Name: 라이브 세포주기 분석 초파리 조직 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 배우세요 Drosophila 조직의 라이브 세포주기 분석 방법을. 유전자 조작된 세포 집단의 DNA 함량과 세포 크기를 측정하여 발달 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 개발 버전이 10의 기반이되는 원래의 프로토콜을 가르치는 아이다 드 라 쿠 르스에 감사드립니다. Buttitta 연구소의 작품은 NIH 교부금 GM086517에 의해 지원됩니다.

1. 축산 비행 <ol><li> 크로스 10 ㎖ 효모 포도당 보통 3 또는 원하는 다른 단백질이 풍부한 미디어 좁은 플라스틱 병에서 원하는 유전자형의 파리. 생체 내 형광 단백질 발현과 추적 조직의 특정 표현과 혈통에 사용할 수있는 광범위한 초파리 유전자 변형 도구는 다른 4,5 자세히 설명되어 있습니다. 24 시간 자손 컬렉션 시리즈를 얻기 위해 매일 신선한 유리 병에 부모를 전송하거나 더 정확한 스테이징, 한천 플레이트에서 배아를 수집하고 10 설명 된대로 유리 병에 새로 부화 한 유충을 전송합니다. 실험을 통해 균일 한 조건을 보장하고 혼잡 방지하기 위해, 하나의 유리 병 F1 자손의 총 개수는 100 개 이하이어야한다. 실험의 유전 디자인에 따라 원하는 발달 단계까지 적절한 인큐베이터에 튜브를 유지합니다. </li><li> 실험 동물을 수집하여 제 3 애벌레 성숙한 유충이 필요합니다정확한 번데기 스테이징 애벌레의 해부 또는 흰색 prepupa (WPP)에 대한 개발 110-120에 대한 시간의 령 (L3). 비 증식 상태로 전환 등의 극적인 세포주기의 변화는 변태 12,13 동안 별개의 timepoints에서 발생합니다. 번데기의 따라서 정확한 스테이징 (개발 1 시간 이내) 변태 동안 재생 세포주기 데이터에 대한 필수적입니다. 그림 1과 같이 WPP (0 시간 APF) 번데기 형성 후 0 시간에 해당 패널의 I. 약간의 습도를 유지하기 위해 물 2.5 mL로 젖은 접힌 Kimwipe에 35mm 페트리 접시에 WPP를 수집합니다. 나이 번데기까지 적절한 온도 단계 (시간 APF) 원하는. 개발 29 1.2 배 빠른 속도로 진행합니다 18에서 더 느리게 ° C와 2.2 배 ° 표준 25 ° C 14에서보다 C. </li><li> 9,11가 필요한 경우 복제를 혈통 추적에 열 충격 flipase (HS-FLP)에 의한 재결합을 활성화하기 위해 열 충격 동물. 유충, 몰입의 열 충격물 목욕 (37 ° C로 설정) 및 유충을 확보에 유리 병이 완전히 빠져들 수 있습니다. 번데기의 열 충격, 파라 필름 완전히 물속에 그 물을 욕조에와 페트리 접시를 밀봉하십시오. 동물의 생존을위한 충분한 산소를 교환 할 수 있도록, 열 충격 후 파라 필름을 제거해야합니다. 열 충격의 기간은 flipase의 사용 유전자 원하는 클론의 수의 활동에 따라 달라집니다. 우리는 일상적으로 HS-FLP 유전자 동안에, HS-FLP 첫 번째 염색체에있는 유전자 35 밀리미터 요리 번데기의 열 충격에 대한 2-4 분에 유충의 클론에게 15 추적 혈통 &quot;flipout&quot;를 유도 7-8 분 사용 두 번째 염색체는 20 분을 필요로합니다. 열 충격 클론 비슷한 숫자를 얻었다. </li></ol> 세포 분열 및 해부의 시간의 비율은 각 조직에서 복제 크기를 결정합니다. 정상적인 조건에서, 우리는 클론 20 분 열 충격 (두 번째 염색체에 HS-FLP 유전자를 사용하여) dissec와 애벌레 날개에 유도 것을 발견테드 48 시간 후, 복제 당 네 개의 셀 주위에 평균과, 클론 당 10 세포 클론 당 두 개의 셀에 이르기까지 크기에 약 20 ~ 30도 분리 된 클론이 포함되어 있습니다. 반면, 0 시간 APF에서 배양 접시에있는 번데기의 동일한 HS-FLP 유전자를 가진 7 분 열 충격에 36 시간 이상 해부 수익률도 평균과 1 ~ 4 셀까지 (약 15-25) 클론을 분리 클론 당 2.2 세포. 이러한 데이터는 연구 결과에 따라 조직의 평균 셀 배가 시간을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 2. 해부 <ol><li> 부드럽게 1X PBS를 포함하는 투명 유리 해부 접시에 애벌레 / 번데기를 전송합니다. </li><li> 해부 현미경과 충분한 빛을 사용하여, 부드럽게, 선명 이녹스 5 forcep과 복부에 유충을 파악 마이크로 가위로 전방 제를 잘라 애벌레를 잡고 후방을 향해 입 영역을 안쪽으로 밀어 앞쪽에 세 번째 반전 표피 정상 (그림 1A). 조심스럽게 opaqu 제거전자 체지방과 같은 날개, 눈이나 뇌 원하는 조직의 가시성을 높이기 위해 남아있는 용기. 원하는 조직을 해부, 청결 포셉, 입 후크의 눈, 또는 눈 (그림 1G)의 뇌와 기관 및 표피에서 날개를 제거. </li><li> 번데기 해부를 들어, 번데기 안쪽 (그림 1C)을 손상을 방지하기 위해, 공기 거품이있는 곳에 부드럽게 번데기 케이스의 앞쪽 끝으로 번데기를 파악하기 위해 forcep을 사용합니다. 반대 손에 포셉 또는 마이크로 가위는 올바른 파악을위한 위치 유동 번데기를하는 데 도움이 될 수 있습니다. 청결 마이크로 가위로 번데기의 후방 끝을 잘라. 이 단면 컷 흉부와 머리에 원하는 조직으로 histolyzed 지방을하지 않고 내부 압력을 해제하기 위해 동물의 지느러미 부분을 향해 약간의 각도로 만들어 져야한다. 날개와 전방의 눈 - 뇌 단지를 피하는 등의 중간을 따라 조심스럽게 잘라냅니다. 조심스럽게 번데기에서 번데기를 제거번데기 표피의 후방 가장자리를 잡고 번데기 경우 (그림 1D)의 당겨 케이스. 집게와 눈 - 뇌 복잡한 표피 전방에있는 작은 구멍을 찌를. 