선택하여 세포 크기와 막의 복잡성을 나타냅니다. DNA의 D cycle violet staining을 검출하려면 violet laser excitation에서 VL 하나의 높이, 너비 및 면적을 측정해야 합니다. 또한 GFP 형광을 측정하기 위해 파란색 레이저 채널 한 영역을 선택합니다.

RFP 분석을 위해 청색 레이저 채널 3을 사용합니다. attune의 이 채널은 RFP 탐지에 최적화되어 있습니다. 게이트를 설정하여 분석을 선택한 모집단으로 제한하고, 게이트 1로 정지 플롯을 생성하는 분석에서 파편 및 덩어리를 판매하고, VL 1 면적 대 VL 1 플롯에서 SSC 대 FSC 플롯에서 파편 및 덩어리를 제외하고, GA 2를 사용하여 염색되지 않은 세포, sub G one, apoptotic 세포 및 세포 덩어리를 제외합니다.

GA 3은 VE L 1 높이를 기준으로 형광 대 DNA 함량 플롯에서 GFP 음성인 게이트 1과 2 내의 세포를 포함합니다. 다음으로, 4번 보행은 DNA 함량 대비 형광 그래프에서 GFP 양성인 게이트 1과 2 내의 세포를 포함합니다. 또한 GFP 대 전방 산란으로 측정된 세포 크기의 점도표에서 게이트 5와 6을 생성할 수 있습니다.

세포주기 위상을 검사하려면 게이트 3 및 게이트 4로 정의된 집단에 대해 x축의 DNA 함량과 Y ais의 세포 수를 표시하는 두 개의 히스토그램을 사용합니다. 셀 크기의 경우, 히스토그램은 모집단을 게이트 5와 6으로 설정하고 x축에 FSC를 플롯하고 샘플을 실행할 때 Y축에 카운트를 설정하여 기록이 10, 000에서 중지되도록 설정합니다. GFP 포지티브 이벤트는 또한 300마이크로리터의 획득 부피를 설정합니다.

적절한 임계값 및 전압 설정은 제공된 템플릿에 포함되어 있습니다. 표준 또는 고감도 분당 100마이크로리터로 샘플을 실행하고 기록합니다. Attune 소프트웨어에 의해 생성된 기록된 데이터 파일은 대부분의 세포주기 모델링 소프트웨어와 호환되는 FCS 형식입니다.

4개의 점도표와 2개의 히스토그램을 포함하는 이 대표적인 작업 공간은 Grailed gal four transgene에 의해 구동되는 뒤쪽 날개에서 GFP와 Cyclin D를 발현하는 유충 날개 샘플을 보여줍니다. 보행이 1인 세포 크기의 첫 번째 점도표는 파편과 덩어리를 제외합니다. 두 번째 점도표는 걸음걸이가 2인 싱글릿을 구별하여 염색되지 않은 세포, G 1D NA 이하 함량 및 응집체를 GFP 대 DNA 함량 플롯에서 제외합니다.

GFP 음성 및 양성 세포는 구별될 수 있고 2개의 N 및 4개의 NDNA 내용은 x-축에 따라서 위치에 근거를 두어 분명합니다. GFP 대 전방 산란으로 측정된 이 세포 크기 플롯은 게이트 5와 6을 생성하는 데 사용됩니다. 결과 분석은 GFP 또는 RFP 음성 모집단과 GFP 또는 RFP 양성 세포에 대한 계수 대 DNA 함량의 히스토그램으로 이어집니다.

제공된 RFP 템플릿을 사용합니다. 동일한 조직 유형 및 발현 패턴으로 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. RFP의 경우 제공된 템플릿과 전압은 유충의 눈, 뇌 및 날개뿐만 아니라 동공의 눈, 뇌 및 날개를 분석하는 데 적합합니다.

튜닝된 소프트웨어에서. 세포 주기 또는 세포 크기 히스토그램에 대한 자동 크기 조정 기능을 사용하면 각 집단에 대한 전역 최대값을 결정할 수 있습니다. 이러한 세포주기 프로파일은 유충 눈에서 GFP 양성 및 음성 세포를 나타내며 후방에서 GFP를 발현합니다.

오버레이는 GMR GAL 4개의 U-A-S-G-F-P 전이유전자를 사용하여 후방 GFP 발현 세포의 세포주기 위상 차이를 보여줍니다. GFP 양성 세포와 음성 세포 사이의 세포 크기의 상대적 변화도 표시할 수 있습니다. 이 세포주기 프로파일은 46시간 A PF에서 동공 뇌에서 파생되었습니다. GFP 양성 세포는 G one S 조절자, cyclin D 및 E two F를 발현하는 계통 추적 클론으로, 정지를 방해하고 S-상 진입으로 이어집니다.

이것은 이 단계에서 일반적으로 정지되는 비발현 GFP 음성 세포와 대조됩니다. G one에서 attune 소프트웨어는 히스토그램에서 G one s 및 G two 위상을 설명하는 사용자 정의 영역을 생성합니다. 각 실행에 대한 통계 테이블은 사용자 정의 영역 및 백분율 내에 있는 셀의 절대 개수를 결정합니다.

또는 mod fit과 같은 모델링 소프트웨어를 사용하여 각 단계의 백분율과 세포사멸 세포를 추정할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포주기 분석을 위해 초파리에서 여러 조직을 분리하고 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.