고무 전구 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 histolyzed 지방과 나머지 창자 조직을 제거하기 위해 부분적으로 해부하는 번데기를 통해 PBS 해부 솔루션을 씻는다. 이것은 또한 효과적으로 나중에 유리 피펫의 내부에 달라 붙는 해부 조직의 발생률을 감소 지질과 단백질과 유리 피펫을 윤활. </li><li> 번데기 날개를 얻으려면, 표피 날개를 포위하고 날개 자체는 번데기 (그림 1E)에서 치러야해야합니다. 이 측면에서 쫓아 내기 전에 두 날개 표피의 가장 뒤쪽 끝을 파악하기 위해 다른 forcep을 사용하여 당겨 또는 힌지 근처의 날개 아래 forcep을 조종하면서 하나의 forcep으로 머리에 의해 번데기를 누른 할 수 있습니다 시체 (Figure 1E). 날개는 절단 된 후 또는 신체에서 제거하고 멀리 시체 및 기타 자료의 더미에 넣어 힌지에 찢길 수있다. </li><li> 눈 - 뇌 복잡한 빠질와 번데기 (그림 1F, 1H)에서 무료로 될 때까지 번데기 눈이나 뇌를 얻으려면, 번데기를 씻는다. forcep을 사용하여 부드럽게 두뇌에서 떨어져 번데기의 눈을 끌어와 원하는 조직을 저장합니다. </li><li> 결과가 이상 세포가 동물을 연 후 PBS에 남아 정확도가 떨어질대로, 각각의 샘플을 해부하는 45 분보다 오래 걸릴하지 않습니다. </li></ol> 3. 조직 해리와 DNA 염색법 <ol><li> 윤활 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 5 ML의 폴리스티렌 튜브 (그림 1G)의 라이브 DNA 얼룩 솔루션의 0.5 ML로 해부 조직을 전송합니다. DNA 얼룩 솔루션에 가능한 적은 PBS로 전송 (이하 300 μL), 트립신의 희석으로 조직의 분리를 억제합니다. </li><li> SHAKI와 튜브를 품어NG 23 500 RPM (우리는 에펜 도르프 Thermomixer 사용)에서 ° C. </li><li> 중간 속도 (5 설정)에서 5 초간 부드럽게 그 소용돌이 70 분 알을 품다. 밑에 소용돌이로 교반 세포 대단히 짧은 시간으로 이어질 것입니다 동안 과도한 소용돌이로 교반은 세포 분열 및 양식 파편을 발생합니다. 23 흔들어 샘플을 반환 ° 속도 5시 5 초 동안 한 번을 소용돌이로하기 전에 추가로 15 ~ 20 분 동안 500 rpm에서 C. </li><li> 두뇌와 36hAPF 세 이상 번데기 눈, 수정 프로토콜이 필요합니다. 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브에 45 ~ 60 분 동안 500 rpm에서 23 ° C에서 DNA 얼룩 솔루션의 조직을 떼어 놓다. 그런 다음 하나 하나 수동으로 약 50 ㎕의 DNA 얼룩 솔루션과 신속한 수동으로 그려진 된 파스퇴르 피펫 16 (약 100 ~ 150 μm의 개방)의 위아래로 피펫과 함께 해부 접시에 전달하여 조직의 큰 덩어리를 떼어 놓다. 5 ML 튜브에 DNA 얼룩 솔루션의 0.5 ML의 나머지 부분과 각각의 해리 표본을 전송합니다. 추가로 45 품다23 -30 분 (총 배양 시간 최대 90 분) ° 500 rpm으로 흔들어 C는 수풀까지 더 이상 표시되지 않습니다. </li><li> 주 무 세포 투명 번데기 날개 표피 해리되지 않습니다하지만 완전히 해리 샘플은, 조직의 거의 큰 눈에 보이는 덩어리가 있어야합니다. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 <ol><li> 조율 cytometer에 전원을 켜고 조율 소프트웨어를 엽니 다. cytometer에 레이저는 시작 메뉴를 통해 켜져 있어야하고, 매일 성능 테스트는 데이터 수집의 하루 전에 충분한 점수와 성과 추적 구슬로 수행해야합니다. 유체 수준은 절반 이상 전체 및 성능 테스트 전에 비워 낭비해야한다. 조율의 시작, 적절한 보정 및 작동에 대한 세부 사항은 조율 사용 설명서 (에서 찾을 수 있습니다 <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a> ) </li><li> 새로운 테를 디자인매개 변수가 4.3로 표시와 함께 빈 작업 공간에 4 점 플롯과 2 히스토그램을 작성하여 mplate, 또는 실험에 적합한 이전 디자인 템플릿을 선택하고 수집 할 샘플의 수를 나타냅니다. 우리는 Vybrant DyeCycle 바이올렛 GFP 또는 부록 I.에서 RFP 식 살아있는 초파리 세포주기 분석을위한 조율 템플릿 (. 얻는 형식의 파일)을 제공 한 </li><li> 제공되는 템플릿은 그림 2에 표시된 매개 변수 개의 도트 플롯과 두 개의 막대 그래프 (가) 있습니다. 검출을위한 채널은 다음을 포함한다 : FSC와 SSC - 세포의 크기와 막 복잡성, VL1 높이 (H), 폭 (W)와 면적 (A)를 나타내는 전방 산란 및 측면 산란 - DyeCycle 바이올렛 염색 나타내는 바이올렛 레이저 여기 DNA와 BL1을 -A - GFP 형광을 나타내는 블루 레이저 채널 1 지역. RFP 분석을 위해 제공된 템플릿은 optimi 인 블루 레이저 채널 3 (BL3-A)를 사용한다는 점을 제외하고, GFP 분석을위한 템플릿과 동일합니다RFP 감지에 데이빗. </li><li> 템플릿 도트 플롯 원하는 인구에 대한 분석을 제한하고 분석 (그림 2)에서 파편과 세포 대단히 짧은 시간을 제한하는 문이 있습니다. 문 1 파편과 SSC 대 FSC (그림 2A)에 따라 대단히 짧은 시간을 제외합니다. 문 2 중항 (VL1Area 대 VL1Width) (그림 2B)의 신분에 따라 흠없는 세포, 하위 G1 사멸 세포 및 세포 대단히 짧은 시간을 제외합니다. 문 3 문 1과 2에서 세포를 포괄 파생 문이며, GFP (또는 RFP) 음성 세포 대 VL1Height (그림 2C)에 따라 DNA의 콘텐츠를 식별합니다. 문 4 문 1과 2에서 세포를 포괄 파생 문이며, GFP (또는 RFP) DNA 함량 (그림 2C) 대 양성 세포를 식별합니다. GFP (또는 RFP) 대 앞으로 분산 형 (FSC)로 측정 셀 크기의 도트 플롯 게이트 5와 6 (그림 2D)를 생성하는 데 사용됩니다. Y-AXI에 X 축 및 세포 수에있는 두 개의 히스토그램 플롯 DNA 내용문 3 문 4에 의해 정의 된 인구에 대한의. 원하는 경우 (그림 2E와 2F) 히스토그램도 (미도시) 세포의 크기 포함될 수 있습니다. 셀 크기 히스토그램의 경우, 인구는 X 축과 Y 축의 계수에 FSC를 플로팅 게이트 5와 6으로 설정해야합니다. </li><li> 10,000 GFP 또는 RFP 긍정적 인 이벤트 (이 4 번 게이트, 게이트 1의 파생 게이트, 게이트 2 GFP 또는 RFP 긍정적 게이트있을 것입니다)에 중지 녹화를 설정합니다. 6,000 범위 - 10,000 GFP 긍정적 인 이벤트는 전통적으로 출판 품질 프로파일 9,11의 목표왔다. 우리는 고품질의 프로필을위한 4 이벤트 10 충분한 게이트를 얻기 위해 긍정적 인 약 50 %의 GFP는 15 날개 나 눈의 최소를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 우리는 성공적으로 6 날개 (그림 3A)와 같은 적은에서 예비 세포주기 분석을위한 명확한 데이터를 획득했습니다. 300 μL의 인수 볼륨을 설정,이 총 0.5 ML 시료 460 μL에 대해 사용합니다. 따BLE 2 그림 2의 예를 들어 템플릿에서 제공하는 적절한 임계 값 전압 설정을 보여줍니다. </li><li> 표준 민감도 100 μL / 분을 기록 고감도에서 샘플을 실행합니다. 우리는 서로 다른 감도 수준을 가진 우리의 분석에 차이를 거의 찾을 수 있습니다. 세포의 초점 음향으로 인해,이 cytometer에 정확하게 매우 높은 유속 샘플을 측정 할 수 있습니다. 전통적인 cytometers과는 달리, 우리는 초당 1,500 이벤트에 속도까지 인수함으로써 데이터의 손상을 찾을 수 없습니다. 조율 소프트웨어에 의해 생성 기록 된 데이터 파일은 대부분의 세포주기 모델링 소프트웨어와 호환됩니다. FCS 형식에 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> GFP (또는 RFP)에 대한 세포의 크기와 DNA 내용의 히스토그램은 긍정적이고 부정적인 인구를 비교할 수 있습니다. 그들은 수동으로 복사하고 어도비 포토샵 소프트웨어를 사용하여 붙여 넣는 방법으로 계층화 할 수 있습니다. y 축이 자동으로 설정되어 있으면, Y 축은 시간으로 확장 할 수각 샘플에 대한 ighest 계산합니다. 오토 스케일의 Y 축 세트와 두 개의 그래프를 오버레이는 각 모집단에 대한 세계 최대 설정 축 히스토그램의 오버레이를 만듭니다. 이 (그림 3B의 예) GFP 양성 및 GFP 부정적인 인구의 총 세포 수는 동등하지 않은 경우에도 단계적으로 세포주기의 상대적 변화를 시각적으로 쉽게 비교할 수 있습니다. 또한, 사용자 정의 y 축 (y 축 수동 옵션) 히스토그램에 대한 고정 값으로 설정할 수 있습니다. 이 경우 두 집단에 대한 상대 셀 번호를 비교할 수 있습니다. 조율이 실행 당 샘플의 정의 된 볼륨을 사용하기 때문에, 전체 인구의 비율이 각 게이트의 각 실행에 대한 세포의 절대 정량은, 그림 층의 작업 공간에서 실행 (예 :시 자동으로 생성 된 통계 테이블에서 얻을 수 있습니다 ). 도트 플롯과 히스토그램은 간단히 일에서 다른 샘플을 드래그 앤 드롭으로 조율 소프트웨어에서 계층화 할 수 있습니다비교를 위해 열려있는 샘플의 원하는 그래프 위에 오른쪽에 전자 샘플 파일 메뉴를 선택합니다. 그러나 하나의 샘플 (동일한 샘플에서 음 즉, GFP 긍정적 GFP) 내에서 모집단을 오버레이하기 위해, 우리는 포토샵을 사용합니다. </li><li> 두 가지 방법은 인구 세포주기의 다른 단계에서 상대적 백분율을 찾을 수 있습니다. 근사 방법은 G1, S, G2 및&gt; G2 피크의 경계를 묘사하기 위해 사용자 정의 된 지역에 의존합니다. 이 방법은 사용자 정의 영역 내에서 비율을 빠르고 쉽게 추정 (그림 3E)를 할 수 있습니다. 우리는 티닐-데 옥시 우리 딘 (EDU) 설립을 사용하여 S-상 표지 초파리 캔자스 시티 세포와 직접 테스트에 근거를 둔 우리의 영역을 설정합니다. 두 번째 방법은 세포주기 분포의 추정 타사 모델링 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 그림 3F, 예를 들어 ModFitLT (진실성 소프트웨어 하우스) 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 프로토콜은 세포주기, 상대 셀의 크기 및 상대 셀 수 다양한 발달 단계에서 라이브 초파리 조직에서 분석 할 수 있습니다. 이 분석은 세포 유형의 특정 형광 단백질의 발현 또는 추적 계보와 결합 될 때, 자세한 정보는 신중 세포주기 또는 성장 섭동에 대한 세포 반응에 대해 얻을 수 있습니다. 뇌 세포가 체포 90 % G1에 일반적으로있는 경우 원칙적으로 증거로, 우리는 (3D 그림) 발달 단계에서 비정상적인 DNA 복제로 이어지는 GFP라는 세포 클론에서 G1-S 세포주기 규제를 표현하여 번데기 플라이 두뇌에 정지를 중단 . 그러나이 살아있는 세포주기 분석 방법에 대한 몇 가지 중요한 제한이 있습니다. 첫째, 하나는 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 유사 분열의 다양한 단계에서 세포를 구별 할 수 없습니다. 따라서, 여기에 설명 된 분석 IMM로 보충해야한다그 조직에서 유사 분열 지수를 정량화하는 등 Ser10 인...

유동 세포 계측법은 세포 생존, 상대 셀 크기, DNA의 콘텐츠 및 라이브 세포 인구의 형광 단백질 발현의 측정에 사용하실 수 있습니다. S 상, 세포의 인구의 DNA 함량에 대한 정보 중에 핵 DNA의 복제로 인해 다른 세포주기 단계 1-3에서 상대 비율을 추론 할 수 있습니다. 이 방법은 효모에서 포유 동물 모델 시스템에서 세포주기 분석의 초석이되고있다. 초파리 초파리 세포주기 조절의 생체 내 분석에서 유전을위한 훌륭한 모델 시스템이되었다. 파리에서 사용할 수있는 광범위한 유전 도구는 생체 내 형광 단백질 기반의 혈통에 4-6 추적과 함께 세포주기 규제의 우아한 조직의 특정한 시간적 규제 조작을 허용합니다. 유동 세포 계측법은 endorepl 포함, 초파리 세포 유형의 숫자에 DNA 함량을 연구하는 데 사용되었습니다세포 배양 유사 분열 세포에게 7,8 icating. 생체 세포주기 연구를위한 중요한 사전은 라이브 배체 초파리 상상의 디스크 9,10의 유세포 분석, 많은 실험실에서 사용 적응 된 프로토콜에 대한 프로토콜의 개발, 데 라 크루스와 에드가에 의해 만들어졌다. 유도 형광 단백질 발현과 조직의 특정 라벨을 통해 추적 생체 혈통의 유전자와 결합 된이 기술은 생체 내 9에 하나의 전체 세포의 배가 시간, 셀 크기에 유전자 조작 효과에 대한 정보를 얻기 위해 세포주기 단계의 정확한 타이밍을 확인할 수 있습니다 11. 그러나이 방법은 지금까지 사용자가 흥미로운 훽스트 염색 할 수있는 UV 레이저 cytometers를 흐름을 제한하고 있습니다 살아있는 세포에서 DNA를 염색하고 정량화하는 세포의 사용을 투과 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료에 의존하고있다. 이들은 일반적으로 단지 분류기 (예 : BD FACS Vanta를에서 발견된다GE, BD FACSAria) 또는 고가의 여러 가지 빛깔의 벤치 탑 시스템 (예 : BD LSR), 기관 흐름의 핵심 시설로 일반적으로 필요로하는 지원을 제공합니다. 우리는 Invitrogen의, Vybrant DyeCycle 바이올렛에서 새로운 라이브 세포 DNA의 염료를 사용하는 훽스트 기반의 프로토콜을 수정했습니다. 이 염료는 더 작은 벤치 탑 분석기의 일반 및 작은 독립적 인 벤치 탑 분석기, cytometer에 집중 조율 어쿠스틱에서 사용할 수있는 보라색 405 nm의 레이저와 호환됩니다. 여기에서 우리는 DyeCycle 바이올렛과 조율을 사용하여 개발의 다양한 단계에서 세포 유형, 셀 크기, 셀 번호와 초파리 조직의 다양한 혈통 분석을 결합 할 수있는 세포주기 분석을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 초파리 조직과 같은 분석에 적합 cytometers의 수를 확장하고 살아있는 세포주기 분석이 유형의 추가 조직 유형 및 발달 단계에 맞게 수정 될 수있는 방법의 예제를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>12x75mm 폴리스티렌 원형 바닥 5ml 시험관 </td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td>5ml 튜브</td></tr><tr><td>Attune Acoustic Focusing Cytometer</td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>4445315</td><td>Blue / Violet configuration</td></tr><tr><td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>Free</td><td>PC only</td></tr><tr><td>Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) </td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>4449754</td><td>일일 성능 테스트용</td></tr><tr><td>Dumont #5 Inox 집게 </td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>배아 접시 30 mm x 12mm </td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30</td><td>유리 해부 접시 </td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>022670051</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 솔루션 (10x)</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&#252; bingen 스프링 가위 </td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15003-08</td><td>스트레이트 5mm 커팅 엣지 </td></tr><tr><td>Vybrant DyeCycle 바이올렛 스테인</td><td>라이프 테크놀로지/ 인비트로젠</td><td>V35003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 1. 필요한 시약 및 기기.</td></tr><tr><td colspan="4">Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 9 ml 10X 트립신-EDTA (시그마) 5 &mu; l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (이것은 포유류 세포에 권장되는 농도의 0.25X입니다. 우리는 더 높은 농도가 Drosophila 세포에 독성이 있음을 발견했습니다.) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (이염기성), 20mM KH2PO4 (monobasic) pH로 조정됨 7.2 </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td> </td> <td>FSC</td> <td>SSC</td> <td>BL1</td> <td>VL1</td> </tr> <tr> <td>임계값 (x1000)</td> <td>100</td> <td>10</td> <td>10</td> <td>10</td> </tr> <tr> <td>전압 (mV)</td> <td>2950</td> <td>4250</td> <td>1800</ td> <td>1150</td> </tr> </tbody> </table> 표 2. 그림 2.</p의 분석을 위한 임계값 및 전압 설정></td></tr></tbody></table>

라이브 세포주기 분석<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 vybrant dyecycle 바이올렛 dna 얼룩을 사용하여&gt; 조직

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

유동 세포 계측법은 널리 다른 세포주기 단계에서 상대적 비율을 추론하는 세포의 인구 DNA 함량에 대한 정보를 얻기 위해 사용되었습니다. 이 기술은 성공적으로 생체 내에서 세포주기 조절의 유전 연구의 모델 생물 초파리의 유사 분열 조직으로 확장되었습니다. 셀 타입 특정 형광 단백질 발현과 유전자 조작과 함께 사용할 경우, 하나의 세포 수, 세포의 크기와 생체 내에서 단계적으로 세포주기에 미치는 영향에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나이 살아있는 세포 방법은 UV 레이저가 장착 흐름 cytometers에 사용자를 제한, 세포 투과성 훽스트 33342 DNA-intercalating 염료의 사용에 의존하고있다. 우리는보다 일반적인 보라색 405nm는 레이저와 호환되는 새로운 살아있는 세포 DNA 염료, Vybrant DyeCycle 바이올렛을 사용하려면이 프로토콜을 수정했습니다. 여기에 제시 프로토콜은 세포와 결합 효율적으로 세포주기 분석 할 수 있습니다초파리 조직의 다양한 유형, 상대 셀 크기와 세포 수 정보. 이 프로토콜은 단일 실험실 수준에서 실행 및 관리 할 수있는 작은 벤치 톱 분석기 라이브 초파리 조직에 대한 유용한 세포주기 분석 기술, 조율 어쿠스틱 초점 cytometer에를 확장합니다.

그림 2는 제공된 GFP 템플릿을 사용하여 조직의 후방 절반 GFP를 표현, 유충의 날개 샘플에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 유사한 결과는 같은 조직 유형 및 제공 RFP 템플릿 (그림 3A)를 사용하여 RFP에 대한 발현 패턴을 얻을 수 있습니다. 제공된 템플릿 및 전압 (표 2) 유충의 눈 (그림 3B), 머리와 날개뿐만 아니라, 번데기의 눈, 두뇌 (그림 3D)와 날개의 분석에 적합합니다. 게이트 5와 6의 인구에 대한 FSC 음모를 꾸미고에서 제공하는 상대 셀 크기의 막대 그래프는 (그림 3C)를 생성 할 수 있습니다. 게이츠 인해 다른 조직이나 다른 GFP 또는 RFP의 도입 유전자에 대한 형광 강도의 차이에 대한 셀 크기의 차이로 약간 조정해야 할 수도 있습니다. 샘플의 작은 양을 시험 (50-100 μl를) 실행하는 동안이 기록을 명중하기 전에 수행 할 수 있...

라이브의 세포주기 분석을위한 프로토콜<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에 사용&gt; 조직이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 동시에 혈통 추적 또는 형광 단백질의 조직 별 발현을 통해 상대 셀 크기에 대한 정보, 휴대폰 번호, DNA 함량과 세포 유형을 제공<em&gt; 생체 내</em&gt;.

라이브 세포주기 분석<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 Vybrant DyeCycle 바이올렛 DNA 얼룩을 사용하여&gt; 조직

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

이 절차의 전반적인 목표는 초파리에서 유전적으로 조작되고 GFP 또는 RFP로 표지된 세포 집단이 있는 조직의 상대적인 세포주기 단계와 세포 크기를 측정하는 것입니다. 먼저 유전자 교배를 설정하여 특정 조직 또는 세포 집단에서 원하는 형광 단백질과 원하는 유전자 조작으로 표지된 세포를 포함하는 자손을 생성합니다. 연구 결과, 적절한 발달 단계의 자손에서 원하는 조직을 깨끗하게 분리한 다음 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리하고 생존 가능한 DNA 염료로 염색하여 DNA 함량을 측정합니다.유세포 분석법으로 염색된 해리된 샘플을 분석합니다. 궁극적으로, 생체 내 결과는 연구 중인 유전자 조작으로 인한 세포 크기 및 세포 주기 단계의 변화를 측정합니다. 자외선 염료를 사용하여 살아있는 초파리 조직에 대한 기존 유세포 분석 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 염료 주기 보라색 염료가 적은 예산으로 구매하고 단일 실험실 규모로 유지할 수 있는 보라색 4 0 5 레이저를 포함하는 저렴한 탁상용 세포분석기와 호환된다는 것입니다.이 방법은 전체 조직 크기와 증식 속도를 측정하는 것보다 더 자세한 세포주기 단계 및 세포 크기에 대한 정보를 제공함으로써 세포주기 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Kagel과 Dan Sun, 그리고 Olga Guko입니다. 우리 기술자는 유충 해부를 위해 알을 낳은 후 약 110-120시간에 세 번째 유충 Instar에서 성숙한 유충을 수집합니다.정확한 동공 단계는 변태 초기에 이 수확 흰색 프리 번데기를 위한 변태 중 연구에 필수적입니다 필요한 경우, 나는 번데기의 페트리 접시 또는 유충의 바이알을 섭씨 37도의 수조에서 밀봉하여 열을 활성화합니다. 혈통 추적 클론을 위한 척 플립 베이스. 페트리 접시의 밀봉을 푼 후 인큐베이터에 넣어 동공 해부를 위해 원하는 발달 단계로 숙성시킵니다.번데기가 손상되지 않도록 기포가 있는 동공 케이스의 앞쪽 끝으로 번데기를 부드럽게 잡고 번데기가 손상되지 않도록 내부에 떠 있는 번데기를 적절하게 잡을 수 있도록 놓습니다. 그런 다음 마이크로 가위로 번데기의 뒤쪽 끝을 동물의 등쪽 부분을 향해 약간 각도로 잘라 내부 압력을 해제하고 흉부의 원하는 조직에 hist 지방을 밀어 넣지 않고 머리를 등쪽 중앙을 따라 조심스럽게 자르고 날개와 앞쪽 눈 뇌 복합체가 지방을 제거하기 위해 씻습니다. 그런 다음 집게로 동공 표피의 뒤쪽 가장자리를 잡고 동공 케이스에서 당겨 동공 케이스에서 동공을 제거합니다.해부된 번데기를 깨끗한 해부 접시에 옮깁니다. 집게로 눈의 뇌 복합체 앞쪽에 있는 큐티클에 작은 구멍을 뚫습니다. 고무 전구가 있는 유리 파스티 피펫 사용.부분적으로 절개된 번데기를 통해 PBS 해부 용액을 부드럽게 세척하여 남아 있는 지방과 장 조직을 제거합니다. 동공 날개를 얻으려면 두 번째 집게를 사용하여 한 집게로 번데기의 머리를 잡습니다. 날개 표피의 가장 뒤쪽 끝을 잡고 사체 측면에서 당겨 빼냅니다.그런 다음 경첩에서 날개를 자르거나 당겨 몸에서 제거하고 사체 및 기타 물질에서 멀리 떨어진 더미에 넣어 동공, 눈 또는 뇌를 얻습니다. 눈의 뇌 복합체가 제거되고 번데기에서 자유로워질 때까지 번데기를 씻으십시오. 집게를 사용하여 동공의 눈을 뇌에서 부드럽게 당겨 원하는 조직을 저장합니다.윤활된 과거 피펫을 사용하여 절개된 조직을 조심스럽게 옮깁니다.섭씨 23도에서 500RPM으로 70분 동안 흔들면서 튜브를 배양합니다. 그런 다음 중간 속도로 5초 동안 부드럽게 소용돌이치고 추가로 15-20분 동안 샘플을 셰이커에 다시 넣습니다. Vortex는 뇌와 동공의 눈을 중간 속도로 5초 동안 다시 샘플링합니다.36시간 이상 지났습니다. PF는 섭씨 23도, 500RPM에서 45-60분 동안 DNA 염색 용액의 조직을 해리합니다. 그런 다음 약 50마이크로리터의 DNA 염색 용액과 함께 해부 접시로 옮겨 큰 조직 덩어리를 하나씩 수동으로 해리합니다.약 100-150 마이크로미터 개구부의 피펫을 수동으로 당겨 위아래로 빠르게 피펫팅합니다. 해리된 표본을 5ml 튜브에 모읍니다. 섭씨 23도에서 500RPM으로 흔들면서 30분 더 배양합니다.샘플이 완전히 분리되었는지 육안으로 확인합니다. 무세포 투명 동공 날개 큐티클은 연결되지 않는다는 점에 유의하십시오. 검체를 세포분석기에 로드하여 팩스 분석을 시작합니다.그런 다음 전방 산란(forward scatter)과 측면 산란(side scatter)을 검출할 채널을 선택하여 세포 크기와 막의 복잡성을 나타냅니다. DNA의 D cycle violet staining을 검출하려면 violet laser excitation에서 VL 하나의 높이, 너비 및 면적을 측정해야 합니다. 또한 GFP 형광을 측정하기 위해 파란색 레이저 채널 한 영역을 선택합니다.RFP 분석을 위해 청색 레이저 채널 3을 사용합니다. attune의 이 채널은 RFP 탐지에 최적화되어 있습니다. 게이트를 설정하여 분석을 선택한 모집단으로 제한하고, 게이트 1로 정지 플롯을 생성하는 분석에서 파편 및 덩어리를 판매하고, VL 1 면적 대 VL 1 플롯에서 SSC 대 FSC 플롯에서 파편 및 덩어리를 제외하고, GA 2를 사용하여 염색되지 않은 세포, sub G one, apoptotic 세포 및 세포 덩어리를 제외합니다.GA 3은 VE L 1 높이를 기준으로 형광 대 DNA 함량 플롯에서 GFP 음성인 게이트 1과 2 내의 세포를 포함합니다. 다음으로, 4번 보행은 DNA 함량 대비 형광 그래프에서 GFP 양성인 게이트 1과 2 내의 세포를 포함합니다. 또한 GFP 대 전방 산란으로 측정된 세포 크기의 점도표에서 게이트 5와 6을 생성할 수 있습니다.세포주기 위상을 검사하려면 게이트 3 및 게이트 4로 정의된 집단에 대해 x축의 DNA 함량과 Y ais의 세포 수를 표시하는 두 개의 히스토그램을 사용합니다. 셀 크기의 경우, 히스토그램은 모집단을 게이트 5와 6으로 설정하고 x축에 FSC를 플롯하고 샘플을 실행할 때 Y축에 카운트를 설정하여 기록이 10, 000에서 중지되도록 설정합니다. GFP 포지티브 이벤트는 또한 300마이크로리터의 획득 부피를 설정합니다.적절한 임계값 및 전압 설정은 제공된 템플릿에 포함되어 있습니다. 표준 또는 고감도 분당 100마이크로리터로 샘플을 실행하고 기록합니다. Attune 소프트웨어에 의해 생성된 기록된 데이터 파일은 대부분의 세포주기 모델링 소프트웨어와 호환되는 FCS 형식입니다.4개의 점도표와 2개의 히스토그램을 포함하는 이 대표적인 작업 공간은 Grailed gal four transgene에 의해 구동되는 뒤쪽 날개에서 GFP와 Cyclin D를 발현하는 유충 날개 샘플을 보여줍니다. 보행이 1인 세포 크기의 첫 번째 점도표는 파편과 덩어리를 제외합니다. 두 번째 점도표는 걸음걸이가 2인 싱글릿을 구별하여 염색되지 않은 세포, G 1D NA 이하 함량 및 응집체를 GFP 대 DNA 함량 플롯에서 제외합니다.GFP 음성 및 양성 세포는 구별될 수 있고 2개의 N 및 4개의 NDNA 내용은 x-축에 따라서 위치에 근거를 두어 분명합니다. GFP 대 전방 산란으로 측정된 이 세포 크기 플롯은 게이트 5와 6을 생성하는 데 사용됩니다. 결과 분석은 GFP 또는 RFP 음성 모집단과 GFP 또는 RFP 양성 세포에 대한 계수 대 DNA 함량의 히스토그램으로 이어집니다.제공된 RFP 템플릿을 사용합니다. 동일한 조직 유형 및 발현 패턴으로 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. RFP의 경우 제공된 템플릿과 전압은 유충의 눈, 뇌 및 날개뿐만 아니라 동공의 눈, 뇌 및 날개를 분석하는 데 적합합니다.튜닝된 소프트웨어에서. 세포 주기 또는 세포 크기 히스토그램에 대한 자동 크기 조정 기능을 사용하면 각 집단에 대한 전역 최대값을 결정할 수 있습니다. 이러한 세포주기 프로파일은 유충 눈에서 GFP 양성 및 음성 세포를 나타내며 후방에서 GFP를 발현합니다.오버레이는 GMR GAL 4개의 U-A-S-G-F-P 전이유전자를 사용하여 후방 GFP 발현 세포의 세포주기 위상 차이를 보여줍니다. GFP 양성 세포와 음성 세포 사이의 세포 크기의 상대적 변화도 표시할 수 있습니다. 이 세포주기 프로파일은 46시간 A PF에서 동공 뇌에서 파생되었습니다. GFP 양성 세포는 G one S 조절자, cyclin D 및 E two F를 발현하는 계통 추적 클론으로, 정지를 방해하고 S-상 진입으로 이어집니다.이것은 이 단계에서 일반적으로 정지되는 비발현 GFP 음성 세포와 대조됩니다. G one에서 attune 소프트웨어는 히스토그램에서 G one s 및 G two 위상을 설명하는 사용자 정의 영역을 생성합니다. 각 실행에 대한 통계 테이블은 사용자 정의 영역 및 백분율 내에 있는 셀의 절대 개수를 결정합니다.또는 mod fit과 같은 모델링 소프트웨어를 사용하여 각 단계의 백분율과 세포사멸 세포를 추정할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포주기 분석을 위해 초파리에서 여러 조직을 분리하고 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

live-cell-cycle-analysis-drosophila-tissues-using-attune-acoustic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어...

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

세포 분열은 형광성 으로 태그된 단백질 및 시간 경과 현미경 검사법을 사용하여 실시간으로 구상될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 사용자는 세포 분열 타이밍 역학, 유사분열 스핀들 어셈블리 및 염색체 의회 및 분리를 분석할 수 있습니다. RNA 간섭 (RNAi)-매개 유전자 녹다운 다음 이 사건에 있는 결점은 평가되고 정량화될 수 있습니다.

세포 분열의 살아있는 화상 진찰을 위한 초파리 S2 세포의 사용

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU) 및 인산히스톤 H3(pH3) 라벨링을 함유한 세포 주기 분석은 광범위한 최적화를 요구할 수 있는 다단계 절차이다. 여기서는 상이한 세포 주기 단계에서 세포를 구별하기 위해 이미지 분석 및 정량화를 포함한 이 절차에 대한 모든 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Drosophila 신경 줄기 세포에서 세포 주기 진행 분석을 위한 5-에티닐-2'-Deoxyuridine/인성-히스톤 H3 이중 라벨링 프로토콜

배우세요 Drosophila 조직의 라이브 세포주기 분석 방법을. 유전자 조작된 세포 집단의 DNA 함량과 세포 크기를 측정하여 발달 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

라이브 세포주기 분석

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